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Bioengineering

औषधि परीक्षण के लिए एक जलीय दो चरण प्रणाली के साथ कैंसर सेल spheroids की रोबोट उत्पादन

Published: April 23, 2015 doi: 10.3791/52754
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, The University of Akron

Introduction

सेल आधारित assays विकास और नए कैंसर रोधी दवाओं की खोज के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं। 1,2 ऐतिहासिक, कैंसर की कोशिकाओं की monolayer संस्कृतियों कैंसर कोशिकाओं के विशेष प्रकार के खिलाफ उम्मीदवार यौगिकों की प्रभावकारिता की जांच के लिए नियोजित किया गया है। मानक संस्कृति प्लेटों में monolayer संस्कृतियों के रखरखाव में आसानी, अभिकर्मकों के अलावा के लिए वाणिज्यिक रोबोट उपकरणों के साथ मानक प्लेटों की अनुकूलता, और रासायनिक यौगिकों के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बहाव के विश्लेषण के लिए स्क्रीनिंग उपकरणों के साथ 2 डी संस्कृतियों एक आकर्षक उपकरण प्रस्तुत करना है कि प्रमुख लाभ कर रहे हैं दवा परीक्षण के लिए। 3 दुर्भाग्य से, monolayer सेल assays के अक्सर दवा के विकास और खोज के लिए एक अत्यंत महंगी प्रक्रिया है, जिससे इन विवो में यौगिकों की प्रभावकारिता की भविष्यवाणी करने में असफल। 4,5 दवा कंपनियों और शैक्षिक इकाइयों, केवल ~ 1% से महत्वपूर्ण निवेश और प्रयास के बावजूद विरोधी कैंसर का क्लिनिकल परीक्षण में दवाओं को मंजूरी दी थीपिछले दो दशकों में एफडीए द्वारा। 2D संस्कृतियों और vivo में कैंसर कोशिकाओं के जटिल 3 डी वातावरण के बीच छह असमानता monolayer की संस्कृति प्रणालियों की एक बड़ी कमी है। सात इसलिए, एक की स्थापना में ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ उम्मीदवार यौगिकों की स्क्रीनिंग और अधिक बारीकी से मिलता-जुलता है 3 डी ट्यूमर पर्यावरण उपन्यास कीमोथेरेपी दवाओं के विकास में तेजी लाने सकता है। 8

कैंसर कोशिका spheroids इन विट्रो में एक प्रासंगिक 3 डी ट्यूमर मॉडल प्रस्तुत करते हैं। 9,10 spheroids गैर पक्षपाती सतहों पर या ऐसे स्पिनर फ्लास्क, तरल ओवरले, microfabricated सूक्ष्म रूप में तकनीक का उपयोग कर निलंबन में कैंसर की कोशिकाओं की सहज या प्रेरित विधानसभा के माध्यम से है कि फार्म कॉम्पैक्ट समूहों रहे हैं । सरणियों, microfluidics, और फांसी बूंदों में अच्छी तरह से 11-16 spheroids ज्यामिति और मध्य क्षेत्र में ऑक्सीजन, पोषक तत्वों, और दवा यौगिकों के सीमित परिवहन सहित ठोस ट्यूमर की प्रमुख विशेषताओं की नकल; इसलिए, वे और अधिक बारीकी से दवा जिम्मेदारी पुनर्जन्मmonolayer संस्कृतियों की तुलना में ठोस ट्यूमर के एसई। इस उल्लेखनीय लाभ होने के बावजूद 17-19, spheroids नियमित तौर पर कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ रासायनिक यौगिकों की स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल नहीं कर रहे हैं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रोबोटिक्स और स्क्रीनिंग / इमेजिंग उपकरणों के साथ संगत है कि एक मानक उच्च throughput सेटिंग में एक समान आकार spheroids उत्पादन की कठिनाई दवा के विकास पाइपलाइन में अंडाकार आकृति संस्कृति का समावेश बाधा उत्पन्न करती है। कस्टम सामग्री और प्लेट हाल ही में इस जरूरत को संबोधित करने के लिए व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हो गए हैं हालांकि, लागत विचार उनके बड़े पैमाने पर उपयोग रोकते।

एक नए फांसी ड्रॉप मंच और microfabricated सूक्ष्म कुओं का उपयोग उच्च throughput में लगातार आकार spheroids उत्पादन की क्षमता के साथ दो प्रमुख तकनीकों। 13,16,20 हालांकि, दोनों दृष्टिकोण विशेष प्लेटें और निर्माण करने के लिए महंगा है और समापन बिंदु उपयोगकर्ताओं के लिए असुविधाजनक हैं कि उपकरणों की आवश्यकता कोर अनुसंधान केन्द्रों और दवा उद्योगों जहां सबसे प्रमुख एफई मेंनए कैंसर रोधी दवाओं की खोज के लिए किलों बना रहे हैं। बूंद प्लेटों फांसी के हाल के एक डिजाइन के साथ सेल युक्त बूंदों की स्थिरता में कुछ सुधार के बावजूद, थाली का केवल हर दूसरे छेद अभी भी बूंदों के प्रसार / विलय से बचने के लिए संस्कृति के दौरान प्रयोग किया जाता है। 16 यह काफी प्रयोगात्मक throughput के घट जाती है। नशीली दवाओं के अलावा और नवीकरण मैनुअल या रोबोट pipetting के साथ मुश्किल है और इस प्लेट विन्यास ऐसी थाली पाठकों के रूप में पारंपरिक स्क्रीनिंग उपकरणों के साथ आसानी से संगत नहीं है क्योंकि spheroids जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए एक मानक थाली में स्थानांतरित किए जाने की जरूरत है। 21 माइक्रो कुओं भी नरम लिथोग्राफी का उपयोग कर निर्मित नियंत्रित आकार अंडाकार आकृति उत्पादन की अनुमति देते हैं। 13,20 हालांकि, मानक pipetting के उपकरणों के साथ इस मंच की असंगति एक ही इलाज हालत के लिए सभी spheroids उजागर विभिन्न दवा यौगिकों / सांद्रता के साथ अलग-अलग spheroids के इलाज से रोकती है। इस प्रकार, इस विधि उच्च लिए उपयुक्त नहीं हैकई यौगिकों / सांद्रता का एक साथ परीक्षण की आवश्यकता है कि throughput यौगिक स्क्रीनिंग।

इन बाधाओं को दूर करने के लिए, मानक 96 अच्छी तरह से प्लेट में लगातार आकार कैंसर कोशिका spheroids के उच्च throughput उत्पादन के लिए एक नई तकनीक विकसित की गई है। 22,23 दृष्टिकोण पॉलीथीन ग्लाइकोल साथ एक polymeric जलीय दो चरण प्रणाली (ATPS) (पर आधारित है चरण के गठन पॉलिमर के रूप में खूंटी) और dextran (DEX)। 24 ATPSs हाल ही में सेल micropatterning सक्षम करने के लिए उपन्यास सेल जैविक आवेदनों की एक किस्म में उपयोग किया और अत्यधिक जलीय मीडिया में कोशिकाओं को जैविक अभिकर्मकों के वितरण स्थानीयकृत किया गया है। 25-32 एक रूप है अंडाकार आकृति, कैंसर की कोशिकाओं को जलीय DEX चरण और जिसके परिणामस्वरूप निलंबन की एक उप-माइक्रोलीटर गिरावट के साथ मिश्रित कर रहे हैं एक अच्छी तरह से युक्त विसर्जन जलीय खूंटी चरण समाधान में pipetted है। ड्रॉप एक अंडाकार आकृति के गठन की सुविधा के लिए विसर्जन चरण और सीमीत कोशिकाओं से अमिश्रणीय बनी हुई है। छोटा सा भूतortantly, अत्यधिक जलीय विसर्जन चरण अंडाकार आकृति की कोशिकाओं को पोषक तत्व प्रदान करता है और मीडिया परासरणीयता में परिवर्तन और दवा सांद्रता के उतार-चढ़ाव का कारण बनता है कि कुछ अन्य assays के लिए आम मीडिया वाष्पीकरण के प्रसिद्ध समस्या को कम करता है। इस तकनीक को अंडाकार आकृति उत्पादन और केवल मानक 96 अच्छी तरह से प्लेट में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों और pipetting उपकरण का उपयोग कर दवा इलाज में सक्षम बनाता है। महत्वपूर्ण बात है, spheroids के सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण मानक जैव रासायनिक assays और प्लेट पाठकों का उपयोग कर एक ही थाली में किया जाता है। रोबोट तरल से निपटने के लिए दृष्टिकोण की ATPS और अनुकूलन क्षमता के साथ काम करने में आसानी मोनो-संस्कृति और सह संस्कृति दोनों के उच्च throughput पीढ़ी एक सरल प्रयोगशाला तकनीक spheroids बनाता है। इस नए दृष्टिकोण में सुधार परीक्षण throughput और परीक्षण किया यौगिकों और redu की बढ़ती संख्या लागत प्रभावशीलता (साथ नशीली दवाओं के विकास और खोज की प्रक्रिया में कैंसर कोशिका spheroids के एकीकरण की ओर एक बड़ा कदम आगे होगाCED अभिकर्मक खपत) और दक्षता (समय पर हाथों को कम करने)।

ATPS दृष्टिकोण का उपयोग कर 96 अच्छी तरह से प्लेट में कैंसर कोशिका spheroids के रोबोट के उत्पादन के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे वर्णित है। इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप spheroids और एक वाणिज्यिक जैव रासायनिक परख का उपयोग सेलुलर प्रतिक्रियाओं के बहाव के विश्लेषण के नशीली दवाओं के उपचार का ब्यौरा प्रस्तुत कर रहे हैं।

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Protocol

Polymeric जलीय दो चरण प्रणाली के 1. तैयारी (ATPS)

  1. पॉलीथीन ग्लाइकोल (खूंटी) (मेगावाट: 35,000) के 0.5 ग्राम वजन और जलीय खूंटी चरण (w / v) 5% की 10 मिलीलीटर तैयार करने के लिए एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में पूरा मध्यम विकास की 9.5 मिलीलीटर जोड़ें।
    नोट: पहली बहुलक जोड़ने और द्वारा पीछा शंक्वाकार करने के लिए माध्यम के आधे से जोड़ना तो मध्यम की शेष राशि शंक्वाकार दीवारों से बहुलक के आसंजन को कम करता है और बहुलक तेजी से भंग में मदद करता है।
  2. Dextran (DEX) के 0.128 ग्राम (मेगावाट: 500,000) वजन और 12.8% (डब्ल्यू / वी) जलीय DEX चरण के 1 मिलीलीटर तैयार करने के लिए एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पूरा मध्यम विकास की 0.872 मिलीग्राम में जोड़ें।
  3. के बारे में एक मिनट के लिए भंवर दोनों के समाधान के माध्यम में पॉलिमर भंग करने के लिए।
  4. विघटन और समरूप मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए एक घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान में दोनों के समाधान रखें। स्नान से समाधान का संदूषण की संभावना से बचने के लिए पानी के स्तर से ऊपर टोपी रखेंपानी।
  5. एक बाँझ, प्लास्टिक सिरिंज में खूंटी चरण समाधान लोड और अशुद्धियों को दूर करने के लिए 0.2 माइक्रोन रोमकूप आकार के एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से इसे पारित।
    धीरे-धीरे फिल्टर के माध्यम से समाधान धक्का, खूंटी समाधान के साथ सिरिंज भरें एक शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष और बल के प्रयोग पर फिल्टर का डालने में जगह: ध्यान दें। यह सिरिंज सवार के आंदोलन के खिलाफ प्रतिरोध का अनुभव करने के लिए सामान्य है। समाधान के कुछ फिल्टर में रहेगा, लेकिन बहुलक एकाग्रता परिवर्तन नहीं होगा के रूप में बहुलक समाधान की माइनर हानि होती है।
  6. पिपेट 10 DEX चरण समाधान के μl और एक अलग ट्यूब में माध्यम के 10 μl में यह पतला 6.4% (डब्ल्यू / वी) DEX चरण समाधान में परिणाम के लिए। महाप्राण 100 खूंटी चरण समाधान के μl और एक पेट्री डिश में बांटना।
    1. खूंटी चरण समाधान में DEX चरण समाधान (वी / डब्ल्यू) 6.4% की 0.5 μl बांटना। नेत्रहीन एक खुर्दबीन के नीचे एक DEX बूंद देख द्वारा सफल ATPS गठन की पुष्टि करें। बूंद सीमादो स्थिर, अलग जलीय चरणों की उपस्थिति का संकेत, दृश्य रहना चाहिए।
  7. उपयोग करें जब तक 4 डिग्री सेल्सियस में शेयर जलीय खूंटी और Dex चरण समाधान स्टोर।
    नोट: यह बहुलक समाधान से पहले प्रत्येक प्रयोग करने के लिए नए सिरे से तैयार करने और भंडारण के 24 घंटा के भीतर उपयोग किया जाता है की सिफारिश की है।

मुद्रण कैंसर के सेल spheroids के लिए 2. तैयारी

  1. एक 90% -100% मिला हुआ monolayer के लिए ब्याज (जैसे, एमडीए MB-157 स्तन कैंसर की कोशिकाओं) का कैंसर कोशिकाओं को विकसित। एमडीए MB-157 कोशिकाओं के लिए, DMEM के 10% FBS के, 1% glutamine, और 1% एंटीबायोटिक युक्त से बना एक माध्यम का उपयोग करें।
    1. (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में निलंबन लोड एक सेल हदबंदी बफर का उपयोग हार्वेस्ट कोशिकाओं। , 173.3 XG पर 5 मिनट के लिए यह अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला निकालें, और resuspend कोशिकाओं पूरा मध्यम विकास के 1 मिलीलीटर में।
  2. लोड कोशिकाओं एक hemocytometer पर और उन्हें गिनती के लिए आवश्यक संख्या की गणना करने के लिएएक वांछित अंडाकार आकृति सेल घनत्व के लिए कोशिकाओं की। एक T75 फ्लास्क में उगाई एमडीए MB-157 कोशिकाओं के एक मिला हुआ monolayer आमतौर पर ~ 7 x 10 6 कोशिकाओं देता है।
    नोट:। 1.5 एक्स 10 4 या एमडीए MB-157 कोशिकाओं के लिए बड़ा की एक बूंद की मात्रा के लिए आवश्यक सेल घनत्व एक एकल अंडाकार आकृति सेल प्रकार पर निर्भर करेगा उत्पन्न करने के लिए उदाहरण के लिए 22, एक घनत्व 0.3 μl DEX चरण बूंद प्रति सिफारिश की है एक एकल अंडाकार आकृति का गठन किया जाता है।
  3. 173.3 XG पर 5 मिनट के लिए एक दूसरी बार के लिए अपकेंद्रित्र कोशिकाओं और एक वांछित सेल घनत्व के निलंबन ध्यान केंद्रित करने के लिए मध्यम विकास का एक उचित मात्रा में उन्हें resuspend।
    नोट: 7 एक्स 10 6 कैंसर की कोशिकाओं को काटा गया, तो उदाहरण के लिए, एक 0.3 μl DEX चरण बूंद में 1.5 एक्स 10 4 सेल घनत्व की एक अंडाकार आकृति बनाने के लिए आवश्यक सेल निलंबन की कुल मात्रा 140 μl किया जाएगा। हालांकि कारण अगले चरण में DEX चरण समाधान के साथ कमजोर पड़ने के लिए, केवल कोशिकाओं resuspend सेल संस्कृति के माध्यम से 70 μl का उपयोग करें।
    4. 4 सेल घनत्व अंडाकार आकृति के उदाहरण के लिए, DEX चरण समाधान के 70 μl सेल निलंबन के 70 μl में जोड़ा जाता है।
  4. अच्छी तरह से कोशिकाओं और Dex समाधान के मिश्रण के समान वितरण सुनिश्चित करने के लिए सेल निलंबन मिश्रण। Pipetting ऊपर और नीचे बुलबुला बनने से रोकने के लिए धीरे से किया जाना चाहिए।

सह सुसंस्कृत spheroids के मुद्रण के लिए 3. तैयारी

  1. बढ़ो कैंसर की कोशिकाओं (जैसे, एमडीए MB-157 मानव स्तन कैंसर की कोशिकाओं) और एक 90% -100% मिला हुआ monolayer के लिए समर्थन कोशिकाओं (जैसे, मानव fibroblasts)। (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) एक सेल हदबंदी बफर का उपयोग कर प्रत्येक कोशिका प्रकार हार्वेस्ट।
    1. प्रत्येक शंक्वाकार से 5 173.3 XG पर मिनट, और महाप्राण सतह पर तैरनेवाला के लिए उन्हें अपकेंद्रित्र, एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार में प्रत्येक निलंबन लोड करें। पूरी जी के 1 मिलीलीटर में प्रत्येक शंक्वाकार की कोशिकाओं Resuspendrowth मध्यम।
      नोट: इस तरह के calcein AM (लाइव सेल दाग) और परमाणु रंजक (हेक्स्ट) के रूप में फ्लोरोसेंट रंजक दो प्रकार की कोशिकाओं भेद करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. एक hemocytometer पर अलग से एक सेल प्रकार लोड और सह सुसंस्कृत spheroids में कोशिकाओं का समर्थन करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं का एक वांछित अनुपात के लिए प्रत्येक कोशिका प्रकार की अपेक्षित संख्या की गणना करने के लिए उन्हें गिनती। T75 बोतल में उगाई मिला हुआ एमडीए MB-157 कोशिकाओं के monolayers और fibroblasts आमतौर पर क्रमश: ~ 7 एक्स 10 6 और 6 ~ x 10 6 कोशिकाओं दे।
  3. दो प्रकार की कोशिकाओं की संख्या की एक वांछित अनुपात देने के लिए कैंसर की कोशिकाओं को निलंबन करने के लिए कोशिकाओं का समर्थन करने का निलंबन से सही मात्रा में जोड़ें। उदाहरण के लिए, एक तंतुप्रसू सेल के लिए 50 कैंसर कोशिकाओं के अनुपात का उपयोग करें।
  4. अपकेंद्रित्र एक उचित मात्रा में 173.3 XG और resuspend कोशिकाओं पर 5 मिनट के लिए मिश्रित सेल निलंबन युक्त शंक्वाकार जलीय DEX (w / v) बराबर मध्यम विकास की मात्रा और 12.8% की जिसमें अंतिम घनत्व में कमी की(1.2 में तैयार) चरण समाधान।
  5. धीरे निलंबन की एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए ऊपर और नीचे, जिसके परिणामस्वरूप सेल निलंबन विंदुक।

एक 96 अच्छी तरह से थाली में ट्यूमर spheroids 4. मुद्रण

  1. एक दिन पहले प्रयोगों के लिए, 1% के साथ कोट गैर इलाज, दौर नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस (डब्ल्यू / वी) Pluronic। इस कोटिंग संस्कृति अवधि में सेल लगाव को रोकता है।
  2. फ़िल्टर्ड 5% का 50 μl बांटना एक 96 अच्छी तरह से थाली (गंतव्य थाली) में से प्रत्येक कुएं में जलीय खूंटी चरण (w / v)।
  3. एक विंदुक का प्रयोग, सेल निलंबन मिक्स (चरण 2 या क्रमशः मोनो और सह संस्कृति, के लिए चरण 3 में तैयार) और एक 384 अच्छी तरह से थाली में से एक स्तंभ (स्रोत प्लेट) से अच्छी तरह से हर दूसरे से निलंबन के 20 μl जोड़ने ।
  4. तरल हैंडलर और "घर" निर्देशांक रजिस्टर करने के लिए pipetting के सिर पर मुड़ें। तब Labware सुनिश्चित करने के लिए (4.6 में नीचे) एक पहले से परिभाषित प्रोटोकॉल संकलन और मापदंडों सही परिभाषित कर रहे हैंly है। यह "घर वापस आना" कदम विभिन्न तरल संचालकों के लिए अलग-अलग हो सकता है।
    नोट: प्रोटोकॉल के प्रवाह, कदम-दर-कदम नीचे 4.6 में, भले ही इस्तेमाल किया रोबोट तरल हैंडलर के समान हो जाएगा दिखाया; हालांकि, प्रोग्रामिंग इंटरफेस की वजह से विभिन्न सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए अलग दिख सकता है।
  5. चित्र 1 में दिखाया के रूप में तरल हैंडलर का कार्य केंद्र पर परिभाषित पदों पर स्रोत थाली, गंतव्य की थाली, और विंदुक टिप बक्से रखें।
  6. निम्नलिखित कदम भी शामिल है कि प्रोटोकॉल निष्पादित करें:
    1. लोड वर्कस्टेशन (चित्रा 1) से पिपेट सुझाव (8 टिप्स) के मिश्रण के साथ तरल हैंडलर की pipetting के सिर से बैरल के एक स्तंभ।
    2. स्रोत प्लेट (चित्रा 1) के कुओं में सेल निलंबन मिलाएं। बुलबुला गठन से बचने के लिए कुओं में सेल निलंबन मात्रा से छोटी एक मिश्रण की मात्रा का चयन करें।
    3. एक खाली बेकार सुझावों बॉक्स (चित्रा 1) में सुझावों बाहर निकालें। लोड 10 μl वितरण पिपेट सुझावों के साथ pipetting के सिर से बैरल के एक कॉलम (चित्रा 1)।
    4. महाप्राण प्रत्येक विंदुक टिप में स्रोत थाली से सेल निलंबन के 0.3 μl (चित्रा 1)।
    5. गंतव्य थाली में से एक कॉलम (चित्रा 1) के कुओं में सेल निलंबन बांटना। 0.5 मिमी की एक बांटना ऊंचाई और छोटे से एक μl / सेकंड की एक बांटना प्रवाह की दर का प्रयोग करें।
    6. पूरे गंतव्य थाली में स्तंभ-दर-स्तंभ छपाई पूरा हो गया है जब तक दोहराएँ 4.6.6 के माध्यम से 4.6.1 कदम।
  7. सावधानी से कार्य केंद्र सतह से गंतव्य थाली निकालें और सीओ 2 37 डिग्री सेल्सियस पर एक नम इनक्यूबेटर में जगह और 5%। कोशिकाओं से युक्त DEX चरण बूंदों का खलल न डालें से बचने के लिए इनक्यूबेटर में इसे ले जाने के लिए जब थाली क्षैतिज बनाए रखें।
  8. DEX चरण बूंद के भीतर एक अंडाकार आकृति में कोशिकाओं के एकत्रीकरण की अनुमति देने के लिए 24 घंटे के लिए थाली सेते हैं।
<पी वर्ग = "jove_title"> 5। कैंसर सेल spheroids की औषध उपचार

निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक चार दिन की दवा इलाज के लिए है और यह अन्य उपचार अवधि के लिए संशोधित किया जा सकता 2 दिन के बाद नए सिरे से दवा के साथ एक नवीकरण भी शामिल है कि ध्यान दें।

  1. दिखने में 24 घंटे के बाद 96 अच्छी तरह से प्लेट में अंडाकार आकृति के गठन की पुष्टि करें। प्रत्येक अंडाकार आकृति की सबसे छोटी और सबसे बड़ा व्यास के औसत से spheroids के आकार की माप के लिए, छवि कुओं अगर जरूरत है।
  2. एक पूर्व निर्धारित घुलनशीलता एकाग्रता में निर्माता से सिफारिश की एक विलायक में यह भंग करके एक वांछित दवा का स्टॉक समाधान तैयार है। उदाहरण के लिए, मिलीग्राम / 2 मिलीग्राम पर पानी में सिसप्लैटिन भंग।
    नोट: दवा प्रकाश के प्रति संवेदनशील है यदि प्रकाश से दवा का स्टॉक समाधान को सुरक्षित रखें।
  3. धारावाहिक कमजोर पड़ने तकनीक का उपयोग करना, पिछले चरण में तैयार शेयर समाधान से सेल संस्कृति के माध्यम से पतला दवा सांद्रता तैयार करते हैं। प्रत्येक कमजोर पड़ने दो बार वांछित एकाग्रता बनाया जाना चाहिए। दिलution अनुपात की शुरुआत के शेयर एकाग्रता के आधार पर भिन्न और काम कर रहे सांद्रता वांछित जाएगा।
  4. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए पिछले चरण में तैयार दवा समाधान के 50 μl जोड़ें। यह रोबोट या मैनुअल pipetting द्वारा किया जा सकता है।
    नोट: प्रत्येक दवा एकाग्रता अच्छी तरह से प्रत्येक में पहले से ही 50 μl जलीय खूंटी चरण द्वारा वांछित एकाग्रता के लिए छमाही में पतला हो जाएगा।
    1. प्रत्येक एकाग्रता के लिए एक 96 अच्छी तरह से थाली (एन = 16) के दो स्तंभों से spheroids का प्रयोग करें।
    2. नियंत्रण कुओं में, जलीय खूंटी चरण के मौजूदा 50 μl के लिए ताजा संस्कृति के माध्यम से केवल 50 μl जोड़ें।
  5. प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर 48 घंटा और 5% सीओ 2, के लिए दवा के साथ spheroids सेते हैं।
  6. ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, वांछित सांद्रता में दवा की ताजा dilutions के लिए तैयार है और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए नए सिरे से दवा समाधान के 50 μl जोड़कर दवा नवीनीकृत।
    नोट: कुओं पहले से ही पहली दवा टी से वांछित दवा एकाग्रता होते हैंreatment। कोई कमजोर पड़ने हो जाएगा के बाद से इसलिए इस नवीकरण चरण में, प्रत्येक एकाग्रता वांछित एकाग्रता में तैयार किया जाता है।
  7. प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर एक और 48 घंटे के लिए दवा और 5% सीओ 2 के साथ spheroids सेते हैं।

6. spheroids में सेलुलर व्यवहार्यता का विश्लेषण

  1. नए सिरे से दवा (यानी, एक दवा के साथ spheroids के उपचार के कुल समय चार दिनों का है) के साथ ऊष्मायन के 48 घंटे के बाद, अच्छी तरह से मैनुअल pipetting द्वारा एक में मध्यम की कुल मात्रा को मापने।
    नोट: एक कुएं में विशिष्ट मात्रा 140 μl (एक छोटी सी कमी वाष्पीकरण की वजह से होता है) ~ है।
  2. कुल अच्छी तरह से मात्रा का 10% एकाग्रता के रूप में सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक (जैसे, PrestoBlue) की मात्रा की गणना। प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक की इस मात्रा में जोड़ें।
    ध्यान दें: एक कुएं में 140 μl के एक मौजूदा मीडिया मात्रा के साथ, 15.6 μl की मात्रा अच्छी तरह से कुल का 10% की एकाग्रता देने के लिए आवश्यक है। यह गणना की है9 (140 μl / 9 = 15.6 μl) द्वारा मौजूदा मीडिया मात्रा विभाजित।
  3. प्रकाश से सुरक्षित 37 डिग्री सेल्सियस पर छह घंटे के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए जोड़ा सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक, साथ थाली सेते हैं।
  4. एक माइक्रो-प्लेट रीडर में थाली प्लेस और क्रमश: 560 एनएम और 590 एनएम उत्तेजना और उत्सर्जन तरंगदैर्ध्य में प्रतिदीप्ति संकेत पढ़ें।
  5. एक ही इलाज की स्थिति से मूल्यों औसत के बाद नियंत्रण कुओं की है कि करने के लिए इलाज कुओं से फ्लोरोसेंट संकेत सामान्य से spheroids में कोशिकाओं का प्रतिशत व्यवहार्यता की गणना।

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Representative Results

रोबोट तरल हैंडलर का कार्य केंद्र। चित्रा 1 में दिखाया गया pipetting के सिर और धारा 4.6 में spheroids की रोबोट छपाई में इस्तेमाल सभी स्टेशनों चिह्नित कर रहे है। छवि टिप बक्से के लिए दो अलग-अलग स्टेशनों (एक मिश्रण के लिए सुझावों का सेट और सेल निलंबन जलीय DEX चरण मिश्रण का / वितरण aspirating के लिए दूसरे सेट) के उपयोग से पता चलता है। पूरे सेटअप बाँझपन बनाए रखने के लिए एक मानक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के भीतर स्थित है। दो जलीय दो चरण प्रणाली के साथ "छपाई" प्रक्रिया का एक योजनाबद्ध दर्शाया गया चित्र। जलीय DEX चरण (नीले, patterning के चरण) में सेल निलंबन के साथ भरी हुई एक विंदुक टिप बंद करने के लिए अपनी सामग्री वितरित करने के लिए जलीय खूंटी चरण (गुलाबी, विसर्जन चरण) युक्त एक 96 अच्छी तरह से थाली का एक दौर नीचे कुएं में उतारा है अच्छी तरह से नीचे। जिसके परिणामस्वरूप DEX चरण बूंद dispersing से कैंसर की कोशिकाओं को प्रतिबंधित करता है और है कि परिणाम में सेल सेल बातचीत को प्रोत्साहित करती हैकोशिकाओं और अंडाकार आकृति गठन के एकत्रीकरण। अंडाकार आकृति गठन सहज है और चित्रा 2 की प्रयोगात्मक छवि में दिखाया गया है ऊष्मायन के 24 घंटे के भीतर होता है। अभ्यास में, इस अंडाकार आकृति मुद्रण 96 अच्छी तरह से प्लेट में स्तंभ-दर-स्तंभ किया जाता है। Spheroids फार्म के बाद, संस्कृति के माध्यम से एक भी जलीय चरण के लिए दो चरण प्रणाली परिवर्तित करने, ताजा माध्यम के प्रत्यक्ष अलावा द्वारा नए सिरे से है। इस संक्रमण जलीय खूंटी और Dex चरणों के विभाजन के लिए आवश्यक एक सीमा एकाग्रता नीचे खूंटी की सांद्रता में कमी और Dex की वजह से है।

तरल हैंडलर की एक पारंपरिक हवा विस्थापन pipetting के तंत्र से वितरण parametrically अनुकूलित किया गया था और यह पाया गया कि 0.5 मिमी, पूर्व aspirated हवा की मात्रा का उत्पादन के 0.2 μl वितरण के द्वारा पीछा छोटे से एक μl / सेकंड की एक बांटना प्रवाह की दर के बग़ैर ऊंचाई जलीय DEX की सबसे लगातार आकार बूँदें, और इसलिए spheroids। 23 चित्रा 3A जिले332 ± 31 माइक्रोन के एक औसत व्यास के साथ एक थाली से 96 spheroids के व्यास का वितरण निभाता है। पिछला अनुभव इस दृष्टिकोण आम तौर पर मतलब व्यास लगभग 8% -10% मानक त्रुटि के साथ spheroids उत्पन्न करता है कि पता चलता है। -3 बी व्यास सामान्य रूप से वितरित कर रहे हैं कि प्रदर्शन, चित्रा 3 ए में के रूप में एक ही थाली के spheroids के व्यास की आवृत्ति वितरण पता चलता है।

अगला, नई प्लेटों के लिए spheroids स्थानांतरित करने के लिए एक आवश्यकता के बिना मानक 96 अच्छी तरह प्लेटें और एक ही प्लेट में सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण में यौगिक स्क्रीनिंग के लिए इस दृष्टिकोण की क्षमता का प्रदर्शन किया गया था। चित्रा 4 एमडीए की व्यवहार्यता की एक खुराक पर निर्भर अध्ययन से पता चलता है -MB-157 स्तन कैंसर कोशिका spheroids एक नैदानिक ​​chemotherapeutic दवा, सिसप्लैटिन के साथ इलाज किया। दवा इलाज और नियंत्रण spheroids एक वाणिज्यिक PrestoBlue अभिकर्मक (सेल व्यवहार्यता अभिकर्मक) के साथ incubated रहे थे। Enzymatically सक्रिय कोशिकाओं इसकी वजह कमसज्जन और मीडिया रंग में परिवर्तन और फ्लोरोसेंट संकेत में एक पारी में हुई। संकेत में बदलाव जीवित कोशिकाओं (जैसे, नियंत्रण spheroids में) के साथ सबसे बड़ी थी। spheroids में कैंसर की कोशिकाओं की व्यवहार्यता 1 माइक्रोन से ऊपर दवा एकाग्रता बढ़ाने के साथ कम किया है। इस परीक्षा में LD50 = 4.67 माइक्रोन के एक 50% घातक खुराक दवा एकाग्रता में हुई।

3 डी संस्कृति के लिए इस जलीय दो चरण प्रणाली प्रौद्योगिकी ऐसे stromal कोशिकाओं समर्थन के रूप में सेलुलर microenvironments के अन्य घटकों को शामिल करके और अधिक यथार्थवादी ट्यूमर मॉडल का सीधा उत्पादन की अनुमति देता है। यह 3 डी संस्कृतियों में stromal कोशिकाओं सहित कि पहले से दिखाया गया है एमडीए MB-157 मानव स्तन के संयोजन के द्वारा उत्पन्न किया गया एक सबूत की अवधारणा प्रयोग, सह संस्कृति spheroids के रूप में विकास, प्रसार, और कैंसर कोशिकाओं के आक्रमण। 33-35 modulates 50 के अनुपात में कैंसर की कोशिकाओं और मानव fibroblasts:। 1 36 से पहले प्रयोगों के लिए, एमडीए MB-157 और fibroblast कोशिकाओं दाग रहे थेएक परमाणु डाई (नीला) और जीवित कोशिका डाई (हरा) के साथ, क्रमशः, फ्लोरोसेंट छवियों में कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति है। चित्रा 5A 1.5 एक्स 10 4 कोशिकाओं के घनत्व और एक 50 के साथ सह संस्कृति spheroids के फ्लोरोसेंट और चरण छवियों से पता चलता है :। कैंसर की कोशिकाओं और fibroblasts की एक अनुपात चित्रा 5 ब तुलना के लिए एमडीए MB-157 कोशिकाओं के नियंत्रण spheroids पता चलता है। यह दृष्टिकोण कैंसर कोशिकाओं के विभिन्न फेनोटाइप पर stromal कोशिकाओं के प्रभाव का मूल्यांकन कर सकेंगे।

चित्र 1
चित्रा 1. तरल से निपटने प्लेटफार्म। तरल हैंडलर सुझावों मिश्रण जहां स्टेशनों, वितरण टिप्स, अपशिष्ट सुझावों बॉक्स, स्रोत प्लेट के होते हैं, और गंतव्य थाली स्थानों रखा जाता है। प्रत्येक स्टेशन के स्थान प्रोटोकॉल में परिभाषित किया गया है। मिश्रण सुझावों pipetting के सिर के एक स्तंभ पर लादा और जलीय DEX चरण के समाधान के मिश्रण करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं स्रोत थाली में कोशिकाओं से युक्त। इन सुझावों को तो बेकार सुझावों बॉक्स में निपटाया जाता है और वितरण सुझावों pipetting के सिर के एक ही स्तंभ पर डाला जाता है। इन सुझावों स्रोत थाली से कोशिकाओं से युक्त जलीय DEX चरण के 0.3 μl महाप्राण और गंतव्य थाली कुओं में पहले से ही विसर्जन खूंटी चरण के भीतर DEX चरण की कोशिका युक्त बूंदों के लिए फार्म गंतव्य थाली में बांटना। अंत में इन सुझावों को भी छपाई का एक चक्र पूरा करने के लिए बेकार सुझावों बॉक्स में निपटाया जाता है।

चित्र 2
चित्रा 2. उपगोल गठन। तरल हैंडलर एक अच्छी तरह से जलीय खूंटी समाधान युक्त (गुलाबी) में जलीय DEX चरण (नीला) कोशिकाओं (हरा) युक्त के 0.3 μl dispenses। सही पर छवि में दिखाया गया है इस ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद एक अंडाकार आकृति के गठन में यह परिणाम है। स्केल बार 200 माइक्रोन।टीपीएस: //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. उपगोल संगति डेटा। एक 96 अच्छी तरह से थाली से मापा spheroids के व्यास (क) के वितरण, प्रत्येक बिंदु एक अंडाकार आकृति का प्रतिनिधित्व करता है। (ख) व्यास की आवृत्ति वितरण डेटा की सामान्य वितरण से पता चलता है।

चित्रा 4
Spheroids चित्रा 4. दवा की प्रतिक्रिया। एमडीए MB-157 स्तन कैंसर कोशिका spheroids में कोशिकाओं की व्यवहार्यता एक एनएम 200 माइक्रोन सीमा पर सिसप्लैटिन की एकाग्रता में वृद्धि के साथ कम कर देता है। धराशायी लाइन व्यवहार्यता डेटा के लिए एक sigmoidal फिट है।

चित्रा 5
चित्रा 5. सह संस्कृति spheroids (क) फ्लोरोसेंट (बाएं) और चरण विपरीत की spheroids की (दाएं) छवियों एमडीए MB-157 स्तन कैंसर की कोशिकाओं (नीला) के सह-सुसंस्कृत एक 50 में fibroblasts (हरा) के साथ: 1। अनुपात। एमडीए MB-157 कोशिकाओं (ख) spheroids तुलना के लिए दिखाए जाते हैं। स्केल बार 100 माइक्रोन। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

Spheroids बेहतर ट्यूमर शरीर विज्ञान और दवा की प्रभावकारिता को समझते हैं और विरोधी कैंसर दवाओं की खोज के लिए एक उपयोगी उपकरण प्रदान करने के लिए एक यथार्थवादी मॉडल प्रस्तुत करते हैं। इस तरह के आवेदन बहुत ही मानक Labware, तरल से निपटने उपकरण और स्क्रीनिंग उपकरण की आवश्यकता है कि सरल अंडाकार आकृति पीढ़ी और रखरखाव की तकनीक से लाभ होगा। एक जलीय दो चरण प्रणाली बूंद चरण के भीतर करने के लिए अनायास कुल कैंसर कोशिकाओं के उपयोग के कुशल उत्पादन और रोबोट तरल संचालकों के साथ spheroids के रखरखाव, और सीटू नशीली दवाओं के उपचार और वाणिज्यिक अभिकर्मकों और उपकरणों के साथ सेलुलर प्रतिक्रियाओं का समापन बिंदु विश्लेषण में अनुमति देता है। इस प्रकार, इस तकनीक का एक बड़ा लाभ यह 3 डी कैंसर सेल संस्कृतियों के मौजूदा दृष्टिकोण खत्म हो गया है और दवाओं की खोज में तेजी लाने के लिए एक स्क्रीनिंग मंच प्रस्तुत करता है।

एक माइक्रो अच्छी तरह से थाली के भीतर वर्दी आकार spheroids पैदा करने के लिए एक समान आधारभूत सेलुलर एसी सुनिश्चित करने के लिए उच्च throughput प्रदर्शन अनुप्रयोगों के लिए महत्वपूर्ण हैसभी spheroids में tivity स्तर। एक हवाई विस्थापन pipetting के तंत्र के साथ तरल संचालकों का प्रयोग, यह जलीय DEX चरण के वितरण पर कुंजी तरल से निपटने मानकों (पूर्व aspirated हवा की मात्रा, ऊंचाई बांटना प्रवाह की दर बांटना, और) के प्रभाव की मात्रा का ठहराव के माध्यम से वितरण प्रक्रिया का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है । यह अनुकूलन pipetting के सिर कुओं में चिपचिपा DEX चरण समाधान और कैंसर की कोशिकाओं को बाहर झाडू और समरूप spheroids का उत्पादन करने की अनुमति देता है। इन तीन मानकों के लिए विशिष्ट मात्रा SRT ब्रावो तरल हैंडलर के लिए प्रोटोकॉल में निर्धारित किया गया है, एक समान दृष्टिकोण विसर्जन खूंटी चरण में तिरस्कृत लगातार DEX चरण बूंद आकार में परिणाम है कि इष्टतम वितरण शर्तों का निर्धारण करने के लिए अन्य तरल संचालकों के साथ नियोजित किया जाना चाहिए। इसके अलावा, यह 96 युक्तियों का उपयोग करने के लिए और एक साथ सभी 96 कुओं में spheroids मुद्रित करने के लिए संभव है। हालांकि यह काफी के साथ स्रोत थाली को भरने के लिए आवश्यक कोशिकाओं की संख्या बढ़ जाती हैजलीय DEX चरण युक्त कोशिकाओं। भले ही स्तंभ के लिहाज से या पूरी प्लेट मुद्रण दृष्टिकोण के चयन का, यह आकांक्षा कदम करने से पहले स्रोत प्लेट की सामग्री के मिश्रण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इस DEX चरण में घने सेल निलंबन सजातीय है और spheroids के आकार में बदलाव को कम कर देता है कि यह सुनिश्चित करता है।

कई अध्ययनों से कैंसर कोशिका spheroids ऐसे अभिकर्मकों की आकृति विज्ञान प्रसार और सीमाओं के रूप में avascular ट्यूमर के कई महत्वपूर्ण गुण है कि नकल दिखाने; इसलिए वे पारंपरिक monolayer सेल संस्कृतियों की तुलना में कैंसर कोशिकाओं के खिलाफ उपन्यास और पारंपरिक यौगिकों की प्रभावकारिता के मूल्यांकन के लिए एक physiologically प्रासंगिक मॉडल प्रस्तुत करते हैं। 8,17,18,21,23,37 यह दिखाया गया है कि उत्पादन के लिए जलीय दो चरण प्रणाली दृष्टिकोण spheroids सुविधाजनक बस अलावा और इच्छित समय बिंदुओं पर एक दवा परिसर के नवीकरण और एक मानक माइक्रो-प्लेट रीडर का उपयोग सेल व्यवहार्यता के स्वचालित स्क्रीनिंग से, एक ही थाली में दवा स्क्रीनिंग की अनुमति देता है। यहइस तरह, यह कैंसर कोशिकाओं के साथ ट्यूमर microenvironment में कोशिकाओं का समर्थन करने और उनकी बातचीत में फंसा रहे हैं ज्ञात है कि दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण के लिए एक मानक थाली करने के लिए spheroids स्थानांतरित करने की आवश्यकता होगी। इसके अलावा 21 फांसी बूंदों के रूप में तकनीकों पर एक बड़ा लाभ यह है जलीय दो चरण प्रौद्योगिकी का उपयोग कर विभिन्न घातक इसलिए कैंसर कोशिकाओं के phenotypes। 33-35,38,39 कैंसर के सह-संस्कृति spheroids उत्पन्न करने की क्षमता और stromal कोशिकाओं के कैंसर की प्रतिक्रियाओं पर ट्यूमर microenvironment की कोशिकाओं का समर्थन करने का प्रभाव का मूल्यांकन में मदद मिलेगी विभिन्न उपचार के लिए कोशिकाओं। इस अध्ययन में प्रदर्शन सह संस्कृति प्रयोग इस तकनीक का सफलतापूर्वक कैंसर की कोशिकाओं और stromal कोशिकाओं से युक्त spheroids उत्पन्न कर सकते हैं कि एक सबूत की अवधारणा के रूप में कार्य करता है। भविष्य के अध्ययन इस क्षमता का दोहन और इस तरह के प्रसार और दवा प्रतिक्रियाओं के रूप में मोनो और सह सुसंस्कृत spheroids का अंतर विशेषताओं की जांच करेंगे। इसके अलावा, इसप्रौद्योगिकी और अधिक बारीकी से ट्यूमर मॉडल में अन्य स्ट्रोमल घटकों को शामिल करके vivo में ट्यूमर microenvironment नकल करने के लिए एक मंच प्रदान करता है। 40

सारांश में, इस प्रोटोकॉल किसी भी बाहरी ताकतों का उपयोग किए बिना 96 अच्छी तरह से प्लेट में spheroids की सहज गठन के लिए सक्षम बनाता है। एक रोबोट तरल हैंडलर के लिए तकनीक आदत डाल एक मानक उच्च throughput प्रारूप में गति और अंडाकार आकृति उत्पादन की क्षमता को बढ़ाता है। वाणिज्यिक इमेजिंग और परख के साथ प्रौद्योगिकी की अनुकूलता शैक्षणिक और औद्योगिक प्रयोगशालाओं में उपलब्ध विभिन्न उपकरणों का उपयोग करने की अनुमति देता है प्लेटफार्मों का विश्लेषण करती है। भविष्य अनुप्रयोगों के लिए, इस प्रोटोकॉल 3 डी कैंसर सेल संस्कृतियों एक नियमित तकनीक के साथ दवा स्क्रीनिंग को कारगर होगा। इसके अलावा, इस दृष्टिकोण को आसानी से विभिन्न आकार, विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं, सह संस्कृति spheroids में कैंसर और stromal कोशिकाओं के विभिन्न संयोजनों का spheroids फार्म करने के लिए संशोधित किया जा सकता है, और उच्च throughput सूक्ष्म अच्छी तरह प्लेटें टी करने के लिए बढ़ाया जाओ आगे विरोधी कैंसर दवा स्क्रीनिंग में तेजी लाने के।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Consumables
Polyethylene glycol, MW: 35,000 Sigma-Aldrich 94646
Dextran, MW: 500,000 Pharmacosmos 5510 0500 9007
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma-Aldrich D6429
Fetal Bovine Serum Sigma-Aldrich 12306C
Glutamine Life Technologies 35050-061
Antibiotic Life Technologies 15240-062
Clacein AM Life Technologies C3100MP
Hoechst Life Technologies 33342
Cisplatin Spectrum Chemicals 15663-27-1
PrestoBlue Life Technologies A-13261
Pluronic F-108 Sigma Aldrich 542342
Disposable Tips (10 µl) Fluotics C-P10V11.ST
Disposable Tips (70 µl) Fluotics C-P70V11.ST
Round-bottom 96-well plates Nunc 268200
Equipment
Liquid Handler Agilent Technologies SRT Bravo
Microplate Reader Biotek Instruments Synergy H1M

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बायोइन्जिनियरिंग अंक 98 कैंसर सेल उपगोल 3 डी संस्कृति रोबोट उच्च throughput सह संस्कृति दवा स्क्रीनिंग
औषधि परीक्षण के लिए एक जलीय दो चरण प्रणाली के साथ कैंसर सेल spheroids की रोबोट उत्पादन
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Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D.,… More

Ham, S. L., Atefi, E., Fyffe, D., Tavana, H. Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing. J. Vis. Exp. (98), e52754, doi:10.3791/52754 (2015).

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