Introduction
Cellebaserede analyser giver et vigtigt redskab til udvikling og opdagelse af nye lægemidler mod kræft. 1,2 Historisk har enkeltlagskulturer af cancerceller været ansat til at undersøge effekten af kandidatforbindelser mod bestemte typer af cancerceller. Den lette vedligeholdelse af monolagskulturer i standard dyrkningsplader, kompatibiliteten af standard plader med kommercielle robot værktøjer til tilsætning af reagenser, og med screening udstyr til downstream analyse af cellulære reaktioner på kemiske forbindelser er de store fordele, der gør 2D kulturer et attraktivt værktøj for test af lægemidler. 3 Desværre monolag celleassays ofte undlader at forudsige effekten af forbindelser in vivo, hvilket gør lægemiddeludvikling og opdagelse en yderst bekostelig proces. 4,5 Trods betydelige investeringer og indsats af farmaceutiske virksomheder og akademiske enheder, kun ~ 1% af anti-cancer lægemidler i kliniske forsøg blev godkendtaf FDA i løbet af de seneste to årtier. 6 forskellen mellem 2D kulturer og komplekse 3D-miljø af cancerceller in vivo er en væsentlig mangel ved monolagskultur systemer. 7 derfor screening af kandidatforbindelser mod tumorceller i en indstilling, der mere ligner 3D tumor miljø kan fremskynde udvikling af nye kemoterapi narkotika. 8
Kræftcelle sfæroider fremlægge et relevant 3D tumor-model in vitro. 9,10 Sfæroider er kompakte klynger, der danner gennem spontan eller induceret samling af kræftceller på ikke-klæbende overflader eller i suspension ved anvendelse af teknikker såsom spinnerkolbe, flydende overlay, mikrofabrikerede mikro- . godt arrays, mikrofluidik og hængende dråber 11-16 Sfæroider efterligne centrale elementer i solide tumorer, herunder geometri og begrænset transport af ilt, næringsstoffer og lægemiddelforbindelser i den centrale zone; Derfor har de i højere grad regenerere narkotika ResponSE for solide tumorer sammenlignet med monolagskulturer. 17-19 På trods af denne markante fordele, der spheroids ikke rutinemæssigt anvendes til screening af kemiske forbindelser mod kræftceller. Vanskeligheder med at producere ensartet størrelse spheroids i en standard high throughput indstilling, der er kompatibelt med kommercielt tilgængelige robotteknologi og screening / billeddiagnostiske værktøjer hæmmer inkorporering af klumpformet kultur i lægemiddeludvikling pipeline. Selvom brugerdefinerede materialer og plader nylig blevet kommercielt tilgængelige at imødekomme dette behov, omkostningsmæssige overvejelser afskrække deres udbredte anvendelse.
To store med evne til at producere konsistente mellemstore spheroids i high throughput bruge en ny hængende dråbe platform og mikrofabrikerede mikro-brønde. 13,16,20 dog kræver særlige plader og enheder, der er dyre at fremstille og ubelejligt for endpoint brugere begge fremgangsmåder i centrale forskningscentre og farmaceutiske industri, hvor de fleste større efforter til opdagelsen af nye lægemidler mod kræft er lavet. Trods visse forbedringer i stabiliteten af celle-holdige dråber med en nylig design af hængende drop plader, er det kun hver anden hul i pladen stadig anvendes under dyrkning for at undgå spredning / sammenlægning af dråber. 16. Dette formindsker eksperimentelle gennemløb betydeligt. Narkotikamisbrug og fornyelse er svært med manuel eller robot pipettering og spheroids skal overføres til en standard plade til biokemisk analyse, fordi denne plade konfiguration er ikke umiddelbart kompatible med konventionelt screening udstyr såsom plade læsere. 21 Micro-brønde fremstillet ved hjælp af bløde litografi også tillade kontrolleret størrelse klumpformet produktion. 13,20 Men uforenelighed denne platform med standard pipettering værktøjer forhindrer behandling af individuelle spheroids med forskellige lægemiddelforbindelser / koncentrationer, udsætter alle spheroids til en enkelt behandling tilstand. Således er denne fremgangsmåde ikke egnet til højthroughput forbindelse screening, der kræver samtidig test af flere forbindelser / koncentrationer.
For at overvinde disse forhindringer, har en ny teknik til high throughput produktion af konsekvent mellemstore kræft celle spheroids i standard plader med 96 brønde blevet udviklet. 22,23 Den tilgang er baseret på en polymer vandig tofasesystem (ATPS) med polyethylenglycol ( PEG) og dextran (DEX) som fase-dannende polymerer. 24 ATPSs er for nylig blevet anvendt i en række af hidtil ukendte cellebiologiske applikationer for at muliggøre celle micropatterning og lokal afgivelse af biologiske reagenser til celler i stærkt vandige medier. 25-32 at danne en sfæroide er cancerceller blandet med den vandige DEX fase og en sub-mikroliter dråbe af den resulterende suspension pipetteres ned i en brønd indeholdende nedsænkning vandig PEG fase opløsning. Faldet er fortsat ikke blandbare fra fordybelse fase og begrænser celler til at lette dannelsen af en sfæroide. Importantly den yderst vandige nedsænkning fase tilfører næringsstoffer til celler i sfæroid og minimerer velkendt problem medier fordampning fælles for nogle andre assays, som forårsager ændringer i medier osmolalitet og svingninger i stofkoncentrationer. Denne teknik muliggør sfæroid produktion og lægemiddelbehandling kun ved anvendelse af kommercielt tilgængelige reagenser og pipettering værktøjer i standard 96-brønds plader. Vigtigt er analyse af cellulære reaktioner sfæroider udføres i den samme plade ved anvendelse af standard biokemiske assays og pladelæsere. Den lette at arbejde med ATPS og tilpasningsevne tilgangen til robot væskehåndtering gør high throughput generation af både mono-kultur og co-kultur sfæroiderne en enkel laboratorieteknik. Denne nye fremgangsmåde vil være et stort skridt fremad mod integration af kræft celle spheroids i lægemiddeludvikling og Discovery processer med forbedret test gennemløb og omkostningseffektivitet (stigende antal testede forbindelser og Reduced reagensforbrug) og effektivitet (reduktion hands-on tid).
En detaljeret protokol for robot produktion af cancercellelinier sfæroider i 96-brønds plader ved anvendelse af ATPS fremgangsmåde er beskrevet nedenfor. Desuden er detaljerne i lægemiddelbehandling af resulterende sfæroider og nedstrøms analyse af cellulære responser under anvendelse af en kommerciel biokemisk assay fremlagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Fremstilling af polymere Vandig tofasesystem (ATPS)
- 0,5 g polyethylenglycol (PEG) (MW: 35.000) afvejes og føje det til 9,5 ml komplet vækstmedium i en steril 15 ml konisk til fremstilling af 10 ml 5% (w / v) vandig PEG fase.
Bemærk: Tilføjelse halvdelen af mediet til koniske først efterfulgt af tilsætning af polymeren og derefter den resterende mængde medium minimerer adhæsion af polymeren til de koniske vægge og hjælper polymer opløses hurtigere. - 0,128 g dextran (DEX) (MW: 500.000) afvejes og føje det til 0,872 ml komplet vækstmedium i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør at forberede 1 ml 12,8% (w / v) vandig DEX fase.
- Vortex begge opløsninger i ca. 1 min for at opløse polymererne i mediet.
- Hold begge opløsninger i et vandbad ved 37 ° C i 1 time for at sikre opløsning og homogene blandinger. Hold hætterne over vandoverfladen for at undgå muligheden for forurening af løsninger fra badetvand.
- Læg PEG fase opløsning i en steril, plastsprøjte og passere det gennem en sprøjte filter på 0,2 um porestørrelse for at fjerne urenheder.
Bemærk: Fyld sprøjten med PEG-opløsningen, anbringes i indsatsen af filteret på toppen af en konisk rør og ved hjælp af kraft, langsomt skubbe opløsningen gennem filteret. Det er normalt, at modstanden mod bevægelse af sprøjtestemplet. Mindre tab af polymeropløsningen forekommer som en del af opløsningen forbliver i filteret, men polymerkoncentrationen vil ikke ændre sig. - Afpipetteres 10 pi af DEX fase og fortyndes det i 10 pi medium i et separat rør til at resultere i 6,4% (w / v) DEX faseopløsning. Aspirer 100 pi af PEG faseopløsning og dispensere det i en petriskål.
- Dispenser 0,5 pi af 6,4% (w / v) DEX faseopløsning i PEG faseopløsning. Bekræft visuelt vellykket ATPS dannelse ved at observere en DEX dråbe under et mikroskop. Faldet grænsebør forblive synlige, hvilket indikerer tilstedeværelsen af to stabile, separate vandige faser.
- Opbevar bestanden vandige PEG og DEX fase løsninger i 4 ° C indtil brug.
Bemærk: Det anbefales, at polymeropløsninger fremstilles frisk før hvert forsøg og anvendes inden for 24 timer af oplagring.
2. Forberedelse til udskrivning cancercelletyper Sfæroider
- Grow kræftceller af interesse (f.eks brystkræft MDA-MB-157 celler) til en 90% -100% sammenflydende monolag. For MDA-MB-157 celler, bruge et medium bestående af DMEM indeholdende 10% FBS, 1% glutamin og 1% antibiotika.
- Harvest celler under anvendelse af en celle dissociation buffer (ifølge producentens protokol) og indlæse suspensionen i et 15 ml konisk. Centrifugeres den i 5 minutter ved 173,3 xg fjerne supernatanten og resuspender cellerne i 1 ml komplet vækstmedium.
- Load celler på et hæmocytometer og tælle dem at beregne det nødvendige antalaf celler til en ønsket sfæroid celledensitet. Et sammenflydende monolag af MDA-MB-157 celler dyrket i en T75 kolbe normalt giver ~ 7 x 10 6 celler.
Bemærk:. Nødvendig celledensitet for en dråbe volumen at frembringe en enkelt sfæroid vil afhænge af celletypen 22 For eksempel, en densitet på 1,5 x 10 4 eller større for MDA-MB-157 celler anbefales per 0,3 pi DEX faseudfaldet til sikre dannelse af en enkelt klumpformet. - Centrifuger cellerne for anden gang i 5 minutter ved 173,3 xg og resuspender dem i en passende volumen af vækstmedium for at suspensionen koncentreres til en ønsket celledensitet.
Bemærk: For eksempel hvis 7 x 10 6 cancerceller blev høstet, den samlede mængde af cellesuspension kræves for at danne en klumpformet på 1,5 x 10 4 celletæthed i en 0,3 pi DEX fase drop vil være 140 pi. Men på grund af fortynding med DEX faseopløsning i det næste trin, bruger kun 70 pi cellekulturmedium for at resuspendere cellerne. - Blandes grundigt cellesuspensionen for at sikre ensartet fordeling af celler og blanding af DEX opløsning. Pipettere op og ned bør gøres forsigtigt for at forhindre bobledannelse.
3. Forberedelse til udskrivning af Co-dyrkede Sfæroider
- Grow cancerceller (f.eks MDA-MB-157 humane brystcancerceller) og bæreceller (f.eks humane fibroblaster) til en 90% -100% konfluent monolag. Harvest hver celletype under anvendelse af en celle dissociation buffer (ifølge producentens protokol).
- Læg hver suspension i et 15 ml konisk, centrifugeres dem i 5 minutter ved 173,3 xg og aspireres supernatanten fra hver konisk. Resuspender celler af hver konisk i 1 ml komplet gVÆKST medium.
Bemærk: Der kan anvendes Fluorescerende farvestoffer, såsom Calcein AM (levende cellefarvende) og nukleare farvestoffer (Hoechst) at skelne mellem de to celletyper.
- Læg hver suspension i et 15 ml konisk, centrifugeres dem i 5 minutter ved 173,3 xg og aspireres supernatanten fra hver konisk. Resuspender celler af hver konisk i 1 ml komplet gVÆKST medium.
- Læg hver celletype separat på et hæmocytometer og tælle dem at beregne det nødvendige antal af hver celletype til et ønsket forhold af cancerceller til at støtte celler i co-dyrkede sfæroider. Sammenflydende monolag af MDA-MB-157 celler og fibroblaster dyrket i T75 kolber normalt giver ~ 7 x 10 6 og ~ 6 x 10 6 celler.
- Tilføj den korrekte mængde fra suspensionen støtte celler til cancerceller suspension til opnåelse af et ønsket forhold mellem antallet af to celletyper. For eksempel anvender et forhold på 50 cancerceller til 1 fibroblast celle.
- Centrifuger koniske indeholdende blandet cellesuspension i 5 minutter ved 173,3 xg og resuspender cellerne i et passende volumen til at resultere i den endelige densitet bestående af lige store volumener af vækstmedium og 12,8% (w / v) vandig DEXfaseopløsning (udarbejdet i 1.2).
- Pipettere forsigtigt den resulterende cellesuspension op og ned for at sikre ensartethed af suspensionen.
4. Trykning af Tumor Sfæroider i en 96-brønds plade
- En dag forud for eksperimenter overtrække ikke-behandlede, rundbundede 96-brønds plader med 1% (w / v) Pluronic ved 37 ° C i 24 timer. Denne belægning forhindrer cellebinding i dyrkningsperioden.
- Dispenser 50 pi af den filtrerede 5% (w / v) vandig PEG fase i hver brønd af en 96-brønds plade (destination plade).
- Ved hjælp af en pipette, mix cellesuspensionen (fremstillet i trin 2 eller trin 3 for mono- og co-kultur, henholdsvis) og tilsættes 20 pi af suspensionen til hver anden godt fra en søjle i en plade med 384 brønde (kilde plade) .
- Tænd væskehåndteringsudstyret og "hjem" den pipettering hovedet at registrere koordinater. Så kompilere en tidligere defineret protokol (nedenfor 4,6) for at sikre labware og parametre er defineret korrektly. Denne "homing" trin kan være forskellige for forskellige flydende handlere.
Bemærk: Strømmen af protokollen, viste trin-for-trin nedenfor i 4.6, vil være de samme, uanset hvilken robot væskehåndteringsudstyr anvendt; dog kan programming interface se anderledes på grund af brugen af forskellige software. - Placer kildepladen, bestemmelsessted plade og pipette tip kasser på definerede positioner på arbejdsstationen af væskehåndteringsudstyret som vist i figur 1.
- Udfør den protokol, der omfatter følgende trin:
- Læg en kolonne af tønder fra pipettering leder af flydende handleren med at blande pipettespidser (8 tips) fra arbejdsstationen (figur 1).
- Bland cellesuspensionen i brønde af kilden pladen (figur 1). Vælg en blanding mindre volumen end cellesuspension volumen i brønde for at undgå bobledannelse.
- Skub tips i en tom lossepladser boks (Figur 1). Læg en kolonne af tønder fra pipettering hoved med 10 pi udlevering pipettespidser (figur 1).
- Aspirer 0,3 pi af cellesuspensionen fra kilden pladen (figur 1) i hver pipettespids.
- Dispenser cellesuspensionen i brønde i en kolonne på destinationen pladen (figur 1). Brug en afgivelseshastighed højde på 0,5 mm og en afgivelseshastighed strømningshastighed på mindre end 1 ul / sek.
- Gentag trin 4.6.1 gennem 4.6.6 indtil kolonnen-by-kolonne udskrivning til hele destination pladen er færdig.
- Fjern forsigtigt destination plade fra arbejdsstationen overflade og placere den i et fugtigt inkubator ved 37 ° C og 5% CO2. Bevar pladen vandret når du bærer den ind i kuvøsen for at undgå forstyrrelser af DEX fase dråber indeholdende celler.
- Inkubér pladen i 24 timer for at tillade aggregering af celler i en sfæroid i DEX fase dråbe.
Bemærk, at den følgende protokol er en 4-dages lægemiddelbehandling og omfatter en forlængelse med frisk stof efter dag 2. Det kan modificeres til andre behandlingsperioder.
- Visuelt bekræfte sfæroid dannelse i 96-brønds plader efter 24 timer. Hvis det er nødvendigt, billed brønde til måling af størrelsen af sfæroider som gennemsnittet de mindste og største diameter af hver klumpformet.
- Forbered stamopløsningen af en ønsket lægemiddel ved at opløse det i et opløsningsmiddel anbefalet af producenten ved en forudbestemt opløselighed koncentration. For eksempel opløses cisplatin i vand ved 2 mg / ml.
Bemærk: Beskyt stamopløsningen af lægemidlet fra lys, hvis lægemidlet er lysfølsomt. - Brug af seriel fortynding teknik forberede fortyndede medikamentkoncentrationer med cellekulturmedium fra stamopløsning fremstillet i det foregående trin. Hver fortynding skal foretages to gange den ønskede koncentration. Dilution forhold vil variere afhængigt af udgangsforbindelsen stamkoncentration og ønskede arbejdsposition koncentrationer.
- Der tilsættes 50 pi lægemiddelopløsning fremstillet i det foregående trin til hver brønd. Dette kan gøres robot eller ved manuel pipettering.
Bemærk: Hver lægemiddelkoncentration vil blive fortyndet i halvdelen til den ønskede koncentration af 50 pi vandige PEG fase allerede i hver brønd.- Brug sfæroider fra to kolonner i en plade med 96 brønde (n = 16) for hver koncentration.
- I kontrolbrønde, tilføje kun 50 pi frisk dyrkningsmedium til de eksisterende 50 pi af den vandige PEG fase.
- Inkuber sfæroider med lægemidlet i 48 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, beskyttet mod lys.
- Efter 48 timers inkubation forberede friske fortyndinger af lægemidlet ved ønskede koncentrationer og forny lægemiddel ved tilsætning af 50 pi af frisk medikament opløsning til hver brønd.
Bemærk: Brøndene indeholder allerede den ønskede koncentration lægemiddel fra det første lægemiddel tEHANDLING. Derfor i denne fornyelse fase, er hver koncentration fremstilles i den ønskede koncentration, da ingen fortynding vil forekomme. - Inkuber sfæroider med lægemidlet for en anden 48 timer ved 37 ° C og 5% CO 2, beskyttet mod lys.
6. Analyse af cellulær levedygtighed i Sfæroider
- Efter 48 timers inkubation med fornyet lægemiddel (dvs. den samlede tid til behandling af sfæroider med et lægemiddel er 4 dage), måle det samlede volumen af medium i en brønd ved manuel pipettering.
Bemærk: Typisk volumen i en brønd er ~ 140 pi (et lille fald opstår på grund af fordampning). - Beregn mængden af cellelevedygtighed reagens (f.eks PrestoBlue) 10% koncentration af den totale brøndvolumen. Tilføj denne mængde af cellelevedygtighed reagens til hver brønd.
Bemærk: Med en eksisterende medier volumen på 140 pi i en brønd, er et volumen på 15,6 pl kræves for at give en koncentration på 10% af den samlede godt. Dette beregnes veddividere eksisterende medier volumen med 9 (140 pi / 9 = 15,6 pi). - Inkubér pladen med cellelevedygtigheden reagens tilsat til hver brønd i 6 timer ved 37 ° C, beskyttet mod lys.
- Pladen anbringes i en mikro-pladelæser og læse fluorescenssignalet ved 560 nm og 590 nm Ekscitations- og emissionsbølgelængderne hhv.
- Beregn procent levedygtigheden af celler i sfæroider ved at normalisere det fluorescerende signal fra behandlede brønde til at kontrol- brønde efter gennemsnittet af værdierne fra den samme behandling betingelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Arbejdsstationen af robot væskehåndteringsudstyr er vist i figur 1. Den pipettering hoved og alle stationer, der anvendes i robot trykning af sfæroider i afsnit 4.6 er mærket. Billedet viser anvendelsen af to forskellige stationer for tip kasser (et sæt tips til blanding og det andet sæt til opsugning / dispensering cellesuspension-vandig DEX fase blanding). Hele setup ligger i en standard biologisk sikkerhedsskab at opretholde sterilitet. Figur 2 viser en skematisk afbildning af "trykning" proces med den vandige tofasesystem. En pipettespids fyldt med cellesuspensionen i den vandige DEX fase (blå, mønsterdannelse fase) sænkes ned i en rundbundet brønd i en 96-brønds plade indeholdende den vandige PEG fase (pink, nedsænkning fase) til at dispensere indholdet tæt på brøndbunden. Den resulterende DEX fase drop begrænser kræftcellerne fra forstøvning og tilskynder celle-celle-interaktioner, der resulterer iaggregation af celler og sfæroide formation. Sfæroid dannelse er spontan og sker inden 24 timer af inkubation, som vist i den eksperimentelle billede af figur 2. I praksis er dette sfæroid trykning udført kolonne-for-kolonne i 96-brønds plader. Efter sfæroider form er dyrkningsmedium forlænget ved direkte tilsætning af frisk medium, omdannelse af tofasesystemet til en enkelt vandig fase. Denne overgang skyldes reduktion af koncentrationer af PEG og DEX under en tærskelværdi koncentration, der kræves til separation af vandige PEG og DEX faser.
Udlevering af en konventionel luft forskydning pipettering mekanisme væskehåndteringsudstyret blev parametrisk optimeret, og det blev konstateret, at en afgivelseshastighed højde på 0,5 mm, en afgivelseshastighed strømningshastighed på mindre end 1 ul / sek efterfulgt af afgivelse af 0,2 pi præ-aspireret luftmængde producerer den mest konsekvente størrelse vandig DEX dråber, og dermed sfæroider. 23 Figur 3a disspiller fordelingen af diameter 96 sfæroider fra en plade med en gennemsnitlig diameter på 332 ± 31 um. Tidligere erfaringer viser, at denne fremgangsmåde typisk genererer sfæroider med 8% -10% standardafvigelse omkring gennemsnittet diameter. Figur 3B viser frekvensfordelingen af diameter af sfæroider af samme plade som i figur 3A, der viser, at diametre normalt fordelt.
Dernæst blev potentialet i denne fremgangsmåde for forbindelse screening i standard 96-brønds plader og analyse af cellulære responser i de samme plader, uden et behov for at overføre sfæroider til nye plader demonstreret. Figur 4 viser en dosisafhængig undersøgelse af levedygtigheden af MDA -MB-157 brystcancercellelinjer sfæroider blev behandlet med en klinisk kemoterapeutisk lægemiddel, cisplatin. Drug-behandlede og kontrol spheroids blev inkuberet med et kommercielt PrestoBlue reagens (celle levedygtighed reagens). Enzymatisk aktive celler reducerede reagent og resulterede i en ændring i medierne farve og et skift i fluorescerende signal. Skiftet i signalet var størst med levende celler (fx i kontrol kugler). Levedygtighed kræftceller i spheroids faldt med stigende koncentration lægemiddel over 1 pm. Denne test resulterede i en dødelig dosis koncentration af LD50 = 4.67 uM stof 50%.
Denne vandige tofasesystem teknologi til 3D kultur muliggør enkel produktion af mere realistiske tumormodeller ved at inkludere andre bestanddele af cellulære mikromiljøer såsom støtte stromaceller. Det er blevet vist tidligere, at herunder stromaceller i 3D kulturer modulerer vækst, proliferation og invasion af kræftceller. 33-35 Som en eksperiment, co-kultur sphæroider blev genereret ved at kombinere MDA-MB-157 human bryst proof-of-concept cancerceller og humane fibroblaster i et forhold på 50:. 1 36 Forud for forsøg blev MDA-MB-157 og fibroblastceller farvesmed et nukleart farvestof (blå) og levende celler farvestof (grøn), henholdsvis at muliggøre detektion af celler i fluorescerende billeder. Figur 5a viser fluorescerende og fase billeder af co-kultur sfæroider med en tæthed på 1,5 x 10 4 celler og en 50 :. 1 ratioen af cancerceller og fibroblaster Figur 5b viser kontrol sfæroider af MDA-MB-157 celler til sammenligning. Denne fremgangsmåde vil gøre det muligt at vurdere virkningen af stromale celler på forskellige fænotyper af cancerceller.
Figur 1. Væskehåndtering Platform. Den flydende handling består af stationer, hvor blanding tips, udlevering tips, tips box affald kilde plade, og destination plade steder er placeret. Placeringen af hver station er defineret i protokollen. Mixing tips lastes på en kolonne af pipettering hoved og anvendes til at blande opløsningen af vandig DEX fase holdige celler i kilden plade. Disse tips bortskaffes derefter af i boksen lossepladser og dispensering tips indsættes på samme kolonne i pipettering hovedet. Disse tips aspirere 0,3 pi af den vandige DEX fase indeholdende celler fra kilden pladen og dispensere det i destination plade til dannelse af celle-indeholdende dråber af DEX fase i nedsænkning PEG fase allerede i destination brønde. Endelig disse tips bortskaffes også af i boksen lossepladser til at fuldføre en cyklus af udskrivning.
Figur 2. Sfæroide formation. Væskehåndteringsudstyret dispenserer 0,3 pi af den vandige DEX fase (blå) indeholdende celler (grøn) i en brønd indeholdende vandig PEG-opløsning (lyserød). Dette resulterer i dannelsen af en sfæroid efter 24 timers inkubation som vist i billedet til højre. Scale bar 200 pm.TPS: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Sfæroide Konsistens data. (A) Fordeling af diameter sfæroider målt fra en 96-brønds plade, hvert punkt repræsenterer en sfæroide. (B) Frequency distribution af diametre viser normalfordeling af dataene.
Figur 4. lægemiddelrespons af Sfæroider. Levedygtighed af celler i MDA-MB-157 brystkræft celle spheroids reducerer med stigning i koncentrationen af cisplatin over 1 nM-200 uM rækkevidde. Den stiplede linje er en S-formet fit levedygtighed data.
Figur 5. Co-kultur Sfæroider (a) Fluorescerende (til venstre) og fase-kontrast (højre) billeder af sfæroider af MDA-MB-157 brystkræft celler (blå) co-dyrket med fibroblaster (grøn) til en 50:. 1 ratio. (B) Sfæroider af MDA-MB-157 celler er vist til sammenligning. Scale bar 100 um. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sfæroider fremlægge en realistisk model for bedre at forstå tumor fysiologi og medicin effekt og give et nyttigt værktøj for anti-cancer drug discovery. Sådanne ansøgninger vil få stor gavn af simple klumpformet generation og vedligeholdelse teknikker, som kun kræver standard laboratorieudstyr, håndtering af flydende værktøjer og screening udstyr. Anvendelsen af en vandig tofasesystem spontant samlede cancerceller i drop fase muliggør effektiv produktion og vedligeholdelse af sfæroider med robot væskehåndteringsudstyr, og in situ lægemiddelbehandling og endpoint analyse af cellulære responser med kommercielle reagenser og værktøjer. Således er denne teknologi er en stor fordel i forhold til eksisterende tilgange 3D kræft cellekulturer og præsenterer en screening platform at fremskynde lægemiddelforskning.
Generering ensartet størrelse sfæroider i en mikro-brønds plade er afgørende for high throughput screening applikationer for at sikre en tilsvarende baseline cellulær activitet på alle sfæroider. Anvendelse af flydende handling med en luft forskydning pipettering mekanisme, er det vigtigt at optimere dispenseringsprocessen gennem kvantificering af virkningen af centrale flydende håndtering parametre (dispensere højde, dispensere strømningshastighed, og præ-aspireret luftmængde) på dispensering af den vandige DEX fase . Denne optimering tillader pipettering hovedet at feje den viskose DEX faseopløsning og cancerceller i brønde og producere homogene sfæroider. Selvom specifikke mængder for disse tre parametre er blevet bestemt i protokollen for SRT Bravo flydende handler, bør en lignende fremgangsmåde anvendes med andre flydende handlere til at bestemme optimale dispensering forhold, der resulterer i ensartet DEX fase dråbestørrelse dispenseret i fordybelse PEG fase. Desuden er det muligt at anvende 96 tips og samtidig udskrive sfæroider i alle 96 brønde. Dette er dog signifikant forøger antallet af celler, der kræves for at fylde kildepladen medvandige DEX fase indeholdende celler. Uanset valg af column-wise eller hele trykplade fremgangsmåder, er det afgørende at blande indholdet af kilden plade før aspiration trin. Dette sikrer, at den tætte cellesuspension i DEX fase er homogen og reducerer variationer i størrelsen af sfæroider.
Flere undersøgelser viser, at kræft celle spheroids efterligne flere vigtige egenskaber af avaskulære tumorer, såsom morfologi og diffusionsbegrænsninger af reagenser; dermed præsentere de en fysiologisk relevant model til evaluering af effekten af nye og konventionelle forbindelser mod kræftceller i forhold til traditionelle monolag cellekulturer. 8,17,18,21,23,37 Det er vist, at den vandige tofasesystem tilgang til at producere sfæroider bekvemt tillader lægemiddelscreening i den samme plade, blot ved tilsætning og fornyelse af en lægemiddelforbindelse ved ønskede tidspunkter og automatiseret screening af cellelevedygtighed under anvendelse af en standard mikropladelæser. Detteer en stor fordel i forhold til teknikker såsom hængende dråber, som ville kræve overførsel sfæroider til en standard plade til analyse af cellulære responser over for lægemidler. 21. Desuden er det kendt, at støtte celler i tumormikromiljøet og deres interaktioner med cancerceller er impliceret i forskellige maligne fænotyper af kræftceller. 33-35,38,39 derfor evnen til at generere co-kultur sfæroider af kræft og stromale celler ved anvendelse af vandige to-fase teknologi vil hjælpe med at vurdere indflydelsen af støtte celler af tumormikromiljøet på svar af cancer celler til forskellige behandlinger. Den co-kultur eksperiment udført i denne undersøgelse tjener som en proof-of-concept, som denne teknologi med held kan generere kugler indeholder kræftceller og stromale celler. Fremtidige undersøgelser vil udnytte denne mulighed og undersøge differentierede egenskaber af mono- og co-dyrkede sphæroider såsom spredning og narkotika reaktioner. Desuden er denneteknologi tilbyder en platform til mere nøje efterligner in vivo tumor mikromiljø ved at inkludere andre stromale komponenter i tumormodel. 40
Sammenfattende denne protokol muliggør spontan dannelse af sfæroider i 96-brønds plader uden brug af ydre kræfter. Tilpasning af teknik til en robot væskehåndteringsudstyr øger hastigheden og effektiviteten af klumpformet produktion i en standard high throughput format. Foreneligheden af teknologien med kommerciel billedbehandling og analyse analyserer platforme muliggør brug af forskellige instrumenter i akademiske og industrielle laboratorier. For fremtidige applikationer vil denne protokol strømline lægemiddelscreening med 3D kræft cellekulturer en rutinemæssig teknik. Desuden kan denne fremgangsmåde let modificeres til dannelse af sfæroider af forskellige størrelser, forskellige celletyper, forskellige kombinationer af kræft og stromale celler i co-kultur sfæroider og skaleres op til større gennemløb mikro-brøndsplader to yderligere fremskynde kræftlægemidler screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
- Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. Systems biology in drug discovery. Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).
- Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines. Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).
- Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. Cell microarrays in drug discovery. Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).
- Gidrol, X., et al. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).
- LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery. Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).
- Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK. BMJ Open. 3, (2013).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
- Hirschhaeuser, F., et al. Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again. J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).
- Ghajar, C. M., Bissell, M. J. Tumor engineering: the other face of tissue engineering. Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).
- Kenny, P. A., et al. The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression. Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).
- Carlsson, J., Yuhas, J. M. Liquid-overlay culture of cellular spheroids. Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).
- Wartenberg, M., et al. Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells. FASEB J. 15, 995-1005 (2001).
- Tekin, H., et al. Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates. Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).
- Patra, B., et al. A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis. Biomicrofluidics. 7, 54114 (2013).
- Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis. Nat. Commun. 5, 4250 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates. Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).
- Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy. J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).
- Mueller-Klieser, W. Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications. Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).
- Minchinton, A., Tannock, I. F. Drug penetration in solid tumors. Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).
- Jeong, G. S., et al. Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies. Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).
- Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids. JALA. 19, 208-214 (2014).
- Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids. Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).
- Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture. Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).
- Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. Phase diagrams. Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).
- Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Frampton, J. P., et al. Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA. Sci. Rep. 4, 4878 (2014).
- Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions. Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).
- Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system. Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).
- Tavana, H., et al. Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells. Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).
- Tavana, H., et al. Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies. Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches. Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).
- Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate. Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).
- Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).
- Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts. BMC Cancer. 10, 444 (2010).
- Ozdemir, B. C., et al. Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival. Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).
- Hsiao, A. Y., et al. Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids. Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).
- Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach. Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).
- Weigelt, B., Bissell, M. J. Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer. Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).
- Mueller, M. M., Fusenig, N. E. Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer. Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).
- Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).
