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Bioengineering

Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52754

Introduction

Essais cellulaires fournissent un outil important pour le développement et la découverte de nouveaux médicaments anti-cancer. 1,2 Historiquement, cultures monocouches de cellules cancéreuses ont été utilisées pour étudier l'efficacité de composés candidats contre certains types de cellules cancéreuses. La facilité d'entretien des cultures monocouches dans des plaques de culture standard, la compatibilité des plaques standard avec des outils robotiques commerciaux pour l'ajout de réactifs, et avec un équipement de dépistage pour l'analyse en aval de réponses cellulaires à des composés chimiques sont les principaux avantages qui rendent les cultures 2D un outil intéressant pour le dépistage des drogues. 3 Malheureusement, les dosages cellulaires monocouche omettent souvent de prédire l'efficacité des composés in vivo, ce qui rend le développement de médicaments et la découverte d'un processus extrêmement coûteux. 4,5 Malgré des investissements considérables et des efforts par les compagnies pharmaceutiques et les unités académiques, seulement ~ 1% des médicaments anticancéreux dans les essais cliniques ont été approuvéspar la FDA au cours des deux dernières décennies. 6 disparité entre les cultures 2D et l'environnement 3D complexe de cellules cancéreuses in vivo est une lacune majeure des systèmes de culture en monocouche. 7 conséquent, le dépistage de composés candidats contre les cellules tumorales dans un cadre qui ressemble plus étroitement l'environnement tumoral 3D peut accélérer le développement de nouveaux médicaments de chimiothérapie. 8

sphéroïdes de cellules cancéreuses présentent un modèle de tumeur 3D pertinent in vitro. 9,10 sphéroïdes sont des amas compacts qui forment par assemblage spontanée ou induite des cellules cancéreuses sur des surfaces non adhérentes ou en suspension en utilisant des techniques telles que la fiole centrifuge, revêtement liquide, micro- microfabriqué . et tableaux, la microfluidique, et des gouttes suspendues 11-16 Sphéroïdes imitent principales caractéristiques de tumeurs solides, y compris la géométrie et le transport limité d'oxygène, des nutriments et composés de médicaments dans la zone centrale; par conséquent, ils se régénèrent plus étroitement drogues responsoi de tumeurs solides par rapport aux cultures en monocouche. 17-19 Malgré cet avantage marqué, sphéroïdes sont pas couramment utilisés pour le criblage de composés chimiques contre les cellules cancéreuses. Difficulté de produire des sphéroïdes de taille uniforme dans un cadre à haut débit standard qui est compatible avec la robotique disponibles dans le commerce et les outils de dépistage / d'imagerie empêche l'incorporation de la culture sphéroïde en pipeline de développement de médicaments. Bien que les matériaux et les plaques personnalisées sont récemment devenus disponibles dans le commerce pour répondre à ce besoin, les considérations de coût dissuader leur utilisation généralisée.

Deux principales techniques avec la capacité de produire sphéroïdes taille cohérentes dans haut débit utiliser une nouvelle plate-forme de goutte suspendue et les micro-puits microfabriqués. 13,16,20 Cependant, les deux approches nécessitent plaques et dispositifs qui sont coûteux à fabriquer et peu pratique pour les utilisateurs finaux spéciales dans les centres de recherche de base et les industries pharmaceutiques où le plus grand efforts pour la découverte de nouveaux médicaments anticancéreux sont faites. En dépit des améliorations dans la stabilité des gouttes contenant des cellules avec une conception récente d'accrochage des plaques de chute, que tous les deux trous de la plaque est encore utilisé pendant la culture pour éviter la propagation / fusion des gouttes. 16 Cela diminue considérablement le débit expérimentale. plus de drogues et le renouvellement est difficile avec manuel ou pipetage robotique et sphéroïdes doivent être transférés dans une plaque standard pour l'analyse biochimique car cette configuration de la plaque ne est pas facilement compatible avec les équipements de dépistage classique tel que des lecteurs de plaques. 21 micro-puits fabriqués en utilisant la lithographie douce aussi permettre taille contrôlée production sphéroïde. 13,20 Toutefois, l'incompatibilité de cette plate-forme avec des outils standards de pipetage empêche le traitement de sphéroïdes individuels avec différents composés médicamenteux / concentrations, ce qui expose toutes les sphéroïdes à une condition de traitement unique. Ainsi, cette méthode ne est pas appropriée pour une grandecriblage de composés débit qui nécessite des tests simultanée de plusieurs composés / concentrations.

Pour surmonter ces obstacles, une nouvelle technique pour la production à haut débit de taille constante sphéroïdes de cellules cancéreuses dans des plaques à 96 puits standard a été développé. 22,23 L'approche est basée sur un système aqueux à deux phases polymère (ATPS) avec du polyéthylène glycol ( PEG) et le dextrane (Dex) que des polymères de formation de phases. 24 ATPSs ont été récemment utilisés dans une variété d'applications biologiques roman cellulaires pour permettre micromodelage cellulaire et localisée livraison de réactifs biologiques à des cellules dans des milieux fortement aqueux. 25-32 Pour former une sphéroïde, les cellules cancéreuses sont mélangés avec la phase aqueuse et de DEX une baisse sous-microlitre de la suspension résultante est introduit à la pipette dans une solution aqueuse de PEG phase de l'immersion de puits contenant. La chute reste non miscible à partir de la phase d'immersion et confine les cellules pour faciliter la formation d'un sphéroïde. Lutinortantly, la phase d'immersion hautement aqueuse fournit des nutriments aux cellules de la sphéroïde et minimise le problème bien connu de l'évaporation de support commun à d'autres dosages qui provoque des changements dans l'osmolalité de médias et de fluctuations de concentrations de médicament. Cette technique permet la production sphéroïde et un traitement médicamenteux seulement en utilisant des réactifs disponibles dans le commerce et les outils de pipetage dans des plaques à 96 puits standard. Fait important, l'analyse des réponses cellulaires des sphéroïdes est réalisée de la même plaque en utilisant des essais biochimiques standards et lecteurs de plaques. La facilité de travailler avec l'ATPS et l'adaptabilité de l'approche de la manipulation de liquides robotique rend génération à haut débit à la fois mono-culture et de co-culture Sphéroïdes une technique de laboratoire simple. Cette nouvelle approche sera un grand pas en avant vers l'intégration de sphéroïdes de cellules cancéreuses dans les processus de développement de médicaments et de découverte avec un débit amélioré de test et de rapport coût-efficacité (nombre de composés testés et Redu croissanteced consommation de réactifs) et l'efficacité (réduction de temps sur les mains).

Un protocole détaillé pour la production de sphéroïdes robotique de cellules cancéreuses dans des plaques à 96 puits en utilisant l'approche décrite ci-dessous est ATPS. En outre, les détails de traitement de la toxicomanie de sphéroïdes et l'analyse en aval de réponses cellulaires en utilisant un dosage biochimique commerciale résultantes sont présentées.

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Protocol

1. Préparation du polymère aqueuse système à deux phases (ATPS)

  1. Peser 0,5 g de polyethylene glycol (PEG) (poids moléculaire: 35 000) et l'ajouter à 9,5 ml de milieu de croissance complet dans une conique de 15 ml stérile pour préparer 10 ml de 5% (p / v) de PEG phase aqueuse.
    Remarque: l'ajout de la moitié de la moyenne de la première conique suivie par l'addition du polymère et ensuite la quantité restante de médium minimise l'adhérence du polymère aux parois coniques et permet le polymère se dissout rapidement.
  2. Peser 0,128 g de dextrane (DEX) (PM: 500 000) et l'ajouter à 0,872 ml de milieu de croissance complet dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml stérile pour préparer 1 ml de 12,8% (p / v) de la phase aqueuse de DEX.
  3. Vortex deux solutions pendant environ 1 min pour dissoudre les polymères dans le milieu.
  4. Garder les deux solutions dans un bain d'eau à 37 ° C pendant 1 heure pour assurer la dissolution et des mélanges homogènes. Garder les bouchons au-dessus du niveau d'eau afin d'éviter toute possibilité de contamination des solutions de baineau.
  5. Charger la solution à phase PEG dans une seringue en matière plastique stérile et le faire passer à travers un filtre à seringue de 0,2 um de taille de pores pour éliminer les impuretés.
    Remarque: Remplir la seringue avec la solution de PEG, le placer dans l'insert du filtre sur le dessus d'un tube conique et en utilisant la force, pousser lentement la solution à travers le filtre. Il est normal de ressentir une résistance contre le mouvement du piston de la seringue. Perte mineure de la solution de polymère a lieu en tant que partie de la solution reste dans le filtre, mais la concentration en polymère ne changera pas.
  6. Introduire à la pipette 10 ul de la solution en phase DEX et diluer dans 10 ul de milieu dans un tube séparé pour conduire à 6,4% (p / v) d'une solution de phase de DEX. Aspirer 100 ul de la solution à phase PEG et le distribuer dans une boîte de Pétri.
    1. Distribuer 0,5 ul de la 6,4% (p / v) de solution en phase DEX dans la solution à phase PEG. Confirmer visuellement la formation réussie ATPS en observant une baisse de DEX sous un microscope. La limite de chutedevrait rester visible, indiquant la présence de deux phases aqueuses séparées, stables.
  7. Stocker le stock aqueuse PEG et des solutions de phase de DEX dans le 4 ° C jusqu'à utilisation.
    Remarque: Il est recommandé que les solutions polymères sont fraîchement préparés avant chaque expérience et utilisés dans les 24 heures de stockage.

2. Préparation pour l'impression de cancer Sphéroïdes cellulaires

  1. Cultiver les cellules cancéreuses d'intérêt (par exemple, les cellules MDA-MB-157 cancer du sein) à un 90% à 100% de confluence monocouche. Pour MDA-MB-157 cellules, en utilisant un milieu constitué de DMEM contenant 10% de FBS, 1% de glutamine et 1% d'antibiotique.
    1. Récolte des cellules en utilisant un tampon de dissociation cellulaire (selon le protocole du fabricant) et charger la suspension dans une 15 ml conique. Centrifuger pendant 5 min à 173,3 XG, retirez surnageant et remettre les cellules dans 1 ml de milieu de croissance complet.
  2. cellules de charge sur un hémocytomètre et compter pour calculer le nombre requisdes cellules pour une densité souhaitée sphéroïde cellulaire. Une monocouche confluente de cellules MDA-MB-157 cellules cultivées dans un flacon T75 donne habituellement ~ 7 x 10 6 cellules.
    Remarque:. Densité de cellules requises pour un volume de goutte afin de générer un seul sphéroïde dépendra du type de cellule 22, par exemple, une densité de 1,5 x 10 4 ou plus pour MDA-MB-157 cellules est recommandé par 0,3 ul phase de DEX goutte à assurer la formation d'un seul sphéroïde.
  3. Centrifuger les cellules pendant une seconde fois pendant 5 min à 173,3 xg et les remettre en suspension dans un volume approprié de milieu de croissance pour concentrer la suspension à une densité cellulaire souhaitée.
    Remarque: Si, par exemple 7 x 10 6 cellules cancéreuses ont été récoltées, le volume total de suspension de cellules requis pour former un sphéroïde densité de 1,5 x 10 4 cellules dans une phase de baisse DEX 0,3 pi 140 pi sera. Cependant, en raison de la dilution avec la solution de phase de DEX à l'étape suivante, ne utiliser que 70 ul de milieu de culture cellulaire pour remettre en suspension les cellules.
  4. 4 cellules sphéroïde densité, 70 ul de la solution de phase DEX est ajouté à 70 ul de suspension cellulaire.
  5. Bien mélanger la suspension de cellules pour assurer une distribution uniforme de cellules et mélange de la solution DEX. Pipetage de haut en bas doivent être effectuées doucement pour éviter la formation de bulles.

3. Préparation pour l'impression des Sphéroïdes Co-culture

  1. Cultiver les cellules cancéreuses (par exemple, MDA-MB-157 cellules de cancer du sein humain) et des cellules de soutien (par exemple, des fibroblastes humains) à 90% -100% de confluence monocouche. Récolter chaque type cellulaire en utilisant un tampon de dissociation cellulaire (selon le protocole du fabricant).
    1. Charger chaque suspension dans 15 ml d'une conique, les centrifuger pendant 5 min à 173,3 xg, et aspirer le surnageant de chaque conique. Resuspendre les cellules de chaque conique dans 1 ml de g completroissance moyenne.
      Remarque: Les colorants fluorescents tels que la calcéine AM (Teinture de cellules vivantes) et colorants nucléaires (Hoechst) peuvent être utilisés pour distinguer les deux types de cellules.
  2. Charger chaque type de cellule séparément sur un hémocytomètre et les compter pour calculer le nombre requis de chaque type de cellule pour un rapport désiré de cellules cancéreuses à des cellules de soutien dans sphéroïdes co-cultivées. Des monocouches confluentes de cellules MDA-MB-157 et les cellules de fibroblastes cultivés dans des flacons T75 donnent généralement ~ 7 x 10 ~ 6 et 6 x 10 6 cellules, respectivement.
  3. Ajouter le volume approprié de la suspension de cellules de soutien pour les cellules cancéreuses suspension pour obtenir un rapport désiré entre le nombre de deux types de cellules. Par exemple, utiliser un ratio de 50 cellules cancéreuses à une cellule de fibroblastes.
  4. Centrifugeuse de la conique contenant la suspension de cellules mélangé pendant 5 min à 173,3 cellules XG et remettre en suspension dans un volume approprié au résultat de la densité finale comprenant des volumes égaux de milieu de croissance et 12,8% (p / v) DEX aqueusesolution de phase (préparé en 1.2).
  5. Pipette doucement la suspension de cellules résultant de haut en bas pour assurer l'homogénéité de la suspension.

4. Impression de Sphéroïdes tumorales dans une plaque de 96 puits

  1. Un jour avant les expériences, manteaux, plaques non traitées à fond rond de 96 puits avec 1% (p / v) Pluronic à 37 ° C pendant 24 heures. Ce revêtement empêche la fixation des cellules sur la période de culture.
  2. Distribuer 50 pi de la filtrée 5% (p / v) la phase aqueuse PEG dans chaque puits d'une plaque de 96 puits (plaque de destination).
  3. En utilisant une pipette, mélanger la suspension de cellules (préparé dans l'étape 2 ou 3 pour la mono- et la co-culture, respectivement) et ajouter 20 ul de la suspension à chaque autre et d'une colonne d'une plaque à 384 puits (plaque de source) .
  4. Allumez le manipulateur de liquides et de la «maison» la tête de pipetage pour enregistrer les coordonnées. Puis compilez un protocole défini précédemment (ci-dessous en 4.6) pour assurer le matériel de laboratoire et les paramètres sont définis correcteLy. Cette étape "homing" peut être différente pour différents manipulateurs de liquide.
    Note: Le flux du protocole, montre étape par étape ci-dessous dans 4,6, sera semblable quel que soit le manipulateur de liquides robotique utilisé; Toutefois, l'interface de programmation peut être différent en raison de l'utilisation de différents logiciels.
  5. Placer la plaque de source, la plaque de destination, et des boîtes de pointes de pipettes à des positions définies sur le poste de travail du manipulateur de liquide comme représenté sur la Figure 1.
  6. Exécuter le protocole qui comprend les étapes suivantes:
    1. Charger une colonne de barils de la tête de pipetage du manipulateur de liquide avec le mélange des embouts de pipette (8) Conseils du poste de travail (Figure 1).
    2. Mélanger la suspension de cellules dans des puits de la plaque de source (figure 1). Sélectionnez un volume de mélange inférieur au volume de suspension de cellules dans des puits pour éviter la formation de bulles.
    3. Ejecter conseils dans un des conseils de déchets case vide (Figure 1). Charger une colonne de barils de la tête de pipetage avec 10 pi de distribution des embouts de pipette (Figure 1).
    4. Aspirer 0,3 ul de la suspension de cellules à partir de la plaque de source (figure 1) dans chaque embout de pipette.
    5. Verser la suspension de cellules dans des puits d'une colonne de la plaque de destination (figure 1). Utiliser une hauteur de distribution de 0,5 mm et un débit de distribution de dimension inférieure à 1 pi / s.
    6. Répéter les étapes 4.6.1 4.6.6 à travers jusqu'à ce que l'impression colonne par colonne dans la plaque de destination ne est pas terminée.
  7. Retirez délicatement la plaque de destination à partir de la surface du poste de travail et le placer dans un incubateur humide à 37 ° C et 5% de CO 2. Maintenir la plaque horizontale lorsque vous le transportez dans l'incubateur pour éviter de perturber de gouttes de phase DEX contenant des cellules.
  8. Incuber la plaque pendant 24 heures pour permettre l'agrégation de cellules dans un sphéroïde à l'intérieur de la phase de chute de DEX.
<p class = "jove_title"> 5. Traitement de la toxicomanie de Sphéroïdes de Cancer Cell

Notez que le protocole suivant est pour un traitement de la toxicomanie de 4 jours et comprend un renouvellement à la drogue douce après jour 2. Il peut être modifié pour d'autres périodes de traitement.

  1. Confirmer visuellement la formation sphéroïde dans des plaques à 96 puits après 24 h. Si nécessaire, image puits pour la mesure de la taille de sphéroïdes faisant la moyenne des diamètres plus petits et les plus grands de chaque sphéroïde.
  2. Préparer la solution mère d'un médicament souhaité par dissolution dans un solvant recommandé par le fabricant à une concentration de solubilité prédéterminée. Par exemple, le cisplatine dissoudre dans l'eau à 2 mg / ml.
    Remarque: Protéger la solution mère de la drogue de la lumière si le médicament est sensible à la lumière.
  3. En utilisant la technique de dilution en série, les concentrations de médicament préparer diluées avec du milieu de culture de cellules à partir de la solution mère préparée dans l'étape précédente. Chaque dilution devrait être deux fois la concentration désirée. Dilratios de ution varient en fonction de la concentration de matière de départ souhaitée et la concentration de travail.
  4. Ajouter 50 ul de solution de médicament préparé à l'étape précédente dans chaque puits. Ceci peut être effectué par robot ou par pipetage manuel.
    Remarque: chaque concentration de médicament sera diluée de moitié à la concentration désirée par la phase aqueuse 50 pi de PEG déjà dans chaque puits.
    1. Utilisation des sphéroïdes de deux colonnes d'une plaque à 96 puits (n = 16) pour chaque concentration.
    2. Dans les puits témoins, ajouter à 50 pl de milieu de culture frais pour les 50 ul existantes de la phase aqueuse de PEG.
  5. Incuber sphéroïdes avec le médicament pendant 48 heures à 37 ° C et 5% de CO2, à l'abri de la lumière.
  6. Après 48 h d'incubation, préparer des dilutions fraîches du médicament à des concentrations désirées et renouveler médicament par addition de 50 ul d'une solution fraîche de médicament à chaque puits.
    Remarque: Les puits contiennent déjà la concentration de médicament souhaité à partir du premier médicament traitement. Par conséquent, dans cette phase de renouvellement, chaque concentration est préparée à la concentration désirée puisque aucune dilution se produira.
  7. Incuber sphéroïdes avec un autre médicament pour 48 heures à 37 ° C et 5% de CO2, à l'abri de la lumière.

6. Analyse de viabilité cellulaire dans Sphéroïdes

  1. Après 48 h d'incubation avec le médicament renouvelé (temps total de traitement de sphéroïdes avec un médicament est de 4 jours), mesurer le volume total de milieu dans un puits par pipetage manuel.
    Remarque: le volume typique dans un puits est d'environ 140 pi (une petite diminution est due à l'évaporation).
  2. Calculer le volume de réactif de la viabilité des cellules (par exemple, PrestoBlue) en tant que concentration du volume total du puits est 10%. Ajouter ce volume de réactif de la viabilité des cellules dans chaque puits.
    Remarque: Avec un volume de médias existants de 140 ul dans un puits, un volume de 15,6 pi est nécessaire pour obtenir une concentration du total de 10% ainsi. Il est calculé endivisant le volume de médias existants par neuf (140 pl / 9 = 15,6 pi).
  3. Incuber la plaque avec le réactif de viabilité cellulaire à chaque puits pendant 6 heures à 37 ° C, à l'abri de la lumière.
  4. Placer la plaque dans un lecteur micro-plaque et lire le signal de fluorescence à 560 nm et 590 nm excitation et d'émission des longueurs d'onde, respectivement.
  5. Calculer la viabilité des cellules pour cent en sphéroïdes en normalisant le signal fluorescent provenant de puits traités à celle des puits de contrôle après la moyenne des valeurs des mêmes conditions de traitement.

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Representative Results

Le poste de travail du manipulateur robotisé liquide est représenté sur la Figure 1. La tête de pipetage et toutes les stations d'impression utilisés dans la robotique de sphéroïdes à l'article 4.6 sont marqués. L'image montre l'utilisation de deux stations différentes pour les boîtes de pointe (une série de conseils pour le mélange et le deuxième ensemble pour aspirer / distribution du mélange en phase DEX suspension aqueuse cellulaire). L'ensemble du montage est logé dans une armoire standard de sécurité biologique pour maintenir la stérilité. La figure 2 illustre un schéma du processus "d'impression" avec le système à deux phases aqueuse. Une pointe de pipette chargé avec la suspension de cellules dans la phase de DEX aqueuse (bleu, la phase de motifs) est descendu dans un puits à fond rond d'une plaque à 96 puits contenant la phase de PEG aqueuse (rose, phase d'immersion) pour distribuer son contenu à proximité le fond du puits. La chute résultante de phase DEX limite les cellules cancéreuses de se disperser et encourage les interactions cellule-cellule qui se traduisent paragrégation des cellules et la formation de sphéroïde. Formation sphéroïde est spontanée et arrive dans les 24 heures d'incubation, comme indiqué dans l'image expérimental de la figure 2. Dans la pratique, cette impression de sphéroïde est effectuée colonne par colonne dans des plaques à 96 puits. Après sphéroïdes forment, milieu de culture est renouvelé par addition directe de milieu frais, convertir le système à deux phases à une phase aqueuse unique. Cette transition est due à la réduction des concentrations de PEG et DEX-dessous d'une concentration seuil requise pour la séparation des phases aqueuses et PEG DEX.

De distribution à partir d'un mécanisme de déplacement d'air de pipetage classique du manipulateur de liquide a été paramétrique optimisée et il a été constaté que la hauteur de distribution de 0,5 mm, une vitesse d'écoulement de distribution de dimension inférieure à 1 pi / s, suivi par de distribution 0,2 ul de volume d'air pré-aspiration produit la taille la plus cohérente de DEX aqueuse tombe et sphéroïdes. donc dis 3a 23 Figurejoue la distribution de diamètre de 96 sphéroïdes d'une plaque avec un diamètre moyen de 332 ± 31 um. L'expérience montre que cette approche génère généralement sphéroïdes avec 8% -10% erreur-type autour du diamètre moyen. Figure 3b montre la distribution de fréquence d'un diamètre de sphéroïdes de la même plaque que la figure 3a, ce qui démontre que les diamètres sont distribuées normalement.

Ensuite, le potentiel de cette approche pour le criblage de composés dans des plaques et l'analyse des réponses cellulaires dans les plaques à 96 puits standards, sans qu'il soit nécessaire de transférer des sphéroïdes à de nouvelles plaques a été démontrée. La figure 4 montre une étude dose-dépendante de la viabilité de MDA -MB-157 mammaires sphéroïdes de cellules cancéreuses traitées avec un médicament chimiothérapeutique clinique, le cisplatine. sphéroïdes traités avec le médicament et de contrôle ont été incubés avec un réactif de PrestoBlue commercial (cellule de réactif de viabilité). Cellules à activité enzymatique réduit le reagent et a abouti à un changement de la couleur du support et un changement dans le signal fluorescent. Le changement de signal était plus grande avec des cellules vivantes (par exemple, dans les sphéroïdes de contrôle). La viabilité des cellules cancéreuses dans des sphéroïdes a diminué avec l'augmentation de la concentration du médicament au-dessus de 1 uM. Ce test a donné lieu à une dose létale concentration de médicament de 50% de la DL50 = 4,67 uM.

Cette technologie de système aqueux à deux phases pour la culture 3D permet une production simple de modèles de tumeurs plus réalistes en incluant d'autres composants de micro-environnements cellulaires telles que les cellules stromales de support. Il a été montré précédemment que les cellules stromales, y compris dans les cultures 3D modulent la croissance, la prolifération et l'invasion des cellules cancéreuses. 33-35 comme une preuve de concept sphéroïdes expérience, de co-culture ont été générés en combinant MDA-MB-157 maternel les cellules cancéreuses et les fibroblastes humains dans un rapport de 50: 1. 36 Avant les expériences, les cellules MDA-MB-157 et ont été colorés fibroblastesavec un colorant nucléaire (bleu) et le colorant des cellules vivantes (vert), respectivement, pour permettre la détection de cellules dans les images fluorescentes. La figure 5a montre des images fluorescentes et de phase de sphéroïdes de co-culture avec une densité de 1,5 x 10 4 cellules et une 50 :. une proportion de cellules cancéreuses et les fibroblastes figure 5b montre sphéroïdes de commande des cellules MDA-MB-157 cellules pour la comparaison. Cette approche permettra d'évaluer l'effet de cellules stromales de différents phénotypes de cellules cancéreuses.

Figure 1
Figure 1. Liquid Plate-forme de manutention. Le manipulateur de liquide se compose de stations où le mélange des conseils, des astuces, des déchets de distribution conseils case, plaque source, et les emplacements des plaques de destination sont placés. La localisation de chaque station est défini dans le protocole. Embouts mélangeurs sont chargés sur une colonne de la tête de pipetage et utilisés pour mélanger la solution de la phase aqueuse de DEX contenant des cellules dans la plaque de la source. Ces conseils sont ensuite jetés dans la boîte de décharges et les pointes de distribution sont insérés sur la même colonne de la tête de pipetage. Ces conseils aspirer 0,3 ul de la phase de DEX aqueuse contenant des cellules de la plaque de source et le distribuer dans la plaque de destination pour former des gouttes contenant des cellules de la phase de DEX à l'intérieur de la phase d'immersion de PEG déjà dans les puits de la plaque de destination. Enfin, ces conseils sont également éliminés dans la boîte de décharges pour effectuer un cycle de l'impression.

Figure 2
Figure 2. Formation Spheroid. Le manipulateur de liquides distribue 0,3 pi de la phase aqueuse de DEX (bleu) contenant des cellules (vert) dans un puits contenant la solution aqueuse de PEG (rose). Il en résulte la formation d'un sphéroïde après 24 h d'incubation, comme illustré dans l'image à droite. Barre d'échelle de 200 um.tps: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "target =" _ blank "> Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 3
Figure 3. Spheroid la cohérence des données. (A) Distribution d'un diamètre de sphéroïdes mesurées à partir d'une plaque de 96 puits, chaque point représente une sphéroïde. (B) la distribution de fréquence des diamètres montre distribution normale des données.

Figure 4
Figure 4. Réponse de médicaments de sphéroïdes. La viabilité des cellules MDA-MB-157 sphéroïdes de cellules de cancer du sein diminue avec l'augmentation de la concentration de 1 nM sur la cisplatine-gamme de 200 uM. La ligne en pointillés est un ajustement sigmoïde aux données de viabilité.

Figure 5
Figure 5. Co-Culture Sphéroïdes (a) fluorescent (à gauche) et à contraste de phase (à droite) des images de sphéroïdes de MDA-MB-157 du cancer du sein cellules (bleu) co-cultivées avec des fibroblastes (vert) à 50: 1. rapport. (B) Sphéroïdes de MDA-MB-157 cellules sont présentés à titre comparatif. Barre d'échelle de 100 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

Sphéroïdes présentent un modèle réaliste de mieux comprendre la physiologie de la tumeur et l'efficacité des médicaments et de fournir un outil utile pour anticancéreux découverte de médicaments. Ces applications bénéficieraient grandement de techniques simples de génération de sphéroïde et d'entretien qui ne nécessitent que du matériel de laboratoire standard, des outils de manipulation de liquides et de criblage. L'utilisation d'un système à deux phases aqueuse cellules cancéreuses spontanément total dans la phase de dépôt permet une production efficace et le maintien de sphéroïdes avec manipulateurs de liquide robotisé, et situ traitement de la toxicomanie et l'analyse de point de terminaison de réponses cellulaires avec des réactifs et des outils commerciales. Ainsi, cette technologie est un avantage majeur par rapport aux approches existantes des cultures 3D de cellules cancéreuses et présente une plateforme de criblage afin d'accélérer la découverte de médicaments.

Génération de sphéroïdes de taille uniforme à l'intérieur d'une plaque de micro-puits est crucial pour des applications de criblage à haut débit afin d'assurer un courant alternatif de référence cellulaire similaireniveau tivité dans tous les sphéroïdes. L'utilisation de gestionnaires liquides avec un mécanisme de déplacement de l'air de pipetage, il est important d'optimiser le processus de distribution à travers la quantification de l'effet des paramètres clés de manipulation liquide (passer hauteur, dispenser débit et le volume d'air de pré-atmosphérique) sur la distribution de la phase de DEX aqueuse . Cette optimisation permet à la tête de pipetage pour balayer la solution en phase DEX visqueux et les cellules cancéreuses dans des puits et de produire des sphéroïdes homogènes. Bien que les quantités spécifiques pour ces trois paramètres ont été déterminés dans le protocole pour le manipulateur de liquides SRT Bravo, une approche similaire devrait être utilisé avec d'autres manipulateurs de liquide pour déterminer les conditions de distribution optimales qui se traduisent par la taille des gouttes de phase de DEX cohérente distribuée dans la phase d'immersion de PEG. En outre, il est possible d'utiliser 96 des conseils et pour imprimer simultanément dans tous les sphéroïdes 96 puits. Cela augmente toutefois sensiblement le nombre de cellules requis pour remplir la plaque de source avec lecellules en phase contenant DEX aqueuses. Quelle que soit la sélection d'approches de colonne à goutte ou ensemble de plaque d'impression, il est crucial de mélanger le contenu de la plaque de la source avant l'étape d'aspiration. Ceci assure que la suspension de cellules dans la phase dense de DEX est homogène et réduit les variations de la taille des sphéroïdes.

Plusieurs études montrent que des sphéroïdes de cellules cancéreuses imitent plusieurs propriétés clés des tumeurs avasculaires tels que la morphologie et les limitations de diffusion des réactifs; par conséquent, ils présentent un modèle physiologiquement pertinent pour évaluer l'efficacité de nouveaux composés classiques et contre les cellules cancéreuses par rapport à des cultures traditionnelles en couche monocellulaire. 8,17,18,21,23,37 Il est montré que l'approche du système aqueux à deux phases pour la production de sphéroïdes permet commodément dépistage de drogues dans la même plaque, tout simplement par addition et le renouvellement d'un composé médicamenteux à des moments souhaités et le dépistage automatisé de la viabilité cellulaire en utilisant un lecteur de micro-plaque standard. Cetteest un avantage majeur par rapport aux techniques telles que des gouttes pendantes qui exigeraient transfert sphéroïdes à une plaque standard pour l'analyse des réponses cellulaires à des médicaments 21 En outre., il est connu que l'appui des cellules dans le microenvironnement tumoral et leurs interactions avec les cellules cancéreuses sont impliqués dans divers phénotypes malignes de cellules cancéreuses. 33-35,38,39 Par conséquent, la capacité de générer des sphéroïdes de co-culture de cellules stromales et le cancer en utilisant la technologie aqueuse deux phases permettront d'évaluer l'influence des cellules de soutien de microenvironnement de la tumeur sur les réponses de cancer cellules à divers traitements. L'expérience de co-culture réalisée dans cette étude sert de preuve de concept-que cette technologie peut produire avec succès des sphéroïdes contenant des cellules cancéreuses et les cellules stromales. Les études futures exploiter cette capacité et d'enquêter sur des caractéristiques différentielles de sphéroïdes mono- et co-cultivées telles que les réponses de prolifération et de drogues. En outre, cetteLa technologie offre une plate-forme pour imiter plus étroitement le microenvironnement vivo dans la tumeur par stromales, y compris d'autres composants dans le modèle de tumeur 40.

En résumé, ce protocole permet la formation spontanée de sphéroïdes dans des plaques à 96 puits sans utiliser de forces extérieures. Adapter la technique à un manipulateur de liquides robotique améliore la rapidité et l'efficacité de la production sphéroïde dans un format à haut débit standard. La compatibilité de la technologie de l'imagerie commerciale et le dosage analyse plates-formes permet d'utiliser différents instruments disponibles dans les laboratoires académiques et industriels. Pour les applications futures, ce protocole permettra de rationaliser le dépistage des drogues avec des cultures de cellules de cancer de la technique 3D une routine. En outre, cette approche peut être facilement modifié pour former des sphéroïdes de différentes tailles, différents types de cellules, différentes combinaisons de cellules cancéreuses et stromales dans sphéroïdes de co-culture, et être adapté à un débit plus élevé de micro-plaques ainsi to accélérer encore le criblage de médicaments anti-cancer.

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Disclosures

Les auteurs ne ont rien à divulguer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000 Sigma-Aldrich 94646
Dextran, MW: 500,000 Pharmacosmos 5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6429
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
Glutamine Life Technologies 35050-061
Antibiotic Life Technologies 15240-062
Clacein AM Life Technologies C3100MP
Hoechst Life Technologies 33342
Cisplatin Spectrum Chemicals 15663-27-1
PrestoBlue Life Technologies A-13261
Pluronic F-108 Sigma Aldrich 542342
Disposable Tips (10 µl) Fluotics C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl) Fluotics C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates Nunc 268200
Equipment
Liquid Handler Agilent Technologies SRT Bravo
Microplate Reader Biotek Instruments Synergy H1M

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Bioengineering Numéro 98 des cellules cancéreuses Spheroid 3D Culture robotique à haut débit Co-Culture Dépistage de drogues
Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues
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Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D.,More

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).

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