Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Scalable 96-brønns plate Basert IPSC Culture and Production Bruke en Robotic Liquid Handling System

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52755
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

Abstract

Fortsatt fremgang i pluripotent stamcellekultur lukke gapet mellom benk og sengen for å bruke disse cellene i regenerativ medisin, medisiner og sikkerhetstesting. For å fremstille stamcelle avledet biopharmaceutics og celler av vev og transplantasjon, er essensielt en kostnadseffektiv celle-produksjonsteknologien. Vedlikehold av pluripotency og stabil ytelse av celler i nedstrøms applikasjoner (f.eks celledifferensiering) over tid er viktig for storskala celleproduksjon. Likevel kan det være vanskelig å oppnå, spesielt hvis celler dyrkes manuelt, hvor operatøren kan innføre betydelig variabilitet, samt være prohibitivt kostbart å skalere opp. For å aktivere høy gjennomstrømming, storskala stamcelle produksjon og fjerne operatør innflytelse roman stamcelle kultur protokoller ved hjelp av en benk-top flerkanals væskehåndtering robot ble utviklet som krever minimalt med tekniker engasjement eller erfaring. Meddisse protokollene menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) ble dyrket i matefrie forhold direkte fra en frosset lager og opprettholdt i 96-brønners plater. Avhengig av cellelinjen og ønsket oppskalering rate, kan operatøren enkelt finne ut når du skal passering basert på en serie med bilder som viser de optimale koloni tettheter for splitting. Så de nødvendige reagenser er forberedt på å utføre en koloni split til nye plater uten sentrifugeringstrinn. Etter 20 passasjer (~ 3 måneder), to IPSC linjer opprettholdt stabile Karyotyper, uttrykt stamcellemarkører, og differensiert i cardiomyocytes med høy effektivitet. Systemet kan utføre påfølgende high-throughput screening av nye differensierings protokoller eller genetisk manipulering er utformet for 96-brønners plater. Denne teknologien vil redusere arbeidskraft og teknisk byrde å produsere et stort antall identiske stamceller for en myriade av applikasjoner.

Introduction

Bruken av menneskeskapte pluripotent stamceller (iPSCs) har økt betydelig siden deres avledning i 2007 1 for sammensatte testing, regenerativ medisin og sykdom modellering 2-6. Dette kravet kommer fra IPSC kapasitet til å gi et stort antall pluripotente celler som kan differensieres i somatiske celler på en enestående mengde. Som rettet differensiering teknikker forbedre 7-10 og utvikling av menneskelig celle eller vev modellering og celleterapi øker 11-14, så gjør behovet for masseproduksjon av høykvalitets iPSCs. Det er mye sitert som blant andre sykdommer, vil hjerteinfarkt eller b-celle funksjonell erstatning krever hundrevis av millioner til milliarder av IPSC avledet somatiske celler 15-18. Videre stadig mer komplekse 3D vev modellering for medisiner og therapy vil kreve et stort antall celler 9,13,19. I alle disse eksemplene, er definert, ensartede og reproduserbare iPSCs må være tilgjengelig og enkel å produsere.

For å fremstille stamcelle avledet biopharmaceutics og celler av vev og transplantasjon, er essensielt en kostnadseffektiv celle-produksjonsteknologien. Skalert produksjon av iPSCs har fokusert på suspensjonskultur 20 - 25 eller suspensjon med bruk av mikrobærer substrater 26-28 delvis fordi disse teknikkene er vellykket utplassert for storskala, ikke-IPSC, eukaryot basert produksjon. Flere grupper har demonstrert suspensjon dyrkingssystemer som gir pluripotente stamceller 20,21,23,24,29. Men disse metodene utnytte dyre og komplekse systemer ikke er lett tilgjengelige for forskere utvikler nye differensierings programmer, kjøring tissue engineering og gjør Laboratory skala forskning. Videre suspensjon og mikrobærer IPSC kulturer krever tilpasning og teknikker eller kjemikalier som ikke finnes i tradisjonell tilhenger IPSC kultur som kontinuerlig bruk av Rho-kinase inhibitor, antiskummidler og filtrering for å regulere aggregering. Fysisk stress til cellene er mer utbredt i suspensjonskultur, innført ved mekanisk agitering, så vel som i løpet av mikrobæreren kollisjon. Disse problemene begrenser forutsigbarheten og hastigheten som nylig genererte stamcellelinjene kan dyrkes i suspensjon. Andre har utviklet robot plate håndteringssystemer som etterligner platekulturteknikker 30,31, men disse plattformene kreve en betydelig investering for utstyr og kompetanse til å operere i tillegg til de grunnleggende utfordringer forbundet med stilk cellekultur.

Følgende arbeid beskriver utviklingen og praktiseringen av en skalerbar IPSC kultur system som utnytter en selvstendig, standard 8-kanals robot væskehåndterer og 96-brønners plater. Denne metoden ble utviklet for å bygge bro laboratorieskala IPSC kultur og høy-volum IPSC produksjon (for eksempel 10 7 til 1,5 x 10 9 celler per uke per tekniker) slik at de utvikler nye IPSC teknologi for enkelt å skalere opp produksjonen uten store hardware og arbeidstager investeringer. Denne fremgangsmåten er relativt billig å sette opp, krever lite eller ingen stilk cellekultur, programmering eller teknisk erfaring, har et lite fotavtrykk utstyr uten behov for en egen cellekultur hette, og benytter standard cellekultur utstyr for å muliggjøre middels til høy gjennomstrømning automatisert celleproduksjon. Målet var å utvikle et system som kan skaleres stamcelle kultur som kan benyttes av laboratorier nye til stamcelle kultur, de som finner manual kultivering en barriere for å utvikle sine ideer eller de som ønsker en økonomisk måte å produsere et stort antall stamceller. Plattformen som presenteres her fjerner tekniker innflytelse påstamcelle kultur og normaliserer fôring og passage prosedyrer for å aktivere konsekvent stamcelleproduksjon.

Protocol

Robotvæskehåndteringssystem, som i de følgende protokoller ble Gilson s pipetmaX, forenkler automatisert, skalerbar stilk cellekultur og produksjon og samtidig opprettholde tradisjonelle adherent kulturbetingelser i 96-brønners plateformat. Som tradisjonelle 6-brønns plate kultur, iPSCs dyrket med denne protokollen som et monolag av distinkte kolonier, men i 96-brønners plateformat. Hver brønn kan være isogen eller distinkt og enten konfigurasjon kan dyrkes i parallell siden roboten kan holde hverandre godt segregert. Den typiske robot IPSC kultur rutine har to faser: en fôring program der kulturer fôres på en passelig tidsplan og en passasje program der brukeren velger dissosiasjon metode og splitting forholdet dermed kontrollere seeding tetthet og skala rate. Følgende protokoller beskriver hvordan en ny kultur er startet, hvordan fôring og passasjen er dyktig og tilleggsprogrammer som letter IPSC kultur.

1. Klar Ekstracellulær Matrix Gel Coated 96-brønners plater

  1. Fjern emballasjen fra seks nye, RT 96-brønners plater og plassere dem på væskehåndtering robot seng i posisjonene 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se figur 1A etter seng stillinger).
  2. Plasser et pre-kjølt, 4 ° C 4-brønn bunnen i sengen posisjon 6.
  3. Load kolonne 12 av spissen rack i seng posisjon 1 med pre-kjølte, 4 ° C 200 mL pipette tips.
  4. Fyll første (venstre mest) trough godt i sengen posisjon 6 med 25 ml 4 ° C DMEM / F12 ved å helle en porsjon bruker steril teknikk. Alternativt kan du bruke en pipette til å fullføre overføringen.
  5. Fjern 96-brønners plate lokk og skyv hver i den spesiallagde plate lokket holder stativ (PLHR, se figur 1A). Unngå kontaktmed innsiden av platelokk.
    Merk: Håndtering på innsiden av en plate lokk eller stabling av platelokk, hvor innsiden av den ene lokket berører utsiden av en annen er en utmerket vei for forurensning.
  6. Bruke robot kontroll pekeplaten, trykk følgende rekke knapper for å starte godt pre-fukte prosessen:
    1. Trykk på «Kjør en Protocol".
    2. Velg "ekstracellulære matrise gel Prewet" og trykk neste.
    3. Bruker vedtak: Trykk "prøvekjøring" for å bruke trinn-for-trinn veiviser til pre-teste det valgte programmet.
      Merk: Roboten kjører ikke, men heller programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
    4. Trykker du på "Run Protocol".
  7. Under pre-fukte prosessen (trinn 1.6) videre til trinn 1.8.
  8. Tine på is en 4 mg porsjon av vekstfaktor redusert ekstracellulære matriks gel (GFRM) inneholdt i en 50 mlkonisk rør lagret ved -80 ° C. Hold delmengde på is inntil den er klar til bruk.
    Merk: GFRM stivner dersom det tillates å komme til romtemperatur og ikke vil være anvendelige.
  9. Resuspender 4 mg GFRM delmengde i 24 ml 4 ° C DMEM / F12 med en 25 ml glass pipette. Ved overføring av DMEM / F12, pause i 2-3 sekunder for å la pipette avkjøles før resuspending GFRM delmengde.
  10. Når pre-wetting prosessen (trinn 1.6) er fullført, fortsetter du til trinn 1.11.
  11. Overfør 24 ml DMEM / F12 GFRM blandingen til den fjerde brønnen på bunnen i sengen posisjon 6.
  12. Bruke robot kontroll pekeplaten, trykk følgende rekke knapper for å starte ekstracellulære matrise gel belegg prosess:
    1. Trykk på «Kjør en Protocol".
    2. Velg "ekstracellulære matrise gel delmengde" og trykk neste.
    3. Bruker vedtak: Trykk "prøvekjøring" for å bruke trinn-for-trinn veiviser til pre-teste det valgte programmet.
      Merk: Roboten kjører ikke, men Rather programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
    4. Trykker du på "Run Protocol".
  13. Når steg 1,12 er fullført, må du skifte plate lokkene.
  14. Overfør ekstracellulære matrise gel belagt 96-brønners plater til en 37 ° C, 5% CO 2, fuktet inkubator og hold det i 24 timer og da platene vil være klar til bruk eller lagres.
    Merk: I spesielle tilfeller kan den nylig belagte ekstracellulære matriks-gel plater brukes etter 15-30 minutters inkubering men O / N til 24 timers inkubering anbefales.
  15. Gjenta trinn protokoll 1,1, 1,3, 1,5-1,6, 1,10, og 1,12 til 14 inntil alt DMEM / F12 med GFRM benyttes.

2. Lagring Ekstracellulær Matrix Gel Coated 96-brønners plater

  1. Fjern ekstracellulære matriks-gel-belagte 96-brønners plater fra 37 ° C, 5% CO2, fuktet inkubator.
  2. Valgfritt: Allow den ekstracellulære matriks gel-belagte 96-brønners plater for å komme til romtemperatur før man fortsetter til punkt 2.3.
    Merk: Dette valgfrie trinn vil redusere kondensasjon bygge opp når platene er plassert ved 4 ° C.
  3. Plasserer platene på væskehåndteringsrobot seng i posisjonene 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se figur 1A for seng posisjoner).
  4. Load kolonne 12 av spissen rack i seng posisjon 1 med RT 200 mL pipette tips.
  5. Plasser en fire trau reservoar i sengen posisjon 6.
  6. Fyll vel 4 (lengst til høyre) av reservoaret med RT DMEM / F12.
  7. Fjern 96-brønners plate lokk og skyv hvert inn i PLHR.
  8. Bruke robot kontroll pekeplaten, trykk følgende kombinasjon av knapper:
    1. Trykk på «Kjør en Protocol".
    2. Velg "ekstracellulære matrise gel delmengde" og trykk neste.
    3. Bruker vedtak: Trykk "prøvekjøring" for å bruke trinn-for-trinn veiviser til pre-teste det valgte programmet.
      Merk: robot kjører ikke, men heller programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
    4. Trykker du på "Run Protocol".
  9. Når prosessen er ferdig, bytt plate lokkene og fjerne platene fra maskinen sengen.
  10. Vikle rundt hele siden av hver ekstracellulær matriks gel belagte 96-brønners plate (hvor lokket møter plate) med en tomme x 6 tommer parafin filmstrimmelen. Pass på å strekke parafin film for å skape en lufttett.
  11. Valgfritt: Etikett platene med dato for gjennomført ekstracellulære matrise gel belegg, ekstracellulære matrise gel partinummer, brukernavn og annen informasjon.
  12. Oppbevar platene ved 4 ° C hvor de vil være bra å bruke i opptil to uker.
    Merk: Platene har blitt brukt utover den to ukers grense, er det imidlertid ikke anbefalt.

3. Utføre en Stem Cell Colony Seeding DensityGradient i 96-brønns plate Format fra en Live eller Frozen Kultur: Hvordan starte eller gjenopprette normal Passage Intervaller til en stamcellelinje

  1. Hvis du starter med en frossen kultur, fortsett til trinn 3.2. Hvis du starter med en live stamcelle kultur allerede på en plate, begynner du med trinn 3.5.
  2. Tine den frosne kultur ved å svinge røret i en 37 ° C vannbad til bare en liten isklump gjenstår.
  3. Valgfritt: Fortynn cellene tint i 10 ml RT stamcelle vekstmedier (SCGM), sentrifuge i 2 minutter ved 300 xg, bortsuging av supernatanten og resuspender media stammen cellepelleten i 7 ml frisk SCGM inneholdende 10 pM Y27632.
    Merk: Dette trinnet eliminerer overføring av frysing media.
  4. Gå til trinn 3.6.
  5. Hvis du starter med levende, allerede belagt stamceller: passage cellene som normalt bruker enzymatisk eller ikke-enzymatisk dissosiasjon. Prøv å høste totalt 1,5 til 3.000.000 celler; vanligvis en brønn av seks-brønners plate. Sentrifuger høstet celler for2 min ved 300 xg, aspirer supernatanten media og resuspender stamcelle pellet i 7 ml frisk SCGM inneholder 10 mikrometer Y27632. Gå til trinn 3.6.
  6. Sørg for cellene, enten fra en frossen eller live kultur, er suspendert i 7 ml RT SCGM med 10 mikrometer Y27632.
  7. Load kolonne 12 av spissen rack i sengen stilling ett med RT 200 mL pipette tips.
  8. Plasser en fire trau reservoar i sengen posisjon 2.
  9. Plasser en ny ekstracellulære matrise gel belagt 96-brønns plate forvarmes til 37 ° C i sengen posisjon 5 og ta av lokket plassere den i PLHR.
  10. Overfør 7 ml resuspenderte celler til vel 3 av reservoaret ved hjelp av en pipette eller steril hell.
    1. Bruke robot kontroll pekeplaten, trykk følgende kombinasjon av knapper:
    2. Trykk på «Kjør en Protocol".
    3. Velg "Seeding Tetthet Gradient" og trykk neste.
    4. Bruker vedtak: Trykk "prøvekjøring" for å bruke trinn-for-trinn veiviser til pre-teste velged program.
      Merk: Roboten kjører ikke, men heller programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
  11. Trykker du på "Run Protocol".
  12. Når fortynningsserie er fullført, dekker platen og legges i en 37 ° C, 5% CO2, fuktet inkubator før neste foring.
  13. Valgfritt: Label plate med dato, stamme informasjon, brukernavn, medietype og annen relevant informasjon.
  14. I løpet av de neste dagene, mate 96-brønns plate etter behov ved hjelp av protokoll 4 nedenfor.
    Merk: En typisk stamcelle plate vil kreve en full media endring en gang hver 24 time og SCGM ikke inneholder Y27632 for fôring; bare under den innledende seeding etter passering. Før fôring, sjekk plate for forurensning og kolonien tetthet. Se trinn 3.16 for mer om overvåking av kolonien tetthet.
  15. I løpet av de neste dagene, flere kolonner nær cgå inn på plate (vanligvis søyler 5-8) vil nærme en ideell tetthet for passering; å identifisere denne tetthet, sammenligner den 96-brønns plate i tetthetsområdet er vist på figur 3B med følgende informasjon i tankene:
    1. Passasjen når mellomrommet mellom flertallet av koloniene er omtrent 25% av tilstøtende koloni diameter.
      Merk: Begrunnelsen for å identifisere tidspunktet for passasjen er at en annen syklus av foring og vekst vil resultere i kolonier som er i kontakt, noe som bør unngås.
  16. Slik starter du en jevnt utvannet plate og begynne vanlig kultur, velge en kolonne som er på den ideelle tetthet og passage. Se protokoll 5 til passering.

4. Fôrings 96-brønns plate Stem Cell Colonies

Merk: Følgende protokollen beskriver fôring av en 96-brønns stamcelle koloni plate. Teknikken kan skaleres opp til å romme 6 totalt plater i parallell.

  1. Fjern 96-brønners stem celle koloni plate fra 37 ° C, 5% CO2, fuktet inkubator.
  2. Sjekk plate for forurensning og celletetthet. For å mate, sikre at kolonien tetthet er under ideelle passasje tetthet. Se figur 3B for informasjon om tetthet.
    Merk: Forurensning kan presentere som grumsete media og være ledsaget av en ubehagelig lukt. Små, åpenbart ikke-IPSC aggregater kan også være synlig under mikroskopisk undersøkelse. For å evaluere celletetthet, se trinn 3.16.1 ovenfor.
  3. Plasser 96-brønners stamcelle koloni plate i sengen stilling 3 på en skrå, 37 ° C rampe.
  4. Load kolonne 12 av spissen rack i seng posisjon 1 med RT 200 mL pipette tips.
  5. Plasser en 4-brønn bunnen i sengen posisjon 2.
  6. Fyll vel 3 av bunnen i sengen posisjon 2 med 8 ml frisk, RT SCGM uten Y27632 enten ved steril øse eller pipette overføring.
  7. Fjern 96-brønns stamcelle koloni plate lokk plassere den i PLHR.
  8. Brukerobotic kontroll touch pad, trykk følgende kombinasjon av knapper:
    1. Trykk på «Kjør en Protocol".
    2. Velg "Colony feed One Plate" og trykk neste.
    3. Bruker avgjørelse: trykk på "testkjøring" for å bruke trinn-for-trinn veiviser til pre-teste det valgte programmet.
      Merk at roboten kjører ikke, men heller programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
    4. Trykker du på "Run Protocol".
  9. Når mate protokollen er fullført, dekker 96-brønners stamcelle koloni platen og tilbake til 37 ° C, 5% CO2, fuktet inkubator inntil neste foring eller passasje er nødvendig. Dette er vanligvis nødvendig for etter 24 timer.
    Merk: Det anbefales å registrere fôring hendelsen på plate dekselet med dato, medietype, brukernavn og annen relevant informasjon.

5. aging 96-brønns Plspiste Stem Cell Colonies

  1. Etter flere fôringssykluser 96-brønns stamcelle koloni plate vil være klar til passering. Denne protokollen beskriver passasje av en kolonne til en 96-brønns plate, som representerer en 01:12 deleforhold. Brukeren kan definere split ratio og velge et antall brønner eller kolonner for å splitte, inkludert valg brønner som kanskje ikke er tilstøtende.
  2. Sammenligne den 96-brønns stamcelle koloni plate tettheten til figur 3B for å avgjøre om det skal passasje. Den ideelle passasjen tetthet er da avstanden mellom flertallet av koloniene er omtrent 25% av tilstøtende koloni diameter eller en etterfølgende mating vil resultere i koloniene som vokser inn i hverandre.
  3. Undersøke 96-brønners stamcelle koloni plate under et mikroskop for å sikre at det ikke er noen forurensning.
  4. Plasser 96-brønners stamcelle koloni plate i sengen stilling 3 på en skrå, 37 ° C rampe.
  5. Load kolonner 8-12 i spissen lastestativ i senga posisjon 1 med RT 200 mL pipettetips.
  6. Plasser en 4-brønn bunnen i sengen posisjon 2.
  7. La renne godt en tomt, legger 8,5 ml SCGM + 10 mm Y27632 i vel to, satt 3,5 ml 30% proteolytisk og kollagenolytisk dissosiasjon reagens (eller EDTA basert dissosiasjon reagens) i vel tre, satt 4,5 ml PBS i vel fire.
    Merk: Alle reagensene kan være ved romtemperatur eller 37 ° C. RT proteolytisk dissosiasjon og kollagenolytisk reagens ved 30% fortynnet med PBS ble brukt til fettvev og Fibroblast avledet IPSC kultur beskrives her.
  8. Plasser en ny, forvarmet 37 ° C ekstracellulær matriks gel belagte 96-brønners plate i sengen posisjon 5.
  9. Fjern 96-brønners stamcelle koloni plate lokk, så vel som den nye 96-brønns plate lokket og plassere dem både i PLHR.
  10. Bruke robot kontroll pekeplaten, trykk følgende kombinasjon av knapper:
    1. Trykk på «Kjør en Protocol".
    2. Velg "Colony Split 01:12 Kolonne 1" og trykk neste.
    3. Bruker vedtak: Trykk "prøvekjøring" for å bruketrinn-for-trinn veiviser til pre-teste det valgte programmet.
      Merk: Roboten kjører ikke, men heller programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
    4. Trykker du på "Run Protocol".
  11. Når passasjen protokollen er ferdig, re-dekke begge platene.
  12. Valgfritt: Label ny plate med den nødvendige informasjonen (dvs. dato, cellelinje, passasje nummer, medietype, brukernavn osv).
  13. Returnere begge platene til 37 ° C, 5% CO2, fuktet inkubator inntil neste foring eller passasje er nødvendig. Merk: Den neste fôring er vanligvis etter 24 timer.
    Merk: Celler og kolonier bør legge til plate innen 2-3 timer av splitting og ser veldig spredt. Dette er på grunn av tilstedeværelsen av Rho-kinase inhibitor, og cellene vil kondensere og oppviser den karakteristiske stamcelle morfologi (dvs. brostens pakket kolonier with småcellet volum til store kjernen ratio) etter første Rho-kinase inhibitor mating.

6. Høsting 96-brønns plate stamceller for Produksjon

Merk: Stamcelle kolonier kan høstes for bruk på noe tidspunkt under kultur. Vanligvis oppstår når cellene er klare til passasjen (se protokoll 5). Denne protokollen beskriver hvordan du høste elleve kolonner fra en 96-brønns stamcelle koloni plate.

  1. Undersøke 96-brønners stamcelle koloni plate under et mikroskop for å sikre at det ikke er noen forurensning.
  2. Plasser 96-brønners stamcelle koloni plate i sengen stilling 3 på en skrå, 37 ° C rampe.
  3. Last kolonner 11 og 12 i spissen lastestativ i senga posisjon 1 med RT 200 mL pipette tips.
  4. Plasser en 4-brønn bunnen i sengen posisjon 2.
  5. La renne godt en tomt, legger 8,5 ml SCGM i vel to, satt 3,5 ml 30% proteolytisk og kollagenolytisk dissosiasjon reagens (eller EDTA basert dissosiasjon reagens) i tillegg3, satt 4,5 ml PBS i vel fire.
    Merk: Alle reagensene kan være ved romtemperatur eller 37 ° C.
  6. Fjern 96-brønns stamcelle koloni plate lokket og plasser i PLHR.
  7. Bruke robot kontroll pekeplaten, trykk følgende kombinasjon av knapper:
    1. Trykk på «Kjør en Protocol".
    2. Velg "Colony Harvests Kolonner 2-12", og trykk neste.
    3. Bruker vedtak: Trykk "prøvekjøring" for å bruke trinn-for-trinn veiviser til pre-teste det valgte programmet.
      Merk: Roboten kjører ikke, men heller programvaren tester protokollen for programvareproblemer. Med etablerte protokoller, tappe, "hoppe over oppsett" er akseptabelt.
    4. Trykker du på "Run Protocol".
      Merk: Når samlingen prosedyren er fullført, vil cellene være i trau vel to og klar for samlingen.

Representative Results

Utvikling av en plate basert robot stilk cellekultur plattform.

Etterspørselen etter iPSCs er økende på grunn av deres nytte i utvikling av legemidler og regenerativ medisin. Likevel skalerbar produksjon har fokusert på suspensjonskultur 32 i relativt komplisert utstyr som ekskluderer mange forskere og avviker fra etablerte heft kultur metoder. Snarere enn å drastisk forandre bevist plate basert stamcelle kultur metoder, som for eksempel å bytte til en suspensjon kultur eller ved hjelp av en mikro fokuserte vi på miniaturizing og automatisere våre eksisterende heft IPSC kulturteknikker. Det første målet var å automatisere fôring og passaging å normal hele kulturen prosessen. En plattform i stand til hurtig skala opp med eksisterende teknologi er også nødvendig. For å oppnå disse målene en metode ble utviklet for å kultur stamceller i en 96-brønns plate ved anvendelse av en automatisert væskehåndteringssystem (figur 1). Den protocols utviklet her med væsken håndteringsrobot for mating og passasjen ikke krever et sentrifugeringstrinn eller kontinuerlig overvåking av en tekniker. Disse protokollene ble utviklet med to mater gratis IPSC linjer; en avledet fra fibroblaster og den andre fra 33 adipose celler.

Den datastyrte væskehåndteringssystem (figur 1A) består av en plan som beveger seg foran og bak. Sengen har ni, ca 5 x 3,3 tommer nummererte fordypninger med press klemmene for å godta standardcellekulturplater, flytende reservoarer og annen tilpasset maskinvare. Pipetten hodet beveger seg fra venstre til høyre (vinkelrett til sengs bevegelse) samt opp og ned. Sammen med sengen, kan pipetten hodet programmeres til å fjerne eller levere media hvor som helst på senga etter å plukke opp pipetter fra en fylles rack. Om nødvendig, kan hver av de 96-brønner holdes atskilt for å eliminere smitteoverføring. I den foreliggende konfigurasjon, 0 til200 ul media kan flyttes ved hver spissen av pipetten hodet, men andre volumserier er mulig basert på tips størrelse.

Ved passering stamceller i standard plater, enzymatisk eller kjemisk dissosiasjon typisk krever inkubasjon ved 37 ° C. Innledende tester bekreftet dissosiasjon med et proteolytisk dissosiasjon og kollagenolytisk reagens eller en EDTA-basert reagens utføres bedre ved 37 ° C RT både for tid til dissosiasjon og homogeniteten av kolonistørrelse produsert for de to 96-brønners IPSC linjer (data ikke vist). Å automatisere splittet prosessen og unngå å flytte platene inn og ut av en inkubator, skrå, temperaturkontrollert ramper som godtar og reproduserbart posisjonere standard kulturplater ble bygget (figur 1A). Når rampene ble oppvarmet til 37 ° C, et proteolytisk dissosiasjon og kollagenolytisk reagens eller EDTA basert dissosiasjon av iPSCs fra 96-brønners plater var sammenlignbare plater som er plassert i en 37 ° C inkubator (data not vist). De skrå ramper ble også benyttet for å muliggjøre pipettespisser for å samle inn en hel brønn innhold (mindre enn 5 ul restvolum) ved å nå det laveste punkt i brønnen, mens aspirasjon fra en flat plate igjen et restvolum på omtrent 10 til 15 ul, noe som resulterer i celle tap. Den skrånende rampe også tillatt brønnene som skal vaskes (triturert) ved å ta ut media ved toppen av den skrånende brønnen og å samle den på bunnen.

Robot kultur av stamceller i 96-brønners plateformat; fôring og passaging.

Culture of iPSCs ved hjelp av robotvæskehåndteringssystemet har to faser; passasje og fôring. Når en koloni er klar til passasje, blir den oppdelt i et forutbestemt forhold for å pode en ny plate som deretter tilføres med jevne mellomrom inntil den er klar til passasjen igjen (figur 1B). Frosne eller ikke-96-brønners kulturer kan startes i 96-brønners format og umiddelbart inn i passasjen / feedsyklus. Celler som ikke brukes til å opprettholde koloni, som er de fleste av en plate, høstes for andre formål og som representerer produksjonen komponent av dette system.

Mate 96-brønners kultur iPSCs er oppnådd når noen eller alle av mediet blir fjernet etter en periode av kultur og deponert i avfallsreservoaret. Deretter friskt medium blir alikvotert i den samme plate. Roboten kan bruke nye tips og medierennene for å skille hvert godt for fullt tilpass fôring, inkludert blending betinget media med nye medier.

Typisk passasje av stamceller krever en metode for dissosiasjon og ofte et sentrifugeringstrinn. Protokollene er beskrevet her tar sikte på å normalisere dissosiasjon og eliminere sentrifugering. Passasjen protokollen begynner når roboten leverer dissosiasjon reagens til 96-brønners plater som er montert på 37 ° C skrå ramper. Etter en forhåndsinnstilt tid, er de dissosierte cellene samlet inn med en vaske handling hvor brukeren har control i stillingen, repetisjon, volum og utgnidning hastighet. Enzyme tid, triturering hastighet og antall repetisjoner Triturerings var tilstrekkelig til å variere dissosiert kolonistørrelse og homogeniteten (figur 2), men hver parameter er justerbar for å passe til en gitt cellelinje krav. Denne kontrollen fjerner variasjon introdusert av teknikere som pipette med varierende priser, posisjoner og repetisjoner. Når de dissosierte cellene ble oppsamlet og slått sammen i et reservoar med friskt medium, de er distribuert til en ny plate. For å unngå sentrifugering og poding problemer fra substratet nedbrytning eller celledød som følge av enzymvirkning, ble dissosiasjon reagens fortynnet til minimumspunktet av akseptabel dissosiasjon som resulterte i pålitelig seeding. Denne teknikken var effektiv for et proteolytisk dissosiasjon og kollagenolytisk reagens i mTeSR1 medium 34, som har et forholdsvis høyt proteininnhold, men også effektive i lave protein medier som Essential-8 35

Kontrollere seeding tetthet av stamceller etter passering er viktig å rutine og vellykket stamcelle kultur. Poding for lavt eller for høyt, kan det føre til ektopisk differensiering og tap av pluripotency i tillegg til å forårsake uregelmessige passasje intervaller. Typisk stilk cellekultur avhengig av forholdet splitting der en brønn i en 6-brønns plate som grunnlag et helt nytt 6-brønns plate (en 1: 6 splitt). Med væskehåndtering roboten dette forholdet kan justeres for å passe behovene til brukeren (for eksempel, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc.), og den har den mest innflytelse på passasjen intervallet. Roboten kan høste mindre enn en kolonne, en hel kolonne (8 brønner), eller mer enn en kolonne avhengig av brukerens behov, som skal bestemmes empirisk. De adipose og fibroblast utledet iPSCs opprettholdt en vanlig tre dagers fôring tidsplan med passasje på den fjerde dagen da splitte 01:12. I dette tilfellet en kolonne ble høstet og anvendt for poding av en ny 96-brønners plate, og skaper en 01:12 delt med hver behandlingssyklus (figur 3A). De resterende 11 brønner var da tilgjengelig for nedstrøms applikasjoner. Å høste disse 11 produksjonsbrønner, ble passasjen protokollen gjentatt bortsett fra cellene ble avsatt i et trau for samlingen. Alternativt kan cellene bli liggende på platen og anvendes direkte.

For å oppnå konsistente seeding tetthet passasje til passasjen uten å telle, og opprettholde en rutine splitting tidsplan, våre protokoller ringe for å splitte den samme forhåndsbestemt antall kolonner når kolonien er på en ideell tetthet for passasje. For å hjelpe brukerne med å identifisere riktig tetthet for passasje, ble en serie med bilder som genereres som viser et utvalg av tettheter med en ideell passasje tetthet markert (figur 3B). For å bestemme når man skal passasje, undersøker en tekniker deres plate og sammenligner det med tettheten bildeskalaen. Ideenl tettheten til passasje ble bestemt fra kulturen av adipose og fibroblast avledet iPSCs og funnet å være når avstanden mellom de fleste kolonier var omtrent 25% av tilstøtende koloni diameter. Det er viktig at koloniene blir homogent fordelt. Denne mengden koloni separasjon korrelerer med den maksimale ønskelige tetthet fordi en ekstra fremføringssyklus ville resultere i kolonier rørende, noe som er en utløser for ektopisk differensiering.

En nødvendig protokoll utviklet her omhandler hvordan du starter en kultur i 96-brønners format og hvordan du nullstiller en kultur etter en tetthet problem. Når en ny kultur er startet, best seeding tetthet og antall av mate sykluser før aging er ukjent. For å sikre en brukbar densitet etter såing, distribuerer roboten eksisterende eller opptinte celler over en 96-brønners plate i en seriell fortynning (figur 4A). Eksempel resultatene av en slik gradient er vist i figur 4B-E. Etter gjentatte fôringsykluser, noen kolonner nærmer ideelle tetthet å splitte, noe som medførte at en tekniker bruker roboten til frø et jevnt utvannet plate å starte vanlig kultur. Denne tetthetsgradient protokollen ble også anvendt til å gjenopprette jevne mellomrom passasje og koloni homogeniteten til en uregelmessig plate. Hvis passasjen blir forsinket eller savnet, koloni tetthet og størrelse blir for høyt, mens hvis passasjen er for tidlig, er for lav kolonien tetthet og individuelle kolonier kan bli for stor uten å bli jevnt fordelt over brønnen. Densitetsgradienten protokollen løser disse problemene og lar brukeren starte ved å plukke en ideell seeded sett brønner.

To IPSC linjer forble pluripotent etter 3 måneder med robot kultur.

Vedlikehold av stamcelle pluripotency kan bli negativt påvirket av dyrkningsforhold 36,37. Å vurdere om fettvev og fibroblast utledet IPSC linjer (a-IPSC, f-IPSC, henholdsvis) opprettholdt pluripotency når de dyrkes robot i 96-brønners plater i en lengre periode, to linjer ble dyrket på væskehåndteringsrobot som beskrevet ovenfor for 3 måneder, og deretter pluripotency markører ble undersøkt. For denne perioden begge linjene ble passert med et proteolytisk dissosiasjon og kollagenolytisk reagens som er større enn 20 ganger uten sentrifugering. Faste 96-brønners plater fra en-IPSC og f-IPSC linjer farget for Oct4 og Nanog oppviste atom akkumulering av disse markørene mens SSEA-4 ble observert på celleoverflaten (figur 5A-L). Dette er konsistent med tidligere rapporter for pluripotente iPSCs 38-41. Kontra med DAPI avdekket ingen ekstra celler som ikke var positivt for de tre pluripotency markører. Kromosomale abnormaliteter blir ofte observert under stamcellekultur 42,43, men kan ikke påvirke fordelingen av pluripotency markører som de som er vist i figur 5A-L. Karyotype analyse avdekket både robot passaged IPSC linjer hadde 46 normale kromosomer, noe som tyder på robotdyrkingsmetoden ikke presentere kromosom ustabilitet utover hva som kan normalt skje (figur 5M-N).

Å sondere etablert stamcelle genuttrykk markører 1,41,44,45 i robot dyrkede IPSC linjer, ble total RNA samlet inn parallelt med flekker og karyotype analyse. Begge 96-brønns plate IPSC linjer hadde lignende uttrykk for pluripotency markører Nanog, POU5F1 og REX1 mens cardiomyocytes differensiert fra hver linje ikke, heller ikke en egen linje av humane dermale fibroblaster (HDFs) (figur 6). De cardiomyocytes avledet fra begge linjene var MYL7 positive mens HDFs og stamceller uttrykte ikke MYL7. Begge IPSC linjer ble differensiert i kardiomyocytter med lite molekyl, Wnt pathway manipulasjon teknikken beskrevet nylig 46 (figur 7). Differensiering til kardiomyocytter i 96-brønners format var vellykket i mer enn 80% av brønnene (data ikke vist). Sammen utgjør disse data tyder på 3 måneder og mer enn 20 passeringer av robot kultur resulterte i kromosomer normale celler som utviser en transkripsjon program i samsvar med pluripotency som også var i stand til differensiering i kardiomyocytter.

Figur 1
Figur 1. Oversikt over robotstamcelle kultur utstyr og typisk IPSC kultur rutine. (A) Robotic flytende håndteringssystem vist med vanlig seng layout for 96-brønn stamcellekultur. Nye sterile pipettespisser (Tips), flyttbare tips avfallsbeholder (Waste), multi-brønn autoklaver trau å holde nødvendige flytende reagenser (Liquids), 96-brønners plater er plassert en d støttet på en temperatur kontrollert, skrå rampe (96-brønners plater), 8-kanals robot pipette hodet som beveger seg til venstre / høyre og opp / ned (Pipet hodet). Plate lokket holder stativ (PLHR). Bed posisjonsnummer er vist nedenfor i tabell. (B) Robotic IPSC kultur har to faser: Fôring og Passage. Syklusen av celleproduksjonen starter når en koloni platen er klar til å passasje. Brukeren velger det ønskede forhold til passasjen i og roboten frøene en ny gruppe av 96-brønners plater ble deretter tilført ved regelmessige intervaller inntil den er klar for passasje igjen. Når platene er klar til passasjen, er det meste av hver plate ikke brukes til frø følgende koloni platene, og er tilgjengelig for andre anvendelser, slik som representerer produksjonsfase av systemet. Frosne eller eksisterende cellelinjer kan bli introdusert til enhver tid og vedlikeholdes i fôret / passasje syklus. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

e_content "fo: keep-together.within-side =" always "> Figur 2
Figur 2. Robotvæskebehandlingsparametre kan benyttes for å kontrollere IPSC koloni dissosiasjon egenskaper. Hver representativt bilde viser fibroblast avledet iPSCs dissosiert etter den indikerte behandling mens de fortsatt suspendert i 96-brønn. (Øverste linje, A - C) Enzyme Time, ingen utgnidning. Fibroblast avledet iPSCs dyrket i 96-brønners plater ble utsatt for økende tider av proteolytiske og kollagenolytisk dissosiasjon reagens dissosiasjon og ingen robot utgnidning ble utført. (Middle Row, D - F) Triturering hastighet, 3 minutter enzym. Celler ble utsatt for tre minutter av proteolytiske og kollagenolytisk dissosiasjon reagens behandling og deretter 175 ul vekstmedium ble anvendt, og hver brønn pipettert opp og ned en gang på den angitte hastighet. il / sek = mikroliter per andre. (Nederste linje, G - I) Triturering Repetisjoner, 3 minutter enzym, 160 mL / sek. Celler ble eksponert for proteolytisk og kollagenolytisk dissosiasjon reagens i 3 minutter, ble 175 ul vekstmedier brukt, deretter gnidd på 160 mL / sek til angitt antall repetisjoner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Typisk adipose og fibroblast IPSC koloni vedlikehold ordning og en serie av kolonitettheten bilder for å bestemme når man skal passasje for å opprettholde en regelmessig mating / passasje syklus. (A) og med en fett eller fibroblast 96-brønners IPSC koloni klar til passasjen, en kolonne av celler ble passert på roboten uten sentrifugering og fortynnet12 nye kolonner som ble matet med bestemte intervaller etterpå før platen var klar til passasjen igjen. For celleproduksjon, ble kolonnene ikke brukt til å opprettholde kolonien passert og samles for senere bruk. Ethvert antall kolonner kan passaged å styre ekspansjonsrate. (B) For å bestemme når man skal passasje, en serie med tetthetsbilder tatt hver 24 time ble gitt til brukerne. I den øverste røde boksen (innen 72 timer etter første seeding) kolonien er ikke tett nok til passering og skal fôres. Når densiteten er den samme som er vist i den grønne boksen (ved ~ 96 timer), er kolonien på en ideell tetthet for passasje. Av 120 HR, er kolonien for tett til passasjen og dette scenariet bør unngås. Sistnevnte kan løses med en seeding densitetsgradient men rutine kultur på denne tettheten på det sterkeste. Hvit bar tilsvarer 200 mikrometer. Klikk her for å vise større versipå denne figuren.

Figur 4
Figur 4. 96-brønners kulturrobotsystem gjør det mulig å starte fra kulturer fryst eller aktive cellelinjer og utføre en seeding gradient. (A) En celle oppløsning fremstilles av brukeren fra en frossen celle lager eller etter høsting en aktiv kultur og plassert på roboten. Den robotsystem utfører deretter en seriefortynning protokoll for å fordele det opprinnelige celleløsning langs den 96-brønns plate med gradienten tetthet distribuert av kolonnen. (B - E) Eksempler på celletetthet fra fire av de tolv kolonnene A, 48 timer etter densitetsgradienten seeding protokollen. Hvite linjer lik 225 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

Figur 5
Figur 5. pluripotency opprettholdes for fettvev og fibroblast utledet IPSC linjer under 96-brønn robot kultur for 22 (adipose) eller 23 (fibroblast) passasjer (~ 3 måneder). (A - L) Adipose og fibroblast utledet IPSC cellelinjer var robot matet og passert som beskrevet i teksten uten sentrifugering i 96-brønners plater for 22 eller 23 passasjer og deretter fiksert og farget for pluripotency markører Oct4, Nanog, eller Ssea4 med DAPI counterstain. Hvit bar tilsvarer 100 mikrometer. (M - N). Parallelle kulturer til de som er beskrevet i A ble sendt inn for karyotype analyse som viste en normal bemanning av 46 kromosomer Klikk her for å se en større versjon of denne figuren.

Figur 6
Figur 6. Fett (96-A) og fibroblast (96-F) avledet iPSCs dyrket i mer enn 20 passeringer i 96-brønners format robotvedlikeholdt pluripotency genekspresjon og differensiert i kardiomyocytter. Totalt mRNA ble ekstrahert fra begge robot dyrkede IPSC linjer samt kardiomyocytter differensiert fra begge linjene (CM-a = adipose IPSC kardiomyocytter avledet, CM-F = fibroblast IPSC kardiomyocytter avledet, oppsamlet 14 dager etter differensiering induksjon) og benyttet for RT-PCR for å probe pluripotency markører Nanog, POU5F1, REX1, cardiomyocyte markør MYL7 og lasting kontroll GAPDH. Menneskelige dermale fibroblaster (HDF) ble også samlet inn og brukt som et ikke-IPSC, non-cardiomyocyte kontroll. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7
Figur 7. Fibroblast og adipose avledet iPSCs opprettholdt evnen til å differensiere til kardiomyocytter etter langtids 96-brønners robot kultur (A - H). Fettvev og fibroblast iPSCs dyrket i 96-brønners format for robot mer enn 20 passeringer ble differensiert i kardiomyocytter . 14 dager etter differensiering induksjon, ble 96-brønns plate bundet kardiomyocytter dissosiert og replated til en lav tetthet på glassplater for farging av troponin T (red), F-aktin (grønn) og kjerner (blå). Klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Figur 8. Oppskalering 96-brønns plate stilk cellekultur. Scale opp stamcelle produksjon er avhengig av antall plater som grunnlag for etterfølgende gruppen av plater. Brukeren kan enten opprettholde et nivå av produksjon aging samme antall plater i hver splitt eren eller øke produksjonen ved såing av flere plater. For eksempel, i syklus 0, blir en 96-brønns plate passeres til tolv nye plater (syklus 1), og skaper en 12 gangers ekspansjon. Denne hastigheten kan opprettholdes hvis en av de tolv plater er passert i et nytt sett av tolv plater (syklus 1 til 2) eller ekspandert ved aging flere plater (syklus 2 til 3). Under passasjen, noen plater som ikke brukes for å opprettholde kolonien er tilgjengelige for nedstrøms applikasjoner. Derfor aging 12 plater rutinemessig kan gi så mange som 144 plater i to passeringer: 12 for koloni vedlikehold og 132 for andre bruksområder."> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 9
Figur 9. Effektiviteten av 96-brønns plate basert kultur for celleproduksjon i stor grad overstiger manuell dyrking. Som det fremgår av figur 8, kan en plate være passaged til frø tolv plater, som deretter kan passeres til 144 plater. Denne frekvensen av utvidelsen kan oppnås på to split muligheter. En tekniker krever omtrent 3,5 minutter å mate en seks-brønns plate mens de bruker ca 30 sek med en 96-brønns plate å undersøke det på mikroskopet og plassere den på roboten. Hvis teknikeren bærer 144 plater, de vil bruke rundt 1,2 timers kjøreplater ved mating med roboten mens manuell kultur vil kreve en dedikert 8 timers å mate. Vennligst klikk her for å view en større versjon av dette tallet.

Discussion

I den foreliggende undersøkelse har vi utviklet en metode for robot kultur for IPSC produksjon som miniaturizes og automatiserer foring og passasje i en 96-brønners plateformat, samtidig muliggjør effektiv oppskalering. En flytende håndtering robot ble brukt til rutinemessig mate IPSC kolonier og passage dem med jevne mellomrom ved enzymatisk dissosiasjon. Roboten er også programmert til å produsere ekstracellulær matriks gel-belagte plater, og utføre en seeding densitetsgradient. Når fibroblast og adipose avledet iPSCs ble dyrket i dette systemet i mer enn 20 passeringer, ca 3 måneder, ble pluripotency vedlikeholdt, som var stabile Karyotyper. Begge cellelinjer var i stand til differensiering til kardiomyocytter. Sammen, innsamling av protokoller beskrevet her lar brukere med svært liten stamcelle kultur erfaring, eller begrenset tilgang til spesialisert kultur utstyr, til kultur stamceller og oppnå høy celleproduksjon eller flere linjer håndtering med minimal arbeid og kostnader.

44,47 - 49 for å opprettholde pluripotency. Mens andre formater av skalerbar stamcelle kultur avkastning pluripotente celler 20,23,29 denne platen basert metoden krever egentlig ingen endring i kultur-format, som tilpasning til suspensjon, bruk av antiskum kjemikalier eller langvarig bruk av Rho-kinase inhibitor 20. Denne platen basert metode kan derfor raskt og forutsigbart, imøtekomme nye linjer fordi forholdene kultur er like. Som bruk av iPSCs for sykdom modellering øker 4,6,19,50, nye IPSC linjer kontinuerlig generert. Teknikkene som beskrives her er best egnet til kultur nye linjer i middels til høyt volum og gjennomstrømning fordi barrieren til overgangen til formatet er low. Dette gjelder også for arbeidskraft og utstyr som er nødvendig for å opprettholde koloniene. Til slutt, fordi formatet og håndtering er lik miljø som brukes for å avlede og validere IPSC linjer, kultur ytelse, slik som anvist differensiering, vil sannsynligvis være mer forutsigbar.

Figur 8 illustrerer en strategi for oppskalering av stamcelle produksjon i 96-brønners plater. En plate (Cycle 0) brukes til robot frø 12 nye plater, en 12 ganger økning (syklus 0-1). Etter flere dager med foring, en av de tolv plater er passaged til frø annet sett av tolv plater (Cycle 1 til Cycle 2). De gjenværende elleve platene er nå tilgjengelig for andre formål og som representerer produksjonen komponent i systemet. På denne prisen, vil passering av en plate gi 11 plater hver syklus, eller hver 3-4 dager. Denne metodikken kan skaleres mer når flere plater er passert, som vist i overgangen fra syklus til syklus 2 3. I syklus 3, to platene erpleide alltid å opprettholde koloni og frø 24 nye plater. De resterende 22 platene er deretter tilgjengelige for anvendelse etter hver passering syklus. På noe punkt i vedlikeholdssyklusen brukeren kan seede flere plater for å øke produksjonen. Ett eksempel ville være å passasje hver kolonne for to vekstsykluser. Den første passasje omdanner en plate i tolv plater, og hver av de tolv plater som grunnlag 144 plater. I dette tilfellet starter en bruker med en plate, og etter to passeringer, eller ca 1,5-2 uker med kultur, har platene 144. For eksempel fibroblast og adipose IPSC linjer gi ca 25-75 millioner celler per 96-brønns plate når du er klar til passering. 144 plater kan derfor representere ca 4-7 x 10 9 celler.

Hva er arbeidsbelastningen for å bære 144 96-brønners plater med roboter? Ett av målene for dette arbeidet var skalerbar stamcelle produksjon som redusert arbeidskraft sammenlignet med tradisjonelle (dvs. seks-brønns plate) stamcelle kultur. Roboten accomplishes dette ved å lindre behovet for å fysisk håndtere hver plate under fôring og passaging. Mens 96-brønners plate produksjonsskalaer lineært som det ville i tradisjonelle seks-brønns plater, er tiden en tekniker bruker arbeider med platene betydelig mindre ved hjelp av robot kultur. Den produksjonseffektivitet av robot kultur er avledet fra denne forskjellen (figur 9). Det ble funnet teknikere kunne fjerne en seks-brønns plate fra inkubatoren, sjekk det på mikroskopet, deretter aspirer og mate plate i ca 3,5 minutter. Til sammenligning teknikere bruke ca 30 sekunder å fjerne en 96-brønns plate fra inkubatoren og inspisere den på mikroskop for tetthet og forurensing før du legger den på roboten. Med et utvidet mate protokoll som ligner den som er beskrevet ovenfor, kan seks 96-brønners plater lastes og mates, noe som tar omtrent 21 min, eller 3,5 min per plate. Den totale medgått tid til å mate en plate er sammenlignbar mellom robotic og manuelle metoder, men å levere strøm 6 plater en tekniker kreves for alle 21 minutter mens teknikeren bruker kun 3 min håndtering av seks plater for roboten (30 sek inspeksjon per plate). Som figur 9 viser, den tiden en tekniker bruker håndtering 144 plater ved hjelp av roboten er ca 1,2 time i motsetning til 8 timers manuelt og roboten vil aldri gjøre en feil håndtering av plater eller overføring væsker.

De 96-brønns dyrknings IPSC metoder som er beskrevet her gir en bearbeidbar plattform for screening komplekse oppgaver. Fordi hver brønn er genetisk identiske, og podet på samme tetthet fra den samme opprinnelige bassenget, kan variablene bli fordelt over platen og opprettholdes av roboten med kommersielt tilgjengelige reservoarer for å skille betingelser. Dette vil være nyttig for eksperimenter som stamcellevekstmedier utvikling 34,35,47, substrat eller kultur tilstand testing og toksisitetsstudier utnytte stamceller51. Siden hver stamcellelinje er unik når det gjelder optimale kolonistørrelse og passasje krav, kan man bruke dette systemet for å modulere såing tetthet, å mate frekvens og passasje håndtering ved å manipulere kolonnene høstet, mekanisk omrøring under passasje og foring frekvens. Itera gjennom disse variablene vil tillate brukeren å raskt finne et sett med betingelser som er egnet for dyrking av en ny linje eller utvikle nye kulturteknikker. Robotsystemet er også i stand til å opprettholde 96 parallelle, men uavhengige stilk cellekolonier. Når IPSC er avledet fra somatiske celler eller klonet etter genetisk manipulasjon, er mange parallelle kloner skjermet for å gi potensielle IPSC linjer. Når enkle celler blir sådd ut i 96-brønners plater, kan dette systemet mate og passasjen 96-brønners plater som holder hver koloni adskilt. Dette muliggjør meget høy gjennomstrømning ved valg av mulige kloner og eliminerer vanskeligheten med fysisk dyrking av 96 parallelle linjer. Denne metoden også enllows oppskalert produksjon av hver klon, slik at materiale som er lett tilgjengelig for parallell analyse. Til slutt ser vi for oss å integrere disse kultur teknikker med en robot plate trafficking system som leverer plater til og fra inkubatoren muliggjør helautomatisk kultur. Dette kan gjøres med mer komplekse robotikk som gir mulighet for større utvidelse siden de grunnleggende protokoller som er beskrevet her er overførbare til andre platebaserte systemer.

De første viktige skritt for å løse i protokollene er de som forebygge og kontrollere for forurensning som steg 1,5 og 4,2. Forurensning, som omtalt ovenfor, kan med hell unngått dersom gode steril teknikk og sunn fornuft blir utnyttet. Det er viktig, uavhengig av stamcelle kultur format, som operatøren sjekk for forurensning og å gjøre det i denne protokollen på de angitte trinnene vil i betydelig grad redusere risikoen for forurensning. Riktig ekstracellulære matrise gel programmet er en annen essential skritt for å lykkes med denne protokollen. Uten riktig belegging av 96-brønners plater, vil stamcellene ikke vokse. En vanlig problem er ufullstendig godt belegg. Erfaring har vist at luftbobler, elektrostatisk tiltrekning og kapillarvirkningen hindrer fullstendig godt belegg. Den pre-fuktende trinn (1,6) ble utviklet for å forbedre brønnbunnen belegg og bør ikke bli hoppet over. Dette forhåndsfuktetrinn synes å redusere den tilsynelatende hydrofobisitet av plast 96-brønns plate, slik at når den ekstracellulære matriks gel belegg påføres den er jevnt fordelt over brønnens bunn og sider. Det anbefales også å banke forsiktig på 96-brønners plater mot en ren hånd når belagt for å sikre enda ekstracellulære matrise geloppløsning distribusjon. Dissosiasjon parametere er også viktig å optimalisere. Utvidet inkubasjon med enzym eller EDTA basert dissosiasjon reagens vil resultere i enkeltceller som kan eller ikke kan være målet i løpet av passasjen. Derfor operatørenbør være spesielt oppmerksom på hvordan dissosiasjon tid, utgnidning kraft, og vaske repetisjoner påvirke kolonimorfologi og helse og justere deretter.

Forstå begrensningene til de teknikkene som er beskrevet her er viktig for vellykket operasjon. Som i alle andre cellekultur omgivelser, som gjør bruk av 96-brønners plater en relativt høy risiko for forurensning. Som beskrevet ovenfor, er en tekniker håndtering av hver plate under mating og aging; for eksempel når du åpner lokket, setter platen på roboten seng, og sjekke platen på mikroskopet. Derfor, som nevnt etter trinn 1.5, er det viktig ikke å ta på innsiden av en plate lokk eller utsette denne delen til noen potensielt forurensede overflaten slik som de skrå varmeblokker eller vertikale pinnene på sengen. Under protokollen utvikling denne begrensningen ble oppdaget og var drivkraften for å utvikle et stativ for å holde platelokk for å opprettholde sterilitet. Likeledes renne reservoarer, pipettespisser og other forsyninger på væskehåndtering robot seng er potensielle kilder til forurensning fordi de er åpne for miljø og håndteres av teknikeren. Derfor bør god steril teknikk anvendes, slik som å redusere bevegelsene i løpet av eksponerte kultur materialer eller åpne væsker. En annen begrensning er at når protokollen er skalert opp, visuelt kontrollerer hver brønn på> 100 96-brønners plater er tungvint. Dette kan håndteres ved visuell inspeksjon av hele platen for tegn på forurensning, slik som turbid medium, for å identifisere mistenkelige brønner. For fremtidig skala opp, vil bruk av et automatisert mikroskop og indikator på cellevekst og potensiell forurensning inkorporeres.

I sammendrag, high-throughput 96-brønn basert plattform er beskrevet her gir en reproduserbar, high fidelity fremgangsmåte for stamcellekultur og produksjon i et plateformat. Denne metoden reduserer den nødvendige erfaring, nødvendig utstyr og arbeidskraft tid dedikert til stamcelle kultur mensopprettholde fordelene ved tradisjonell heft kultur.

Disclosures

Forfatterne MKC, MJG, EEB, NJD og RO er eller var på tidspunktet for utviklings ansatte i InvivoSciences, INC som unnfanget av og utviklet robot protokollen beskrevet her. TW er CSO for InvivoSciences INC. SH er ansatt i Gilson INC.

Acknowledgments

Dette arbeidet har vært støttet delvis av NIH tilskudd, R44 GM087784 og R01 HL109505. Forfatterne takker den tekniske og OEM teamet på Gilson, INC for utvidet teknisk support.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).

Tags

Developmental Biology IPSC høy gjennomstrømning robot væskehåndtering skalerbar stamcelle automatisert stamcelle kultur 96-brønn
Scalable 96-brønns plate Basert IPSC Culture and Production Bruke en Robotic Liquid Handling System
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, … More

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter