Introduction
Ensaios baseados em células fornecer uma ferramenta importante para o desenvolvimento e descoberta de novos fármacos anti-cancro. 1,2 Historicamente, culturas em monocamada de células de cancro têm sido utilizados para investigar a eficácia dos compostos candidatos em relação a determinados tipos de células cancerosas. A facilidade de manutenção das culturas em monocamada em placas de cultura padrão, o grau de compatibilidade de placas padrão com ferramentas comerciais robóticos para a adição de reagentes, e com equipamentos de controlo para análise de respostas celulares a jusante para os compostos químicos são os principais benefícios que tornam culturas 2D uma ferramenta atraente para testes de drogas 3. Infelizmente, os ensaios em monocamada de células muitas vezes não conseguem prever a eficácia de compostos in vivo, tornando o desenvolvimento de drogas e descoberta de um processo extremamente caro. 4,5 Apesar de investimento e esforço significativo por empresas farmacêuticas e unidades acadêmicas, apenas cerca de 1% de anti-câncer drogas em ensaios clínicos foram aprovadospelo FDA nos últimos duas décadas. 6 Disparidade entre as culturas em 2D e 3D ambiente complexo de células cancerosas in vivo é uma grande falha dos sistemas de cultura em monocamada. 7 Portanto, a triagem de compostos candidatos contra células tumorais em um cenário que mais se assemelha o ambiente tumor 3D pode acelerar o desenvolvimento de novas drogas de quimioterapia. 8
Esferóides de células de cancro apresentar um modelo de tumor in vitro 3D relevante. 9,10 esferóides compactos são aglomerados que se formam através da montagem espontânea ou induzida de células cancerosas em superfícies não-aderentes ou em suspensão, utilizando técnicas tais como balão giratório, sobreposição de líquido, microbiologia microfabricado . bem arrays, microfluídica, e gotas de suspensão 11-16 Spheroids imitar características-chave de tumores sólidos, incluindo geometria e limitado de transporte de oxigênio, nutrientes e compostos de drogas na zona central; Assim, eles se regenerar mais de perto respon drogase de tumores sólidos, em comparação com as culturas de monocamada 17-19 Apesar deste benefício marcado., esferóides não são rotineiramente utilizados para o rastreio de compostos químicos contra as células cancerosas. Dificuldade de produzir esferóides tamanho uniforme em um cenário de alta taxa de transferência padrão que é compatível com a robótica comercialmente disponíveis e ferramentas de triagem / imagem impede a incorporação da cultura esferóide em pipeline de desenvolvimento de medicamentos. Embora os materiais e placas personalizadas tornaram-se recentemente disponível no mercado para atender a essa necessidade, considerações de custo dissuadir a sua utilização generalizada.
Duas importantes técnicas com a capacidade de produzir esferóides porte consistentes em alto rendimento utilizar uma nova plataforma de gota suspensa e micro-poços microfabricados 13,16,20. No entanto, ambas as abordagens requerem placas e dispositivos que são caros para fabricar e inconveniente para os usuários de endpoint especiais em centros de pesquisa do núcleo e indústrias farmacêuticas, onde o mais importante de effortes para a descoberta de novas drogas anti-cancerosas são feitos. Apesar de algumas melhorias na estabilidade de gotas contendo células com um projeto recente de pendurar placas de queda, apenas um ou outro buraco da placa ainda é usado durante a cultura para evitar a propagação / fusão de gotas. 16 Isto diminui significativamente o rendimento experimental. Adição da droga e de renovação é difícil com o manual ou pipetagem robotizada esferóides e precisam de ser transferidos para uma placa padrão para a análise bioquímica porque esta configuração placa não é facilmente compatível com o equipamento de rastreio convencionais, tais como leitores de placas. 21 As micro-poços fabricados utilizando litografia macia também permitir tamanho controlado produção esferóide. 13,20 No entanto, a incompatibilidade desta plataforma com ferramentas de pipetagem padrão impede o tratamento de esferóides individuais com diferentes compostos de drogas / concentrações, expondo todos os esferóides a uma condição de tratamento individual. Assim, este método não é apropriado para elevadorastreio de compostos caudal que requer o teste simultâneo de vários compostos / concentrações.
Para superar estes obstáculos, uma nova técnica de alto rendimento de produção de esferóides de células de cancro tamanho consistente em placas de 96 poços padrão foi desenvolvido. 22,23 A abordagem baseia-se num sistema de duas fases aquosa polimérica (SAB) com polietileno-glicol ( PEG) e dextrano (DEX) como polímeros de formação de fases. 24 ATPSs foram recentemente utilizado em uma variedade de aplicações biológicas romance celulares que permitam micropatterning célula e entrega localizada de reagentes biológicos para as células em meios aquosos altamente 25-32. Para formar uma esferóide, as células cancerosas são misturados com a fase aquosa DEX e uma gota de sub-microlitros da suspensão resultante é pipetada para dentro de uma solução aquosa de fase de PEG contendo a imersão bem. A queda continua a fase imiscível de imersão e confina células para facilitar a formação de um esferóide. Diabinhoortantly, a fase de imersão altamente aquoso fornece os nutrientes para as células do esferóide e minimiza o problema bem conhecido de evaporação meios comum para alguns outros ensaios que causa mudanças na osmolalidade meios e flutuações de concentrações de droga. Esta técnica permite a produção esferóide e tratamento de drogas só utilizando reagentes comercialmente disponíveis e as ferramentas de pipetagem em placas de 96 poços convencionais. É importante notar que a análise de respostas celulares de esferóides é realizada na mesma placa por meio de ensaios bioquímicos convencionais e leitores de placas. A facilidade de trabalhar com ATPS e adaptabilidade da abordagem para manipulação de líquidos robótico faz geração de alto rendimento de ambos mono-cultura e co-cultura esferóides uma técnica de laboratório simples. Esta nova abordagem será um grande passo à frente em direção à integração de esferóides de células cancerosas em processos de desenvolvimento de drogas e de descoberta com melhor rendimento testes e custo-efetividade (aumento do número de compostos testados e reduconsumo ced reagente) e eficiência (reduzindo mãos no tempo).
Um protocolo detalhado para produção robótico de esferóides de células de cancro em placas de 96 poços utilizando a abordagem APTS é descrito abaixo. Além disso, os detalhes do tratamento medicamentoso de esferóides resultantes e análise de respostas celulares a jusante utilizando um ensaio bioquímico comercial são apresentados.
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Protocol
1. Preparação de polimérica aquosa sistema de duas fases (SADF)
- Pesar 0,5 g de polietileno glicol (PEG) (PM: 35.000) e adicioná-lo a 9,5 ml de meio de crescimento completo numa cónico de 15 ml estéril para preparar 10 ml de 5% (w / v) de PEG fase aquosa.
Nota: A adição de metade do meio com o primeiro cónica seguido pela adição do polímero e, em seguida, a quantidade remanescente de forma minimiza a adesão do polímero às paredes cónicas e ajuda o polímero dissolver-se mais rapidamente. - Pesar 0,128 g de dextrano (DEX) (MW: 500.000) e adicioná-lo a 0,872 ml de meio de crescimento completo num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml estéril para preparar a 1 ml de 12.8% (w / v) de fase aquosa DEX.
- Vortex tanto soluções durante cerca de 1 min para dissolver os polímeros na forma.
- Mantenha as duas soluções num banho de água a 37 ° C durante 1 hora para assegurar a dissolução e misturas homogéneas. Manter as tampas acima do nível de água para evitar a possibilidade de contaminação das soluções do banhoágua.
- Carregar a solução em uma fase de PEG estéril, uma seringa de plástico e passá-la através de um filtro de seringa de 0,2 um de tamanho dos poros para remover as impurezas.
Nota: Encher a seringa com a solução de PEG, colocá-lo na inserção do filtro no topo de um tubo cónico e utilizar a força, empurrar lentamente a solução através do filtro. É normal a ocorrência de resistência contra o movimento do êmbolo da seringa. Menor perda da solução de polímero ocorre como parte da solução permanece no filtro, mas a concentração de polímero não irá mudar. - Pipetar 10 ml da solução da fase de DEX e dilui-lo em 10 ul de meio em um tubo separado para resultar em 6,4% (w / v) de fase DEX. Aspirar 100 ul da solução da fase de PEG e fornecê-las a uma placa de Petri.
- Dispensar a 0,5 ul de 6,4% (w / v) de fase DEX na solução de fase de PEG. Confirme visualmente formação ATPS sucesso observando uma queda DEX sob um microscópio. O limite gotadeve permanecer visível, indicando presença de duas fases aquosas estáveis, separados.
- Guarde o estoque aquoso PEG e soluções fase DEX em 4 ° C até o uso.
Nota: Recomenda-se que as soluções de polímeros são preparados fresco antes de cada experiência e utilizada dentro de 24 horas de armazenamento.
2. Preparação para a Impressão de Câncer Spheroids Celulares
- Crescer as células cancerosas de interesse (por exemplo, células MDA-MB-157 de cancro da mama) com um 90% -100% monocamada confluente. Para MDA-MB-157 células, utilizar um meio composto por DMEM contendo 10% de FBS, 1% de glutamina, e 1% de antibiótico.
- Células colheita, usando um tampão de dissociação celular (de acordo com o protocolo do fabricante) e carregar a suspensão para um cónico de 15 ml. Centrifuga-se que durante 5 min a 173,3 xg, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de meio de crescimento completo.
- As células de carga em um hemocitômetro e contá-los para calcular o número necessáriode células para uma densidade de células desejada esferóide. Uma monocamada confluente de células MDA-MB-157 células cultivadas em um frasco T75 geralmente dá ~ 7 x 10 6 células.
Recomenda-se a densidade celular Requerida para um volume de gota para gerar um único esferóide dependerá do tipo de célula 22 Por exemplo, uma densidade de 1,5 x 10 4 ou maior para MDA-MB-157 células por 0,3 ul de fase gota a DEX: Nota. assegurar a formação de um único esferóide. - Centrifugar células para uma segunda vez durante 5 min a 173,3 x g e ressuspender-los num volume apropriado de meio de crescimento para concentrar a suspensão até uma densidade de células desejada.
Nota: Por exemplo, se 7 x 10 6 células cancerosas foram colhidas, o volume total de suspensão de células necessário para formar um esferóide de densidade de 1,5 x 10 células em 4 ul de 0,3 DEX gota fase será de 140 ul. No entanto, devido à diluição com a solução da fase de DEX no passo seguinte, utilizar apenas 70 ul de meio de cultura celular para ressuspender as células. - Misture bem a suspensão de células para garantir a distribuição uniforme de células e mistura de solução DEX. A pipetagem para cima e para baixo deve ser feito com cuidado para evitar a formação de bolhas.
3. Preparação para a Impressão de Spheroids Co-cultura
- Crescer as células cancerosas (por exemplo, MDA-MB-157 células de cancro da mama humano) e células de suporte (por exemplo, fibroblastos humanos) para um de 90% -100% monocamada confluente. Colheita de cada tipo celular utilizando um tampão de dissociação de células (de acordo com o protocolo do fabricante).
- Carregar cada suspensão numa cónico de 15 ml e centrifugar para clarificação durante 5 min a 173,3 x g, e a partir de cada sobrenadante aspirado cónica. Ressuspender as células de cada cónica em 1 ml de completa gmédio rescimento.
Nota: corantes fluorescentes tais como Calceina AM (mancha de células vivas) e corantes nucleares (Hoechst) pode ser utilizada para distinguir os dois tipos de células.
- Carregar cada suspensão numa cónico de 15 ml e centrifugar para clarificação durante 5 min a 173,3 x g, e a partir de cada sobrenadante aspirado cónica. Ressuspender as células de cada cónica em 1 ml de completa gmédio rescimento.
- Carregar cada tipo de célula separadamente para um hemocitómetro e contá-las para calcular o número necessário de cada tipo de célula para uma proporção desejada de células cancerosas para células de suporte em esferóides co-cultivadas. As monocamadas confluentes de células MDA-MB-157 e as células fibroblastos cultivadas em frascos T75 geralmente dar 7 x 10 ~ 6 e 10 ~ 6 x 6 células, respectivamente.
- Adicionar o volume correcto a partir da suspensão de células de suporte para as células cancerosas suspensão para dar uma proporção desejada dos dois o número de tipos de células. Por exemplo, usar uma proporção de 50 células cancerosas para 1 célula de fibroblasto.
- Centrifugar a cónico contendo a suspensão celular misturada durante 5 min a 173,3 xg células e ressuspender em um volume apropriado para resultar na densidade final compreendendo de volumes iguais de meio de crescimento e a 12,8% (w / v) aquosa DEXem fase de solução (preparado em 1.2).
- Pipeta suavemente a suspensão de células resultante para cima e para baixo para assegurar a homogeneidade da suspensão.
4. Impressão de esferóides de Tumor em uma placa de 96 poços
- Um dia antes das experiências, revestimento, de fundo redondo de placas de 96 poços não tratados com 1% (w / v) de Pluronic a 37 ° C durante 24 horas. Este revestimento impede a fixação das células durante o período de cultura.
- Dispensar a 50 ul de filtrado 5% (w / v) de fase aquosa de PEG em cada poço de uma placa de 96 poços (placa de destino).
- Usando uma pipeta, mistura da suspensão de células (preparado no passo 2 passo 3 ou para mono- e co-cultura, respectivamente) e adicionar 20 ul da suspensão a cada poço de uma outra coluna de uma placa de 384 poços (placa de fonte) .
- Ligue o manipulador de líquidos e "casa" a cabeça de pipetagem para registrar as coordenadas. Em seguida, elaborar um protocolo previamente definido (abaixo de 4.6) para garantir material de laboratório e os parâmetros são definidos corretaly. Este "homing" passo pode ser diferente para manipuladores de líquidos diferentes.
Nota: O fluxo do protocolo, mostrado passo-a-passo abaixo em 4.6, será semelhante independentemente do manipulador de líquidos robótico usado; no entanto, a interface de programação podem ser diferentes, devido à utilização de software diferente. - Colocar a placa de fonte, a placa de destino, e caixas de ponta da pipeta em posições definidas na estação de trabalho do manipulador de líquidos, tal como mostrado na Figura 1.
- Executar o protocolo que inclui os seguintes passos:
- Coloque uma coluna de barris de cabeça pipetagem do manipulador líquido com mistura pontas de pipeta (8 pontas) da estação de trabalho (Figura 1).
- Misture a suspensão de células em cavidades da placa de fonte (Figura 1). Escolher um volume de mistura menor do que o volume de suspensão de células em poços para evitar a formação de bolhas.
- Ejetar dicas em uma caixa de aterros vazio (Figura 1). Carregar uma coluna de barris de a cabeça de pipetagem com 10 ul de distribuição de pontas de pipetas (Figura 1).
- Aspirar 0,3 ul da suspensão de células a partir da placa de fonte (Figura 1) em cada ponta de pipeta.
- Dispensar a suspensão de células em cavidades de uma coluna da placa de destino (Figura 1). Utilize uma altura de distribuição de 0,5 mm e um caudal de distribuição de menores do que 1? L / seg.
- Repita os passos 4.6.1 4.6.6 através de impressão até a coluna-a-coluna para a totalidade da placa de destino é completa.
- Remover cuidadosamente a placa de destino a partir da superfície da estação de trabalho e colocá-lo numa incubadora húmida a 37 ° C e 5% de CO 2. Manter a placa horizontal quando o levar para a incubadora para evitar prejudicar o de gotas de fase DEX contendo células.
- Incubar a placa durante 24 h, para permitir a agregação de células num esferóide dentro da gota fase DEX.
Note-se que o protocolo seguinte é para um tratamento medicamentoso de 4 dias e inclui uma renovação com droga fresca após dia 2. Ela pode ser modificado para outros períodos de tratamento.
- Confirmar visualmente a formação de esferóides, em placas de 96 poços depois de 24 horas. Se necessário, poços de imagem para medição do tamanho de esferóides pela média das menores e maiores diâmetros de cada esferóide.
- Preparar a solução de stock de um medicamento desejado, dissolvendo-o num solvente recomendado pelo fabricante, a uma concentração pré-determinada a solubilidade. Por exemplo, dissolve-se a cisplatina em água a 2 mg / ml.
Nota: Proteja a solução estoque da droga da luz, se a droga é sensível à luz. - Usando a técnica de diluição em série, preparar as concentrações de droga diluídas com meio de cultura de células a partir da solução preparada no passo anterior. Cada diluição deve ser feita duas vezes a concentração desejada. Dilrácios ution irá variar dependendo da concentração do material de partida desejado e concentrações de trabalho.
- Adicionar 50 ul de solução de droga foi preparada na etapa anterior a cada poço. Isto pode ser realizado roboticamente ou por pipetagem manual.
Nota: Cada concentração de droga será diluído para metade, para a concentração desejada por 50 ul da fase aquosa PEG já em cada poço.- Use esferóides de duas colunas de uma placa de 96 poços (n = 16) para cada concentração.
- Em cavidades de controlo, adicionar apenas 50 ul de meio de cultura fresco aos 50 ul existentes da fase aquosa PEG.
- Incubar esferóides com o fármaco durante 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, protegido da luz.
- Após 48 horas de incubação, preparar diluições frescas de droga em concentrações desejadas e renovar droga por adição de 50 uL de solução de droga fresco a cada poço.
Nota: Os poços já conter a concentração da droga desejada a partir da primeira droga tratamento. Por conseguinte, nesta fase renovação, cada concentração é preparada na concentração desejada, desde que não irá ocorrer a diluição. - Incubar esferóides com a droga durante mais 48 horas a 37 ° C e 5% de CO 2, protegido da luz.
6. Análise de Viabilidade Celular em esferóides
- Após 48 horas de incubação com renovada droga (isto é, o tempo total de tratamento de esferóides com um fármaco é de 4 dias), medir o volume total do meio de um bem por pipetagem manual.
Nota: O volume típica em um poço é de ~ 140 mL (uma pequena diminuição ocorre devido à evaporação). - Calcular o volume de reagente a viabilidade das células (por exemplo, PrestoBlue) como a concentração de 10% do volume total do bem. Adicionar o volume de reagente a viabilidade das células para cada poço.
Nota: Com um volume de suporte existente de 140 pi de um poço, num volume de 15,6 uL é necessária para dar uma concentração de 10% do total bem. Este valor é calculadodividindo o volume de mídia existente por 9 (140 l / 9 = 15,6 ul). - Incubar a placa, com o reagente de viabilidade celular adicionada a cada poço, durante 6 h a 37 ° C, protegida da luz.
- Colocar a placa num leitor de micro-placa e ler o sinal de fluorescência a 560 nm e 590 nm de excitação e de emissão de comprimentos de onda, respectivamente.
- Calcula-se a percentagem de viabilidade de células em esferóides com a normalização do sinal fluorescente de poços tratados para os poços de controlo de que a média dos valores depois de as mesmas condições de tratamento.
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Representative Results
A estação de trabalho do manipulador de líquidos robótico é mostrado na Figura 1. A cabeça de pipetagem e todas as estações utilizadas na impressão robótico de esferóides na secção 4.6 são rotulados. A imagem mostra a utilização de duas estações diferentes para caixas de ponta (um conjunto de dicas para a mistura e o segundo conjunto para aspiração / dispensação de mistura fase DEX suspensão aquosa de células). Toda a configuração está alojado dentro de um armário de norma de segurança biológica para manter a esterilidade. A Figura 2 representa um esquema do processo de "impressão" com o sistema aquoso de duas fases. Uma ponta de pipeta carregado com a suspensão de células na fase aquosa DEX (azul, fase de modelação) é baixado para dentro de um poço de fundo redondo de uma placa de 96 poços contendo a fase aquosa de PEG (cor de rosa, a fase de imersão) para distribuir o seu conteúdo perto o bem inferior. A queda de fase DEX resultante restringe as células cancerosas de dispersão e encoraja as interacções célula-célula que resultam emagregação de células e formação de esferóide. Formação de esferóides é espontâneo e ocorre dentro de 24 horas de incubação, como mostra a imagem da Figura 2 experimental. Na prática, esta impressão é efectuada esferóide coluna-a-coluna em placas de 96 poços. Depois de formar esferóides, meio de cultura é renovado por adição directa de meio fresco, converter o sistema de duas fases a uma única fase aquosa. Esta transição é devido a redução nas concentrações de PEG e DEX abaixo de um limiar de concentração necessária para a separação de fases PEG e DEX aquosas.
Dispensar a partir de um mecanismo de deslocamento de ar convencional pipetagem do manipulador de líquidos foi parametricamente optimizado e verificou-se que uma altura de distribuição de 0,5 mm, uma taxa de fluxo de distribuição de menores do que 1 ml / seg, seguido por 0,2 mL de distribuição pré-volume de ar aspirado produz o tamanho mais consistente de DEX aquosa gotas, e, portanto, esferóides. dis 3a 23 Figuradesempenha as distribuições de diâmetro de 96 esferóides de uma placa com um diâmetro médio de 332 ± 31 mm. A experiência anterior mostra que esta abordagem gera tipicamente esferóides com 8% -10% de erro padrão em torno do diâmetro médio. A Figura 3b mostra a distribuição de diâmetro de esferóides da mesma placa de frequência como na Figura 3a, o que demonstra que os diâmetros estão normalmente distribuídos.
Em seguida, foi demonstrado o potencial desta abordagem para o rastreio de compostos em placas de 96 poços padrão e análise de respostas celulares nas mesmas placas, sem a necessidade de transferir os esferóides para novas placas. A Figura 4 mostra um estudo de dose-dependente da viabilidade de MDA esferóides de células de câncer de mama -MB-157 tratadas com um medicamento quimioterápico clínica, cisplatina. Esferóides tratados com a droga e de controlo foram incubadas com um reagente PrestoBlue comercial (reagente viabilidade celular). Células activas enzimaticamente reduzido a reagent e provocou uma alteração na cor de material e uma mudança no sinal fluorescente. A mudança de sinal foi maior com células vivas (por exemplo, em esferóides de controlo). A viabilidade das células cancerosas em esferóides diminuiu com o aumento da concentração de fármaco acima de 1 uM. Este teste resultou em 50% da dose letal LD50 de concentração de fármaco = 4,67 uM.
Esta tecnologia sistema aquoso de duas fases para a cultura em 3D permite a produção fácil de modelos de tumor mais realistas, incluindo outros componentes do microambiente celulares, tais como células de suporte do estroma. Demonstrou-se anteriormente que as células do estroma, incluindo culturas em 3D modula o crescimento, proliferação e invasão de células cancerosas 33-35. Como uma prova de conceito de esferóides experiência, a co-cultura foram gerados através da combinação de MDA-MB-157 da mama humano células cancerosas e fibroblastos humanos numa razão de 50: 1. 36. Antes das experiências, as células MDA-MB-157 e de fibroblastos foram coradascom um corante nuclear (azul) e corante de células vivas (verde), respectivamente, para permitir a detecção de células em imagens fluorescentes. A figura 5a mostra imagens fluorescentes e de fase de esferóides de co-cultura com uma densidade de 1,5 x 10 4 e uma de 50 células :. 1 proporção de células cancerosas e fibroblastos Figura 5b mostra esferóides de células MDA-MB-157 células de controlo para comparação. Esta abordagem permitirá a avaliação do efeito das células estromais em vários fenótipos de células cancerosas.
Plataforma de Manutenção Figura 1. Líquido. O manipulador de líquido consiste em estações onde mistura dicas, dicas de distribuição, caixa de dicas de resíduos, placa fonte, e os locais de placa destino são colocados. A localização de cada estação é definido no protocolo. Dicas de mistura são carregadas para uma coluna de a cabeça de pipetagem e usado para misturar a solução da fase aquosa DEX contendo as células na placa de fonte. Essas dicas são, então, eliminados na caixa de aterros e as pontas de distribuição são inseridos na mesma coluna da cabeça pipetagem. Estas pontas aspirar 0,3 ul da fase aquosa contendo DEX células a partir da placa fonte e dispensar-lo na placa de destino para formar gotas contendo células da fase DEX dentro da fase de PEG imersão já nos poços de placas de destino. Finalmente essas dicas também são eliminados na caixa de aterros para completar um ciclo de impressão.
Figura 2. Formação esferoidal. O manipulador de líquidos distribui 0,3 ul da fase aquosa DEX (azul) contendo células (verde) em uma cavidade contendo a solução aquosa de PEG (rosa). Isto resulta na formação de um esferóide após 24 h de incubação, como se mostra na imagem do lado direito. A barra de escala 200? M.tps: "target =" _ //www.jove.com/files/ftp_upload/52754/52754fig2large.jpg blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. esferoidal consistência de dados. (A) Distribuição de diâmetro de esferóides medidos a partir de uma placa de 96 poços, cada ponto representa um esferóide. (B) distribuição de freqüência de diâmetros mostra a distribuição normal dos dados.
Figura 4. Resposta de Drogas de esferóides. A viabilidade das células em células MDA-MB-157 esferóides de células de cancro da mama diminui com o aumento da concentração de cisplatina ao longo de 1 nM-200 uM gama. A linha a tracejado é um ajuste sigmoidal aos dados de viabilidade.
Figura 5. Co-Cultura Spheroids (a) Fluorescente (à esquerda) e de contraste de fase imagens (direita) de esferóides de MDA-MB-157 células de câncer de mama (azul) co-cultivadas com fibroblastos (verde) em um 50: 1. proporção. (B) Os esferóides de células MDA-MB-157 células são apresentados para comparação. Bar Scale 100 um. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Spheroids apresentar um modelo realista para compreender melhor a fisiologia tumor e eficácia da droga e fornecer uma ferramenta útil para anti-câncer de descoberta de drogas. Tais aplicações iria beneficiar muito de técnicas simples de geração e manutenção esferóide que exigem apenas o material de laboratório padrão, ferramentas de manipulação de líquidos e equipamentos de rastreio. O uso de um sistema aquoso de duas fases nas células cancerosas, espontaneamente agregados dentro da fase gota permite a produção eficiente e de manutenção de esferóides com manipuladores de líquidos robóticos, e no tratamento da toxicodependência situ e análise de ponto final da resposta celular com reagentes comerciais e ferramentas. Assim, esta tecnologia é uma vantagem importante sobre os métodos existentes de 3D culturas de células do cancro e apresenta uma plataforma para acelerar o rastreio de descoberta de drogas.
Gerando esferóides de tamanho uniforme dentro de uma placa de micro-bem é crucial para aplicações de rastreio de alto rendimento para assegurar uma linha de base semelhante ac celularnível de atividade em todos os esferóides. Usando manipuladores de líquidos com um mecanismo de deslocamento de ar pipetagem, é importante optimizar o processo de distribuição através da quantificação do efeito de parâmetros chave de manuseamento de líquido (dispensar altura, dispensar taxa de fluxo, e pré-volume de ar aspirado) no dispensador da fase aquosa DEX . Essa otimização permite que a cabeça de pipetagem para varrer a solução fase DEX viscoso e células cancerosas em poços e produzir esferóides homogêneos. Embora quantidades específicas para estes três parâmetros foram determinados no protocolo para o manipulador de líquidos SRT Bravo, uma abordagem semelhante deve ser empregada com outros manipuladores de líquidos para determinar as condições ideais de distribuição que resultam em tamanho de gota fase DEX consistente dispensado para a fase PEG imersão. Além disso, é possível utilizar 96 pontas e para imprimir simultaneamente esferóides em todos os 96 poços. Isto, no entanto, aumenta significativamente o número de células necessário para encher a placa com a fontede fase aquosa contendo células DEX. Independentemente da selecção de abordagens de impressão direcção de coluna ou de placa inteira, é crucial para misturar o conteúdo da placa de origem antes do passo de aspiração. Isto assegura que a suspensão de células na fase densa DEX é homogénea e reduz as variações no tamanho dos esferóides.
Vários estudos mostram que esferóides de células cancerosas imitar várias propriedades fundamentais de tumores avasculares, como morfologia e difusão limitações dos reagentes; portanto, eles apresentam um modelo fisiologicamente relevante para avaliar a eficácia de novos compostos e convencionais contra as células cancerosas em comparação com culturas de células em monocamada tradicionais. 8,17,18,21,23,37 Mostra-se que a abordagem aquosa do sistema de duas fases para produzir esferóides convenientemente permite o rastreio de fármacos na mesma placa, simplesmente pela adição e renovação de um composto de fármaco, em pontos de tempo desejados e rastreio automatizado de viabilidade celular utilizando um leitor de micro-placa padrão. Esteé uma importante vantagem sobre as técnicas tais como gotas de suspensão que exigiriam a transferência esferóides a uma placa padrão para a análise de respostas celulares a drogas 21 Além disso., sabe-se que as células de suporte no microambiente tumoral e as suas interacções com as células cancerosas estão implicados em vários fenótipos de células cancerosas malignas. 33-35,38,39 Portanto, a capacidade de gerar esferóides de co-cultura de células do estroma e do cancro que utilizam a tecnologia de duas fases aquosas ajudará a avaliar a influência de células de suporte do microambiente tumoral sobre as respostas de cancro células a vários tratamentos. A experiência de co-cultura realizados neste estudo serve como uma prova de conceito-se que esta tecnologia pode gerar êxito esferóides contendo células cancerosas e células estromais. Estudos futuros aproveitar essa capacidade e investigar características diferenciais de esferóides mono e co-cultivadas, como a proliferação de drogas e respostas. Além disso, estetecnologia oferece uma plataforma para imitar mais de perto o microambiente do tumor in vivo, através da inclusão de outros componentes do estroma tumoral no modelo 40.
Em resumo, este protocolo permite a formação espontânea de esferóides em placas de 96 cavidades sem o uso de qualquer força externa. A adaptação da técnica para um manipulador de líquidos robótico aumenta a velocidade e eficiência da produção de esferóide com um formato de alto rendimento padrão. A compatibilidade da tecnologia com a imagem comercial e ensaio analisa plataformas permite a utilização de diversos instrumentos disponíveis em laboratórios acadêmicos e industriais. Para aplicações futuras, este protocolo irá agilizar a seleção da droga com câncer 3D culturas de células de uma técnica de rotina. Além disso, esta abordagem pode ser facilmente modificado para formar esferóides de tamanhos diferentes, diferentes tipos de células, diferentes combinações de células cancerosas e do estroma em esferóides de co-cultura, e ser aumentada para um maior rendimento placas de micro-poços to acelerar ainda mais a seleção da droga anti-câncer.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Consumables | |||
| Polyethylene glycol, MW: 35,000 | Sigma-Aldrich | 94646 | |
| Dextran, MW: 500,000 | Pharmacosmos | 5510 0500 9007 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12306C | |
| Glutamine | Life Technologies | 35050-061 | |
| Antibiotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Clacein AM | Life Technologies | C3100MP | |
| Hoechst | Life Technologies | 33342 | |
| Cisplatin | Spectrum Chemicals | 15663-27-1 | |
| PrestoBlue | Life Technologies | A-13261 | |
| Pluronic F-108 | Sigma Aldrich | 542342 | |
| Disposable Tips (10 µl) | Fluotics | C-P10V11.ST | |
| Disposable Tips (70 µl) | Fluotics | C-P70V11.ST | |
| Round-bottom 96-well plates | Nunc | 268200 | |
| Equipment | |||
| Liquid Handler | Agilent Technologies | SRT Bravo | |
| Microplate Reader | Biotek Instruments | Synergy H1M | |
References
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