Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido

Published: May 14, 2015 doi: 10.3791/52755
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 2, 1, 1
1InvivoSciences, Inc., 2Gilson, Inc.

Abstract

Avanço contínuo em cultura de células-tronco pluripotentes está fechando a lacuna entre banco e cabeceira para o uso dessas células na medicina regenerativa, a descoberta de medicamentos e testes de segurança. A fim de produzir-tronco derivadas de células biopharmaceutics e células para engenharia de tecidos e transplantes, uma tecnologia de células de fabricação de baixo custo é essencial. Manutenção da pluripotencialidade e desempenho estável de células em aplicações a jusante (por exemplo, a diferenciação de células) ao longo do tempo é fundamental para a produção de células em grande escala. No entanto, isso pode ser difícil de conseguir, especialmente se as células são cultivadas manualmente onde o operador pode introduzir variabilidade significativa, bem como ser proibitivamente caro para aumento de escala. Para habilitar de alto rendimento, a produção de células-tronco em larga escala e remover a influência do operador protocolos de cultura de células-tronco usando um romance de bancada multi-canal de líquido manipulação do robô foram desenvolvidos que requerem o envolvimento técnico mínima ou experiência. Comestas células estaminais pluripotentes induzidas protocolos humanos (IPSCs) foram cultivadas em condições isentas de alimentação directamente a partir de um lote congelado e mantidas em placas de 96 poços. Dependendo da linhagem de células e taxa de aumento de escala desejado, o operador pode facilmente determinar quando a passagem com base numa série de imagens que mostram as densidades óptimas de fraccionamento de colónias. Em seguida, os reagentes necessários estão preparados para realizar uma separação de colónias para placas novas, sem um passo de centrifugação. Após 20 passagens (~ 3 meses), duas linhas de IPSC mantida cariótipos estáveis, expressa marcadores de células estaminais e diferenciadas em cardiomiócitos com alta eficiência. O sistema pode realizar subsequente rastreio de alto rendimento de novos protocolos de diferenciação ou manipulação genética concebidos para placas de 96 poços. Esta tecnologia vai reduzir a carga de trabalho e técnica para produzir um grande número de células-tronco idênticas para uma infinidade de aplicações.

Introduction

O uso de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs humanos) tem aumentado significativamente desde sua derivação em 2007 1 para o teste composto, medicina regenerativa e modelagem doença 2-6. Essa demanda vem da capacidade de iPSC para produzir grandes quantidades de células pluripotentes que podem ser diferenciadas em células somáticas em uma quantidade inigualável. Como técnicas de diferenciação dirigidos melhorar 7-10 e desenvolvimento de células humanas ou modelagem de tecidos e terapia celular aumenta 11-14, o mesmo acontece com a exigência de produção em massa de iPSCs de alta qualidade. É amplamente citado que, entre outras doenças, enfarte do miocárdio ou a substituição funcional de células b vai exigir centenas de milhões para bilhões de iPSC derivada de células somáticas 15-18. Modelagem de tecido 3D Além disso, cada vez mais complexo para a descoberta de drogas e therapy vai exigir um grande número de células 9,13,19. Em todos estes exemplos, definido, uniforme e iPSCs reprodutíveis deve estar disponível e fácil de produzir.

A fim de produzir-tronco derivadas de células biopharmaceutics e células para engenharia de tecidos e transplantes, uma tecnologia de células de fabricação de baixo custo é essencial. De produção em escala de iPSCs concentrou-se em cultura em suspensão de 20 - 25 ou uma suspensão com a utilização de substratos de microveiculos 26-28, em parte, porque estas técnicas são implantadas com sucesso para grande escala, não CIPS, produção baseado eucariótica. Vários grupos têm demonstrado que sistemas de cultura de suspensão de células estaminais pluripotentes produzem 20,21,23,24,29. No entanto, estas abordagens utilizam sistemas caros e complexos não prontamente disponíveis para os pesquisadores que desenvolvem programas de diferenciação novos, dirigindo engenharia de tecidos e fazendo laboratinvestigação à escala ory. Além disso, suspensão e microcarregador culturas IPSC necessitam de adaptação e técnicas ou produtos químicos que não são encontrados na cultura iPSC tradicional aderente, como o uso contínuo de inibidores Rho-quinase, agentes anti-espuma e filtração para regular agregação. O stress físico às células é mais prevalente em cultura em suspensão, introduzido por meio de agitação mecânica, bem como durante a colisão microtransportador. Estes problemas limitam a previsibilidade e velocidade com que recém-gerado linhas de células estaminais podem ser cultivadas em suspensão. Outros têm desenvolvido sistemas robotizados de manuseamento de placas que imitam as técnicas de cultura de placas 30,31 mas estas plataformas exigem grandes investimentos para equipamento e perícia para operar para além dos desafios fundamentais associados com a cultura de células estaminais.

O presente trabalho descreve o desenvolvimento ea prática de um sistema de cultura escalável iPSC que utiliza um líquido robótico de 8 canais padrão auto-suficientemanipulador e placas de 96 poços. Este método foi concebido para colmatar escala de laboratório cultura iPSC e de alto volume de produção iPSC (por exemplo, 10 7-1,5 x 10 9 células por semana por técnico), permitindo aqueles que desenvolvem novas tecnologias IPSC para escalar facilmente a produção sem grandes investimentos em hardware ou trabalhistas. Este método é relativamente barato para configurar, requer pouca ou nenhuma experiência de cultura de células-tronco, programação ou engenharia, tem uma pequena pegada de equipamentos sem a necessidade de uma capa de cultura de células dedicado, e utiliza equipamento de cultura celular padrão para permitir a média a alta taxa de transferência automatizado a produção de células. O objetivo era desenvolver um sistema capaz de cultura de células-tronco escalável que pode ser utilizado por laboratórios novos para conter cultura de células, aqueles que acham cultivo manual uma barreira para o desenvolvimento de suas idéias ou aqueles que querem um meio econômico para a produção de um grande número de células-tronco. A plataforma apresentada aqui remove influência sobre técnicocultura de células-tronco e normaliza os procedimentos de alimentação e passagem para permitir a produção de células-tronco consistente.

Protocol

O sistema robótico de manuseamento de líquidos, o que para os seguintes protocolos foi pipetmaX de Gilson, facilita automatizado, a cultura de células estaminais escalável e de produção, mantendo as condições tradicionais de cultura aderente no formato de placa de 96 poços. Como tradicional 6-placa de cultura, iPSCs são cultivadas com este protocolo, tal como uma monocamada de colónias distintas mas no formato de placa de 96 poços. Cada poço pode ser isogênica ou distinta e qualquer configuração podem ser cultivadas em paralelo uma vez que o robô pode manter cada poço segregado. A rotina robótico típica cultura iPSC tem duas fases: um programa de alimentação onde as culturas são alimentados em uma programação personalizada e um programa de passagem onde o usuário escolhe o método de dissociação e razão de divisão controlando assim densidade de semeadura e taxa de escala. Os seguintes protocolos descrevem como uma nova cultura é iniciado, como alimentação e passagem são realizadas e os programas complementares que facilitem a cultura da IPSC.

1. Preparação de Matriz Extracelular gel revestido placas de 96 poços

  1. Remova a embalagem de seis novos, RT placas de 96 poços e colocá-los na cama líquido manipulação do robô nas posições 2, 3, 5, 7, 8, 9 (ver Figura 1A para os cargos de cama).
  2. Coloque um pré-gelada, 4 ° C-4 bem calha em cama posição 6.
  3. Carga coluna 12 do rack ponta em posição de cama 1 com pré-refrigeradas, 4 ° C 200 ul dicas de pipeta.
  4. Encha o primeiro (à esquerda a maioria) da calha bem na posição de cama 6 com 25 ml 4 ° C DMEM / F12, derramando uma alíquota usando técnica estéril. Em alternativa, utilizar uma pipeta para completar a transferência.
  5. Retirar as tampas de placas de 96 poços e cada deslize para a prateleira que suporta especialmente concebidos placa da tampa (PLHR, ver Figura 1A). Evitar o contactocom o interior da tampa de chapa.
    Nota: Manuseamento do interior de uma tampa ou placa de empilhamento das tampas da placa, onde o interior de uma tampa toca o lado de fora de um outro é um excelente rota de contaminação.
  6. Usando o controle robótico touch pad, pressione a seguinte série de botões para iniciar o processo de pré-molhar bem:
    1. Toque em "Executar um protocolo".
    2. Selecione "extracelular gel matriz prewet" e toque em Avançar.
    3. Decisão do utilizador: Toque em "ensaio" para usar o assistente passo-a-passo para pré-testar o programa selecionado.
      Nota: O robô não é executado, mas sim o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
    4. Toque em "Protocolo Run".
  7. Durante o processo de pré-molhagem (passo 1.6) continuar a etapa 1.8.
  8. Descongelar em gelo uma alíquota de 4 mg de factor de crescimento reduzida de gel de matriz extracelular (GFRM) contido em 50 ml detubo cónico armazenado a -80 ° C. Manter a alíquota em gelo até estar pronto para usar.
    Nota: O GFRM irá solidificar se aquecer até à temperatura ambiente e não será útil.
  9. Ressuspender o GFRM alíquota de 4 mg em 24 ml de 4 ° C DMEM / F12 com 25 ml de uma pipeta de vidro. Ao transferir o DMEM / F12, pausa para 2-3 segundos para permitir que a pipeta para esfriar antes de ressuspender a alíquota GFRM.
  10. Quando o processo de pré-molhagem (passo 1.6) estiver concluída, continue com a etapa 1.11.
  11. Transferir os 24 mL de mistura GFRM DMEM / F12 para o quarto poço da calha na posição de cama 6.
  12. Usando o controle robótico touch pad, pressione a seguinte série de botões para iniciar o processo de revestimento gel matriz extracelular:
    1. Toque em "Executar um protocolo".
    2. Selecione "alíquota gel matriz extracelular" e toque em Avançar.
    3. Decisão do utilizador: Toque em "ensaio" para usar o assistente passo-a-passo para pré-testar o programa selecionado.
      Nota: O robô não é executado, mas rather o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
    4. Toque em "Protocolo Run".
  13. Quando a etapa 1.12 estiver concluída, substituir as tampas de placas.
  14. Transferir o gel revestidas placas de 96 poços de matriz extracelular para uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada e segurar ali durante 24 horas, altura em que as placas estarão prontas para utilização ou armazenadas.
    Nota: Sob circunstâncias atenuantes, as placas de gel de matriz extracelulares recém-revestidos podem ser utilizados após 15-30 min de incubação, mas O / N a 24 horas de incubação é recomendado.
  15. Repita os passos do protocolo 1.1, 1,3, 1,5-1,6, 1,10, e 1,12-14 até que todo o DMEM / F12 com GFRM é usado.

Armazenando 2. Matriz Extracelular Gel placas revestidas com 96 poços

  1. Remover matriz revestida de gel de placas de 96 poços extracelulares a partir do 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada.
  2. Opcional: UmlLow a matriz extracelular revestido gel placas de 96 poços para vir até à temperatura ambiente antes de prosseguir para o passo 2.3.
    Nota: Esta etapa opcional reduzir a condensação irá acumular-se quando as placas são colocadas a 4 ° C.
  3. Coloque as placas sobre a manipulação cama robô líquido nas posições 2, 3, 5, 7, 8, 9 (ver Figura 1A para os cargos de cama).
  4. Carga coluna 12 do rack ponta na posição 1 com cama RT 200 ul dicas de pipeta.
  5. Coloque um reservatório quatro calha em posição de cama 6.
  6. Encher a cavidade 4 (mais à direita) do reservatório com a RT de DMEM / F12.
  7. Retirar as tampas de placas de 96 poços e cada deslize no PLHR.
  8. Usando o controle robótico touch pad, pressione a seguinte combinação de teclas:
    1. Toque em "Executar um protocolo".
    2. Selecione "alíquota gel matriz extracelular" e toque em Avançar.
    3. Decisão do utilizador: Toque em "ensaio" para usar o assistente passo-a-passo para pré-testar o programa selecionado.
      Nota: O robot não é executado, mas sim o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
    4. Toque em "Protocolo Run".
  9. Uma vez completo, substituir as tampas de placas e remover as placas da cama máquina.
  10. Enrole em torno de todo o lado de cada matriz de gel extracelular revestido placa de 96 poços (em que a tampa se reúne a placa), com um de uma polegada por seis polegadas tira da película de parafina. Certifique-se de esticar o filme parafina para criar um selo hermético.
  11. Opcional: Rotular as placas com a data de revestimento de gel matriz extracelular concluída, o número extracelular gel matriz lote, nome de usuário e qualquer outra informação.
  12. Armazenar as placas a 4 ° C, onde eles vão ser bons para usar para até duas semanas.
    Nota: As placas têm sido utilizados com sucesso para além do limite de duas semanas, no entanto, não é recomendado.

3. Executando uma Stem Cell Colony Sementeira DensidadeGradiente no formato de placas de 96 poços a partir de uma Cultura ao Vivo ou congelado: Como Iniciar ou restaurar Intervalos passagem normal a uma Linha de Células-Tronco

  1. Se começar com uma cultura congelada, vá para a etapa 3.2. Se começar com uma cultura de células-tronco ao vivo já em um prato, comece com a etapa 3.5.
  2. Descongele a cultura congelada agitando o tubo num banho de água a 37 ° C até que apenas um pedaço pequeno do gelo permanece.
  3. Opcional: Diluir as células descongeladas em 10 ml de meio de crescimento do caule RT célula (SCGM), centrifuga-se durante 2 minutos a 300 xg, aspirar os meios de sobrenadante e ressuspender o sedimento de células estaminais em 7 ml SCGM fresco contendo 10 uM Y27632.
    Nota: Esta etapa elimina transição da mídia congelamento.
  4. Avance para o passo 3.6.
  5. Se começar com ao vivo, já banhado células-tronco: as células de passagem como normal usando dissociação enzimática ou não enzimática. Tente colher um total de 1,5-3.000.000 células; usualmente um poço de uma placa de seis poços. Centrifugar as células colhidas para2 min a 300 xg, aspirar os meios de sobrenadante e ressuspender o sedimento de células estaminais em 7 ml SCGM fresco contendo 10 uM Y27632. Avance para o passo 3.6.
  6. Certifique-se as células, quer a partir de uma cultura congelada ou ao vivo, são suspensas em 7 ml RT SCGM com 10 mM Y27632.
  7. Carga coluna 12 do rack ponta em posição de cama com um RT 200 ul dicas de pipeta.
  8. Coloque um reservatório quatro calha em posição de cama 2.
  9. Coloque um novo gel de matriz extracelular revestido placa de 96 poços pré-aquecido a 37 ° C na posição de cama 5 e remover a tampa colocando-o no PLHR.
  10. Transfira os 7 ml de células em suspensão para o poço 3 do reservatório por pipeta estéril ou derrame.
    1. Usando o controle robótico touch pad, pressione a seguinte combinação de teclas:
    2. Toque em "Executar um protocolo".
    3. Selecione "Gradient densidade de semeadura" e toque em Avançar.
    4. Decisão do utilizador: Toque em "ensaio" para usar o assistente passo-a-passo para pré-testar o selecioneprograma ed.
      Nota: O robô não é executado, mas sim o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
  11. Toque em "Protocolo Run".
  12. Quando a série de diluição é completa, re-cobrir a placa e em lugar de uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada até que a próxima alimentação.
  13. Opcional: Identifique a placa com a data, informação estirpe, o nome do usuário, tipo de mídia e outras informações pertinentes.
  14. Ao longo dos próximos dias, alimentar a placa de 96 poços como exigido usando Protocolo 4 abaixo.
    Nota: Uma placa de células-tronco típico vai exigir uma mudança de mídia completo uma vez a cada 24 horas e que o SCGM não conter Y27632 para a alimentação; apenas durante a semeadura inicial após passagem. Antes da alimentação, consulte a placa de contaminação e densidade colônia. Veja o passo 3.16 para mais informações sobre o monitoramento densidade colônia.
  15. Ao longo dos próximos dias, várias colunas perto do centram da placa (normalmente colunas 5-8) vai abordar uma densidade ideal para a passagem; para identificar esta densidade, comparar a placa de 96 poços para a faixa de densidade mostrado na Figura 3B com as seguintes informações em mente:
    1. Passagem quando o espaço entre a maioria das colónias é de aproximadamente 25% do diâmetro das colónias adjacente.
      Nota: A base racional para identificar o tempo de passagem é que um outro ciclo de alimentação e crescimento resultaria em colónias que fazem contacto, que deve ser evitado.
  16. Para iniciar uma placa uniformemente diluído e começar a cultura regular, selecione uma coluna que está na densidade ideal e passagem. Ver Protocolo 5 a passagem.

4. Alimentação de 96 poços Colônias placa de células-tronco

Nota: O protocolo seguinte descreve a alimentação de uma haste de 96 poços da placa de colónias de células. A técnica pode ser dimensionado para acomodar seis placas dadas em paralelo.

  1. Remover a 96-s bemTEM placa de colónias de células a partir do 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada.
  2. Verifique a placa de contaminação e densidade celular. Para alimentar, garantir que a densidade está abaixo da colônia densidade passagem ideal. Veja a Figura 3B para obter informações sobre a densidade.
    Nota: A contaminação pode apresentar mídia como turvas e ser acompanhado por um cheiro desagradável. Pequenos, agregados obviamente não IPSC podem também ser visível sob inspeção microscópica. Para avaliar a densidade celular, consulte o passo 3.16.1 acima.
  3. Colocar a placa de 96 poços de colónias de células-tronco na posição de cama 3 em um inclinado, de 37 ° C, rampa.
  4. Carga coluna 12 do rack ponta na posição 1 com cama RT 200 ul dicas de pipeta.
  5. Coloque um 4-bem calha em posição de cama 2.
  6. Preencha poço 3 da calha na posição 2 com 8 ml cama fresca, RT SCGM sem Y27632 quer por estéril derrame ou pipeta de transferência.
  7. Remover a 96 poços de colónias de células-tronco placa da tampa colocando-o no PLHR.
  8. Utilizando orobótico controle touch pad, pressione a seguinte combinação de teclas:
    1. Toque em "Executar um protocolo".
    2. Selecione "Colônia de alimentação Um Plate" e toque em Avançar.
    3. Decisão do utilizador: toque em "ensaio" para usar o assistente passo-a-passo para pré-testar o programa selecionado.
      Nota, o robô não é executado, mas sim o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
    4. Toque em "Protocolo Run".
  9. Quando o protocolo de alimentação está completo, re-cobrir a placa de 96 poços de colónias de células-tronco e retornar à temperatura de 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada até que a próxima alimentação ou passagem é necessário. Este é geralmente necessária depois de 24 horas.
    Nota: Recomenda-se a registrar o evento de alimentação na tampa placa com a data, tipo de mídia, nome de usuário e outras informações pertinentes.

5. Passaging 96 poços Plcomeu colônias de células-tronco

  1. Depois de vários ciclos de alimentação da placa de 96 poços colônia de células-tronco estará pronto para a passagem. Este protocolo descreve a passagem de uma coluna de uma placa de 96 poços, o que representa uma proporção de 01:12 de divisão. O usuário pode definir a taxa de divisão e selecione qualquer número de poços ou colunas para dividir, incluindo a escolha de poços que podem não estar adjacente.
  2. Compare a 96 poços células-tronco densidade placa colônia à Figura 3B para determinar se a passagem. A densidade ideal passagem é quando o espaço entre a maioria das colónias é de aproximadamente 25% do diâmetro das colónias adjacente ou uma alimentação subsequente resultaria nas colónias que crescem em um outro.
  3. Examinar a placa de colónias de células-tronco de 96 poços sob um microscópio para assegurar que não há contaminação.
  4. Colocar a placa de 96 poços de colónias de células-tronco na posição de cama 3 em um inclinado, de 37 ° C, rampa.
  5. Colunas de carga 12/08 no rack ponta de carga na posição 1 com cama RT 200 ul pipetadicas.
  6. Coloque um 4-bem calha em posição de cama 2.
  7. Deixar bem cavado um vazio, colocar 8,5 ml SCGM + 10 mM Y27632 no poço 2, colocar 3,5 ml de 30% proteolítica e reagente dissociação colagenolítica (ou reagente dissociação com base EDTA) no poço 3, colocar 4,5 ml PBS no poço 4.
    Nota: Todos os reagentes podem ser à TA ou a 37 ° C. RT proteolítica e colagenolítica reagente de dissociação a 30% diluída com PBS foi usado para o tecido adiposo e a fibroblastos derivadas de cultura iPSC descrito aqui.
  8. Coloque um novo, pré-aquecido a 37 ° C de gel matriz extracelular revestido placa de 96 poços na posição de cama 5.
  9. Remover o de 96 poços de células estaminais placa colónia tampa, bem como a nova tampa de 96 poços da placa e colocá-los tanto no PLHR.
  10. Usando o controle robótico touch pad, pressione a seguinte combinação de teclas:
    1. Toque em "Executar um protocolo".
    2. Selecione "Colônia de Split 01:12 Coluna 1" e toque em Avançar.
    3. Decisão do utilizador: Toque em "teste" para usaro assistente passo-a-passo para pré-testar o programa selecionado.
      Nota: O robô não é executado, mas sim o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
    4. Toque em "Protocolo Run".
  11. Uma vez que o protocolo de passagem tiver terminado, re-cobrir ambas as placas.
  12. Opcional: Identifique a nova placa com as informações necessárias (ie, data, linha celular, número de passagens, tipo de mídia, o nome do usuário etc.).
  13. Retornar ambas as placas à temperatura de 37 ° C, 5% de CO2, incubadora humidificada até que a próxima alimentação ou passagem é necessário. Nota: A próxima alimentação é tipicamente depois de 24 horas.
    Nota: As células e colônias devem anexar à placa dentro de 2-3 horas de dividir e olhar muito se espalhar. Isto é devido à presença do inibidor de Rho-cinase e as células irão condensar e exibem a morfologia característica de células-tronco (isto é, paralelepípedos embalado colónias with volume celular pequeno a grande relação núcleo) após a primeira Rho-quinase inibidor alimentação livre.

6. A colheita de 96 poços Células-Tronco Placa de Produção

Nota: colónias de células-tronco pode ser colhido para utilização em qualquer altura durante a cultura. Geralmente isso ocorre quando as células estão prontos para passagem (ver protocolo 5). Este protocolo descreve como colher onze colunas de uma placa de 96 poços de colónias de células-tronco.

  1. Examinar a placa de colónias de células-tronco de 96 poços sob um microscópio para assegurar que não há contaminação.
  2. Colocar a placa de 96 poços de colónias de células-tronco na posição de cama 3 em um inclinado, de 37 ° C, rampa.
  3. Colunas de carga 11 e 12 no rack ponta de carga na posição 1 com cama RT 200 ul dicas de pipeta.
  4. Coloque um 4-bem calha em posição de cama 2.
  5. Deixar bem cavado um vazio, colocar 8,5 ml SCGM no poço 2, colocar 3,5 ml de 30% proteolítica e reagente colagenolítica dissociação (EDTA ou reagente dissociação com base) em bem3, colocar 4,5 ml PBS no poço 4.
    Nota: Todos os reagentes podem ser à TA ou a 37 ° C.
  6. Remova a placa de tampa de 96 poços-tronco de colónias de células e lugar no PLHR.
  7. Usando o controle robótico touch pad, pressione a seguinte combinação de teclas:
    1. Toque em "Executar um protocolo".
    2. Selecione "Colony Colheita Colunas 2-12" e toque em Avançar.
    3. Decisão do utilizador: Toque em "ensaio" para usar o assistente passo-a-passo para pré-testar o programa selecionado.
      Nota: O robô não é executado, mas sim o software testa a protocolo para problemas de software. Com protocolos estabelecidos, batendo, "pular setup" é aceitável.
    4. Toque em "Protocolo Run".
      Nota: Uma vez que o procedimento de coleta for concluída, as células vão estar em calha bem 2 e pronto para a coleta.

Representative Results

Desenvolvimento de uma haste robótico plataforma de cultura de células placa base.

A demanda por iPSCs está crescendo devido a sua utilidade no desenvolvimento de medicamentos e medicina regenerativa. No entanto, a produção escalável tem se concentrado em suspensão de cultura de 32 em equipamentos relativamente complexa que exclui muitos pesquisadores e diverge de métodos de cultura aderentes estabelecidos. Em vez de alterar drasticamente-tronco com base métodos de cultura de células de placas comprovada, tais como a mudança para uma cultura de suspensão ou usando um microcarrier, nós nos concentramos em miniaturização e automatizar nossas técnicas aderentes existentes cultura da IPSC. O primeiro objectivo era o de automatizar a alimentação e para normalizar passaging todo o processo de cultura. Uma plataforma capaz de escala-se rapidamente com a tecnologia existente também foi exigido. Para atingir estes objectivos de um método foi concebido para células estaminais em cultura numa placa de 96 poços, utilizando um sistema automatizado de manuseamento de líquidos (Figura 1). O protocols aqui desenvolvidos com o robô de manipulação de líquidos para a alimentação de passagem e que não requerem um passo de centrifugação ou a monitorização contínua por um técnico. Estes protocolos foram desenvolvidos com duas linhas alimentadoras IPSC livres; um derivado de fibroblastos e o outro a partir de células adiposas 33.

O sistema controlado por computador de manipulação de líquidos (Figura 1A) ser constituído por um leito que se move frente e para trás. A cama tem nove, aproximadamente 5 x 3,3 polegadas recessos numeradas com pressão clipes de retenção para aceitar placas de cultura celular padrão, reservatórios líquidos e outro hardware personalizado. As pipetas movimentos de cabeça esquerda para a direita (perpendicular ao movimento cama), bem como para cima e para baixo. Juntamente com a cama, a cabeça pipeta pode ser programado para remover ou entregar mídia em qualquer lugar na cama depois de pegar as pontas das pipetas de um rack recarregáveis. Se necessário, cada um dos 96 poços podem ser mantidas separadas para eliminar a contaminação cruzada. Na configuração atual, 0 a200 ul de meios de comunicação podem ser movidos por cada ponta da cabeça da pipeta, mas outras são possíveis intervalos de volume com base no tamanho da ponta.

Quando passaging células estaminais em placas standard, enzimática ou dissociação química requer tipicamente a incubação a 37 ° C. Os testes iniciais confirmaram dissociação com um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica ou um reagente à base de EDTA melhor realizada a 37 ° C do que a temperatura ambiente tanto tempo para a dissociação e a homogeneidade do tamanho das colónias produzidas pelas nossas duas linhas de 96 poços IPSC (dados não mostrados). Para automatizar o processo de divisão e evitar placas entrando e saindo de uma incubadora, rampas inclinadas, temperatura controlada que aceitam e reprodutível posicionar placas de cultura padrão foram construídas (Figura 1A). Quando as rampas foram aquecidos a 37 ° C, um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica ou dissociação com base EDTA dos iPSCs de placas de 96 poços foi comparável para placas colocadas numa incubadora de 37 ° C (dados not mostrado). As rampas inclinadas também foram utilizadas para permitir pontas de pipeta para recolher o conteúdo de um poço inteiro (menos de 5 ul volume residual) ao atingir o ponto mais baixo dentro do poço enquanto que a aspiração a partir de uma placa plana deixou um volume residual de cerca de 10-15 ul, resultando na perda de células. A rampa inclinada também permitiu aos poços a serem lavados (triturado) por meios de ejectar no topo do poço inclinado e recolhê-lo na parte inferior.

Robótico cultura de células estaminais no formato de placa de 96 poços; alimentação e passaging.

Cultura de iPSCs que utilizam o sistema de manipulação de líquidos robótico tem duas fases; passagem e alimentação. Quando uma colónia está pronto para a passagem, que é dividida numa proporção pré-determinada para semear uma nova placa que é então transmitido a intervalos regulares até que esteja pronto para a passagem de novo (Figura 1B). Culturas congeladas ou não de 96 poços pode ser iniciado no formato de 96 poços e entrar imediatamente na passagem / feedciclo. As células que não são usados ​​para manter a colónia, que é a maior parte de uma placa, são colhidas para outros usos e representa o componente de produção deste sistema.

Alimentação de 96 poços cultivadas iPSCs é realizado quando a totalidade ou parte do meio é removido após um período de cultura e depositado num reservatório de resíduos. Em seguida, o meio fresco é dividido em alíquotas para a mesma placa. O robô pode usar novas dicas e calhas de mídia para segregar cada bem para a alimentação inteiramente customizável, incluindo misturando meios condicionados com as novas mídias.

Passagem típica de células estaminais requer um método de dissociação e, muitas vezes um passo de centrifugação. Os protocolos descritos aqui pretende normalizar dissociação e eliminar centrifugação. O protocolo de passagem começa quando o robô proporciona reagente de dissociação para placas de 96 poços montado em 37 ° C rampas inclinadas. Depois de um tempo pré-definido, as células dissociadas são recolhidos com uma ação de lavagem onde o usuário tem control sobre a posição, a repetição, o volume ea taxa de trituração. Enzima tempo, a taxa de trituração e o número de repetições trituração foram suficientes para variar o tamanho da colónia dissociado e homogeneidade (Figura 2), mas cada parâmetro é ajustável para se adaptar necessidades de uma determinada linha celular. Este controle remove variabilidade introduzida pelos técnicos que pipeta com taxas variáveis, posições e repetições. Uma vez que as células dissociadas são recolhidas e reunidas em um reservatório com meio fresco, eles são distribuídos para uma nova placa. Para evitar centrifugação e semeadura problemas de degradação de substrato ou morte celular devido à ação das enzimas, reagentes dissociação foi diluído para o ponto mínimo de dissociação aceitável que resultou na semeadura confiável. Esta técnica foi eficaz para um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica em meio mTeSR1 34, que tem um teor relativamente elevado de proteína, mas também eficaz em meios de baixa proteína como Essencial-8 35

Controlar a densidade de semeadura de células-tronco após a passagem é fundamental para a cultura de células-tronco de rotina e bem sucedida. Sementeira muito baixa ou elevada pode resultar na diferenciação ectópica e perda de pluripotência além de causar intervalos irregulares passagem. A cultura de células estaminais típica baseia-se na razão de divisão onde um poço de uma placa de 6 poços é utilizada para semear toda uma nova placa de 6 poços (a 1: 6 de divisão). Com a manipulação robô líquido esta razão pode ser ajustada de acordo com as necessidades do utilizador (por exemplo, 1: 6, 1: 9, 1:12, etc) e tem mais influência sobre o intervalo de passagem. O robô pode colher menos de uma coluna, uma coluna inteira (8 poços), ou mais de uma coluna, dependendo das necessidades do usuário, que deve ser determinado empiricamente. As iPSCs adiposo e fibroblastos derivados mantido uma programação de alimentação regular com três dias passagem no quarto dia, quando dividiu 01:12. Neste caso, uma coluna foi colhido e utilizado para semear uma nova placa de 96 poços, criando uma separação 01:12 com cada ciclo (Figura 3A). Os restantes 11 poços foram então disponível para aplicações a jusante. Para recolher estes 11 poços de produção, o protocolo de passagem foi repetido excepto as células foram depositadas em uma calha de recolha. Alternativamente, as células podem ser deixadas na placa e usado directamente.

Para conseguir passagem densidade de semeadura consistente para passagem sem contar, e manter uma programação divisão de rotina, os nossos protocolos de chamar para dividir o mesmo número pré-determinado de colunas quando a colônia está em uma densidade ideal para a passagem. Para ajudar os usuários a identificar a densidade adequada para a passagem, uma série de imagens foi gerado mostrando uma gama de densidades com uma densidade passagem ideal destaque (Figura 3B). Para determinar quando a passagem, um técnico examina sua placa e compara-o com a escala da imagem de densidade. A ideial densidade de passagem foi determinado a partir de cultura de tecido adiposo e os iPSCs fibroblastos derivados e verificou-se ser quando o espaço entre a maioria das colónias era cerca de 25% do diâmetro das colónias adjacente. É importante que as colónias de ser distribuído de forma homogénea. Este valor de separação de colónias correlaciona com a densidade máxima desejável porque um ciclo de alimentação adicional que resultaria em colónias que tocam, que é um gatilho para a diferenciação ectópica.

Um protocolo necessário desenvolvido aqui aborda como iniciar uma cultura no formato de 96 poços e como repor uma cultura depois de um problema densidade. Quando uma nova cultura é iniciada, a melhor densidade de sementeira e número de ciclos de alimentação antes passaging são desconhecidos. Para garantir uma densidade utilizável após a sementeira, o robô distribui as células existentes ou descongelados através de uma placa de 96 poços numa diluição em série (Figura 4A). Exemplos de resultados de um tal gradiente são apresentados na Figura 4B-E. Depois de vários alimentaçãociclos, algumas colunas aproximar a densidade ideal para dividir, altura em que um técnico utiliza o robô para semear uma placa uniformemente diluído para iniciar a cultura regular. Este protocolo de gradiente de densidade também foi usada para restaurar intervalos regulares e passagem colónia homogeneidade de uma placa irregular. Se a passagem for atrasado ou faltado, densidade e tamanho da colônia tornar-se demasiado elevado, ao passo que se a passagem é muito cedo, densidade colônia é muito baixa e as colónias individuais podem tornar-se muito grande, sem ser distribuídos uniformemente em todo o bem. O protocolo de gradiente de densidade resolve estes problemas e permite que o usuário reinicie escolhendo um conjunto idealmente semeado de poços.

Duas linhas de IPSC pluripotentes permaneceu após 3 meses de cultura robótico.

Manutenção da pluripotencialidade de células-tronco podem ser adversamente afetados por condições de cultura 36,37. Para avaliar se adiposo e fibroblastos derivados linhas de IPSC (a-IPSC, f-iPSC, respectivamente) manteve pluripotency quando cultivadas roboticamente em placas de 96 poços por um período prolongado de tempo, as duas linhas foram cultivadas no líquido robô manipulação como descrito acima durante 3 meses e, em seguida, marcadores de pluripotência foram examinados. Para este período, ambas as linhas foram passadas com um reagente de dissociação proteolítica e colagenolítica maior do que 20 vezes, sem centrifugação. Placas de 96 poços a partir de uma fixo-iPSC e linhas F-IPSC coradas para Oct4 e Nanog exibiu acumulação nuclear destes marcadores enquanto que foi observada SSEA-4 na superfície da célula (Figura 5A-G). Isto é consistente com relatos prévios para iPSCs pluripotentes 38-41. Contracoloração com DAPI não revelou quaisquer células adicionais que não foram também positivos para os três marcadores de pluripotência. As anomalias cromossómicas são frequentemente observados durante a cultura de células estaminais 42,43 mas pode não afectar a distribuição de marcadores de pluripotência como aqueles mostrados na Figura 5A-G. Kanálise aryotype revelou ambas as linhas IPSC roboticamente passadas tinha 46 cromossomos normais, sugerindo que o método de cultura robótico não introduzir instabilidade cromossômica além do que normalmente poderia ocorrer (Figura 5 M-N).

Para sondar a expressão de genes em células estaminais estabelecidas marcadores 1,41,44,45 nas linhas de IPSC roboticamente cultivadas, RNA total foi coletado em paralelo com a coloração e análise do cariótipo. Ambos os 96 poços da placa linhas IPSC teve expressão semelhante de marcadores de pluripotência NANOG, POU5F1 e Rex1 enquanto cardiomiócitos diferenciados de cada linha não fez, nem uma linha separada de fibroblastos dérmicos humanos (HDFS) (Figura 6). Os cardiomiócitos derivados de ambas as linhas foram MYL7 positivo enquanto os HDFs e células-tronco não expressou MYL7. Ambas as linhas de IPSC foram diferenciadas em cardiomiócitos com a molécula pequena, Wnt técnica da manipulação da via descrita recentemente 46 (Figura 7). Diferenciação em cardiomiócitos no formato de 96 poços foi bem sucedida em mais de 80% dos poços (dados não mostrados). Em conjunto, estes dados sugerem 3 meses e mais de 20 passagens de cultura de células resultou em robótico cromossomicamente normais exibem um programa de transcrição consistente com pluripotência que também eram capazes de se diferenciarem em cardiomiócitos.

Figura 1
Figura 1. Visão geral da robótica equipamentos de cultura de células-tronco e típica rotina de cultura da IPSC. (A) Robotic sistema de manuseio de líquidos mostrado com layout cama típica de 96 poços de cultura de células-tronco. Reagentes líquidos Novas pontas de pipeta estéreis (TIPS), recipiente de resíduos removível ponta (de resíduos), bem multi-trough autoclave para segurar necessários (Líquidos), placas de 96 poços estão posicionados um d suportado em uma temperatura controlada, rampa inclinada (placas de 96 poços), 8 canal de cabeça pipeta robótico que se move para a esquerda / direita e para cima / baixo (cabeça Pipet). Placa da tampa segurando cremalheira (PLHR). Os números de posição de cama mostrados na tabela abaixo. Cultura (B) Robotic iPSC tem duas fases: Alimentação e Passage. O ciclo de produção de células começa quando uma placa colônia está pronto para a passagem. O utilizador escolhe a proporção desejada para a passagem e as sementes robô um novo grupo de placas de 96 poços, em seguida alimentados a intervalos regulares até estar pronto para a passagem de novo. Quando as placas estão prontas para passagem, mais de cada placa não é utilizada para semear placas de colónias subsequentes e está disponível para outros usos, representando, assim, a fase de produção do sistema. As linhas celulares congeladas ou existentes podem ser introduzidas em qualquer momento e mantida no ciclo de alimentação / passagem. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

e_content "fo: manter-together.within-page =" always "> Figura 2
Figura 2. Parâmetros de manuseio de líquidos robóticos pode ser usado para controlar as características de colónias de dissociação IPSC. Cada imagem representativa mostra fibroblastos derivados iPSCs dissociados após o tratamento indicado enquanto ainda suspenso na 96 poços. (Linha superior, A - C) Tempo enzima, sem trituração. IPSCs derivadas de fibroblastos cultivadas em placas de 96 poços foram sujeitas a momentos de proteolítica e colagenolítica dissociação reagente de dissociação e sem trituração foi realizada aumentando robótico. (Middle Row, D - F) Taxa de trituração, 3 enzima minutos. As células foram expostas a três minutos de tratamento proteolítica e colagenolítica reagente de dissociação e, em seguida, 175 ul de meio de crescimento foi aplicado cada poço e pipetados para cima e para baixo uma vez, à taxa indicada. ^ l / s = p microlitroser segundo. (Linha de fundo, G - I) A trituração repetições, três minutos enzima, 160 l / seg. As células foram expostas a proteolítica e reagente dissociação colagenolítica durante 3 minutos, 175 ul meio de crescimento foi aplicado, então triturado em 160 l / seg para o número indicado de repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. adiposo típica e fibroblastos iPSC esquema de manutenção da colônia e uma série de imagens de densidade de colónia para determinar quando a passagem para manter um ciclo de alimentação / passagem regular. (A) Começando com uma adiposo ou de fibroblastos 96 poços colônia iPSC pronto para passagem, uma coluna de células foi passada sobre o robô sem centrifugação e diluiu-12 novas colunas que foram alimentados em intervalos específicos, posteriormente, até que a placa estava pronto para a passagem novamente. Para a produção de células, colunas não utilizados para manter a colónia foram passadas e recolhido para utilização subsequente. Qualquer número de colunas podem ser passadas para controlar a taxa de expansão. (B) Para determinar quando a passagem, uma série de imagens de densidade capturou cada 24 horas foi fornecido aos usuários. Na caixa de vermelho topo (dentro de 72 horas após a semeadura inicial) a colônia não é denso o suficiente para passagem e deve ser alimentada. Quando a densidade corresponde ao indicado no caixa verde (em ~ 96 horas), a colônia é em uma densidade ideal para a passagem. Por 120 horas, a colônia é demasiado denso para passagem e este cenário deve ser evitada. Este último pode ser resolvido com um gradiente de densidade de semeadura mas a cultura de rotina neste densidade é fortemente desencorajada. Barra branca é igual a 200? M. Por favor clique aqui para ver um versi maioresem dessa figura.

Figura 4
Figura 4. 96 poços sistema robótico cultura permite aos utilizadores para iniciar culturas a partir de linhas de células congeladas ou activas e executar um gradiente de semeadura. (A) Uma solução de células é preparado pelo utilizador a partir de um banco de células congeladas ou após a colheita de uma cultura activa e colocado no robot. O sistema robótico em seguida, executa um protocolo de diluição em série para distribuir a solução inicial de células ao longo da placa de 96 poços com o gradiente de densidade distribuído pela coluna. (B - E) Exemplos de densidade celular a partir de quatro dos doze colunas de A, 48 h após o protocolo de gradiente de densidade de sementeira. Linhas brancas igualar 225 m. Por favor clique aqui para ver uma versão maior destafigura.

Figura 5
Figura 5. pluripotência é mantida durante adiposo e fibroblastos derivadas linhas IPSC durante 96 poços para cultura robótico 22 (adiposo) ou 23 (fibroblasto) passagens (~ 3 meses). (A - G) adiposo e linhas celulares derivadas de fibroblastos IPSC foram roboticamente alimentados e passados ​​como descrito no texto, sem centrifugação em placas de 96 poços, durante 22 ou 23 passagens, em seguida, fixos e corados para marcadores de pluripotência Oct4, Nanog, ou SSEA4 de contraste com DAPI. Barra branca é igual a 100 um. (M - N). Culturas paralelas às descritas em A foram submetidos para análise do cariótipo que revelou um complemento normal de 46 cromossomos Por favor, clique aqui para ver uma versão maior oesta figura f.

Figura 6
Figura 6. adiposo (96-A) e de fibroblasto (96-F) derivada iPSCs cultivadas durante mais de 20 passagens no formato de 96 poços robótico mantida a expressão do gene pluripotência e diferenciadas em cardiomiócitos. ARNm total foi extraído a partir de ambas as linhas de IPSC roboticamente cultivadas bem como cardiomiócitos diferenciada de ambas as linhas (CM-A = adiposos cardiomiócitos iPSC derivados, CM-F = derivado de fibroblastos iPSC cardiomiócitos, recolhido 14 dias após a indução da diferenciação) e utilizado para RT-PCR para sondar marcadores de pluripotência NANOG, POU5F1, Rex1, cardiomiócitos marcador MYL7 e controle de carga GAPDH. Fibroblastos dérmicos humanos (HDF) foram também recolhidos e utilizados como um não-IPSC controlo não cardiomiócitos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7
Figura 7. de fibroblastos e tecido adiposo derivado iPSCs mantida a capacidade de se diferenciar em cardiomiócitos após a longo prazo de 96 poços de cultura robótico (A - H). Adiposo e iPSCs fibroblastos cultivadas no formato de 96 poços robótico para mais do que 20 passagens foram diferenciadas em cardiomiócitos . 14 dias após a indução de diferenciação, placa de 96 poços ligados cardiomiócitos foram dissociadas e novamente plaqueadas a baixa densidade em lâminas de vidro para a imunocoloração de troponina T (vermelho), F-actina (verde) e núcleos (azul). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

p_upload / 52755 / 52755fig8.jpg "/>
Figura 8. Intensificação placa de cultura de células estaminais de 96 poços. Scale-se a produção de células estaminais depende do número de placas utilizadas para semear o grupo subsequente de placas. O usuário pode optar por manter um nível de produção por passagem o mesmo número de placas a cada oportunidade de dividir ou expandir a produção semeando mais placas. Por exemplo, no ciclo 0, uma placa de 96 poços é passadas para doze novas placas (ciclo 1), criando uma expansão de dobragem 12. Esta taxa pode ser mantida, se um dos doze placas é passadas para um novo conjunto de doze placas de ciclo (1-2) ou expandido por passagem de múltiplas placas de ciclo (2-3). Durante a passagem, quaisquer placas que não são utilizados para manter a colônia estão disponíveis para aplicações a jusante. Portanto, passaging 12 placas rotineiramente pode produzir um máximo de 144 placas em duas passagens: 12 para manutenção das colónias e 132 para outros usos."> Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9
Figura 9. Eficiência de cultura em placa de 96 poços com base para a produção de células excede grandemente cultivo manual. Como observado na Figura 8, uma placa pode ser passadas para semear doze placas, que podem então ser passadas para placas de 144. Esta taxa de expansão pode ser conseguido de duas possibilidades de divisão. Um técnico requer cerca de 3,5 minutos para alimentar uma placa de 6 poços enquanto eles gastam cerca de 30 segundos com uma placa de 96 poços para examiná-lo no microscópio e colocá-lo no robô. Se o técnico está a levar 144 placas, eles vão gastar cerca de 1,2 placas de manipulação de RH ao alimentar com o robô Considerando que a cultura manual irá exigir um dedicado 8 horas para se alimentar. Por favor clique aqui para vIEW uma versão maior desta figura.

Discussion

No presente estudo foi desenvolvido um método de cultura robótico para a produção iPSC que miniaturizes e automatiza alimentação e passagem em um formato de placa de 96 poços ao mesmo tempo, permitindo aumento de escala eficiente. Um robô de manipulação líquido foi utilizado para alimentar rotineiramente colónias IPSC e passagem los em intervalos regulares por dissociação enzimática. O robô também foi programado para produzir placas revestidas de gel de matriz extracelular e executar um gradiente de densidade de sementeira. Quando fibroblastos e tecido adiposo derivado iPSCs foram cultivadas neste sistema durante mais de 20 passagens, cerca de 3 meses, pluripotência foi mantida, como foram cariótipos estáveis. Ambas as linhas celulares foram capazes de diferenciação em cardiomiócitos. Juntos, a coleção de protocolos descrito aqui permite que os usuários com pouca experiência de cultura de células-tronco, ou acesso limitado a cultura equipamento especializado, a cultura de células-tronco e atingir uma produção de alta celular ou multi-linha manipulação com trabalho mínimo e custo.

44,47 - 49 para manter pluripotência. Enquanto outros formatos de células pluripotentes rendimento escalável cultura de células-tronco 20,23,29 método esta placa baseada essencialmente requer nenhuma mudança no formato da cultura, como a adaptação à suspensão, uso de anti-espuma produtos químicos ou o uso prolongado de Rho-quinase inibidor 20. Este método placa de base pode, portanto, rapidamente e, previsivelmente, acomodar novas linhas porque as condições de cultura são semelhantes. Como o uso de iPSCs para modelagem doença aumenta 4,6,19,50, novas linhas de IPSC são continuamente gerados. As técnicas descritas aqui são os mais adequados para a cultura nova linhas em meio ao alto volume e taxa de transferência porque a barreira para a transição para o formato é low. Isto também é verdade para o trabalho e do equipamento necessário para manter as colônias. Por último, porque o formato e manuseamento são semelhantes ao meio ambiente usado para derivar linhas e validar IPSC, desempenho de cultura, tais como a diferenciação dirigida, é provável que seja mais previsível.

A Figura 8 ilustra uma estratégia para aumento de escala da produção de células estaminais em placas de 96 poços. Uma placa (ciclo 0) é utilizada para semear roboticamente 12 novas placas, um aumento de 12 vezes (ciclo 0 a 1). Depois de vários dias de alimentação, um dos doze placas é passadas para semear um outro conjunto de doze placas (Ciclo 1 Ciclo 2 a). Os restantes onze placas estão agora disponíveis para outros usos e representam o componente de produção do sistema. A este ritmo, a passagem de uma placa irá fornecer 11 placas de cada ciclo, ou a cada 3-4 dias. Esta metodologia pode ser dimensionada mais quando várias placas são passadas como mostrado na transição do Ciclo 2 para Ciclo 3. No ciclo 3, duas placas sãosempre utilizados para manter a colônia e sementes 24 novas placas. Os restantes 22 placas são então disponíveis para uso após cada ciclo de passagem. Em qualquer ponto no ciclo de manutenção do utilizador pode propagar mais placas para aumentar a produção. Um exemplo seria a passagem cada coluna para dois ciclos de crescimento. A primeira passagem converte uma placa em doze placas, e cada um dos doze placas é utilizada para semear 144 placas. Neste caso, um utilizador inicia com uma placa e após duas passagens, ou cerca de 1,5-2 semanas de cultura, tem 144 placas. Por exemplo, os fibroblastos e tecido adiposo linhas de IPSC produzir aproximadamente 25-75000000 células por placa de 96 poços quando estiver pronto para a passagem. 144 placas poderiam representar, por conseguinte, cerca de 4-7 x 10 9 células.

O que é a carga de trabalho para o transporte de 144 placas de 96 poços roboticamente? Uma das metas para este trabalho foi a produção de células-tronco escalável que reduziu o trabalho em comparação aos tradicionais (placa ou seja, de 6 poços) cultura de células-tronco. O robô accomplishes este aliviando a necessidade de manipular fisicamente cada placa durante a alimentação e passaging. Enquanto escalas de 96 poços de produção placa linearmente, como seria em placas de 6 poços tradicionais, o tempo que um técnico gasta trabalhando com as placas é significativamente menos cultura utilizando robótica. A eficiência da produção de cultura robótico é derivado a partir desta diferença (Figura 9). Verificou-se técnicos poderia remover uma placa de 6 poços da incubadora, que vá ao microscópio, em seguida, aspirar e alimentar a placa em cerca de 3,5 minutos. Em comparação, os técnicos de passar cerca de 30 seg a remoção de uma placa de 96 poços da incubadora e inspeccionar sobre o microscópio para a densidade e a contaminação antes da sua colocação sobre o robô. Com um protocolo de alimentação expandida semelhante ao descrito acima, seis placas de 96 poços pode ser carregado e alimentado, o que demora aproximadamente 21 min ou 3,5 min por placa. O tempo total decorrido para alimentar uma placa é comparável entre robôic e métodos manuais, mas a alimentação de mão 6 placas de um técnico é necessário para todos os 21 min enquanto o técnico gasta apenas 3 min lidar com as seis placas para o robô (uma inspeção de 30 segundos por placa). Como a Figura 9 mostra, o tempo de um técnico passa a manipulação 144 placas usando o robô é cerca de 1,2 horas, contra 8 hr manualmente eo robô nunca vai fazer manipulação um erro as placas ou a transferência de líquidos.

As 96 cavidades de cultura de IPSC métodos descritos aqui proporcionam uma plataforma para as tarefas de triagem tratável complexos. Porque cada poço é geneticamente idêntico e semeado com a mesma densidade a partir do mesmo conjunto inicial, as variáveis ​​podem ser distribuídos ao longo da placa e mantido pelo robô com reservatórios disponíveis comercialmente para segregar condições. Isto seria útil para experiências, como o crescimento de células estaminais desenvolvimento meios 34,35,47, substrato ou condição de cultura teste e estudos de toxicidade utilizando células estaminais51. Uma vez que cada linha de células estaminais é único em termos de requisitos de tamanho colônia e passagem óptimas, pode-se usar este sistema para modular a densidade de semeadura, freqüência de alimentação e manuseio passagem através da manipulação das colunas colhidas, a agitação mecânica durante a passagem ea frequência de alimentação. Iteração através destas variáveis ​​permitirá ao usuário encontrar rapidamente um conjunto de condições adequadas para a cultura de uma nova linha ou desenvolver novas técnicas de cultura. O sistema robótico também é capaz de manter a 96 colónias de células-tronco paralelas mas independentes. Quando IPSC derivada a partir de células somáticas ou clonado após a manipulação genética, vários clones são rastreados paralelas para produzir potenciais linhas IPSC. Uma vez que as células individuais são semeadas em placas de 96 poços, este sistema pode alimentar e de passagem das placas de 96 poços a colocação de cada colónia segregados. Isto permite muito elevado rendimento quando selecção de clones potenciais e elimina a dificuldade de cultura de 96 linhas paralelas fisicamente. Este método também umallows ampliados produção de cada clone, de modo que o material é prontamente disponível para análise paralela. Finalmente, prevemos integrando estas técnicas de cultura com um sistema de tráfico placa robótico que proporciona placas de e para a incubadora de cultura permitindo totalmente automatizado. Isto poderia ser conseguido com a robótica mais complexos que permitem uma maior expansão desde os protocolos básicos aqui descritos são transferíveis para outros sistemas baseados placa.

Os primeiros passos críticos para abordar nos protocolos são aqueles que impedem e verificar se há contaminação, tais como os passos 1.5 e 4.2. Contaminação, como discutido acima, podem ser evitados com êxito se boa técnica estéril e bom senso são utilizados. É imperativo, independentemente do formato de cultura de células-tronco, que o cheque operador de contaminação e fazê-lo neste protocolo com os passos indicados irá reduzir significativamente o risco de contaminação. Aplicação do gel matriz extracelular adequada é uma segunda essnóstico passo para o sucesso global do presente protocolo. Sem revestimento adequadamente as placas de 96 poços, as células estaminais não irão crescer. Um problema comum é bem revestimento incompleto. A experiência demonstrou que as bolhas de ar, uma atracção electrostática e impedir acção capilar bem revestimento completo. O passo de pré-molhamento (1.6) foi desenvolvido para melhorar significativamente revestimento cavidades de fundo e não devem ser ignorados. Este passo de pré-molhar parece reduzir a hidrofobicidade aparente de 96 poços de plástico da placa de tal modo que quando o revestimento de gel da matriz extracelular é aplicada, ela é distribuída uniformemente em toda a cavidades de fundo e os lados. Também é recomendado para tocar suavemente as placas de 96 poços contra uma mão limpa uma vez revestido para garantir até mesmo distribuição extracelular solução gel matriz. Os parâmetros de dissociação são também importantes a optimizar. Incubação prolongado com a enzima ou reagente de dissociação com base EDTA vai resultar em células individuais, que podem ou não ser o objectivo durante a passagem. Por conseguinte, o operadordevem prestar especial atenção à forma como tempo de dissociação, força trituração, e repetições de lavagem afetar morfologia da colônia e da saúde e ajustar em conformidade.

Compreender as limitações ao das técnicas descritas aqui são fundamentais para a operação bem-sucedida. Tal como em qualquer outro ambiente de cultura de células, a utilização de placas de 96 poços apresenta um risco relativamente elevado de contaminação. Como acima descrito, um técnico é responsável por cada placa durante a alimentação e passaging; por exemplo, quando se abre a tampa, colocar a placa na cama robô, e verificando a placa no microscópio. Portanto, como foi observado após o passo 1.5, é imperativo não tocar no interior de qualquer tampa ou placa de expor essa parte em qualquer superfície potencialmente contaminados, como os blocos de aquecimento inclinados ou pinos verticais na cama. Durante o desenvolvimento do protocolo essa limitação foi descoberto e foi o impulso para desenvolver um rack para segurar tampas de placas para manter a esterilidade. Da mesma forma, os reservatórios de cocho, pontas de pipeta e outras fontes sobre a cama manipulação robô líquido são fontes potenciais de contaminação, porque eles estão abertos ao meio ambiente e manipulados pelo técnico. Portanto, uma boa técnica estéril deve ser aplicada como a redução movimentos sobre os materiais de cultura expostas ou líquidos abertos. Outra limitação é que, quando o protocolo é dimensionado para cima, verificando visualmente cada poço de 100> placas de 96 poços é incómodo. Este pode ser tratado por inspecção visual toda a placa para sinais de contaminação, tais como meios turva, para identificar poços suspeitas. Para aumento de escala futuro, a utilização de um microscópio automatizado e indicador de crescimento celular e potencial contaminação serão incorporados.

Em resumo, o 96 poços plataforma de base de elevado rendimento descrita aqui oferece um método reprodutível, de alta fidelidade para a cultura de células estaminais e de produção num formato de placa. Este método reduz a experiência necessária, equipamentos e tempo necessário de trabalho dedicado à cultura de células-tronco enquantomantendo os benefícios de cultura aderente tradicional.

Disclosures

Os autores MKC, MJG, EEB, NJD e RO estão ou estavam no momento de funcionários de desenvolvimento de InvivoSciences, INC que conceberam e desenvolveram os protocolos robóticos descritos aqui. TW é o CSO para InvivoSciences INC. SH é um empregado de Gilson INC.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado em parte por concessões do NIH, R44 e R01 GM087784 HL109505. Autores agradecer à equipa técnica e OEM em Gilson, INC para o suporte técnico estendido.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
96-well plates Corning 3596 96-well; Well volume: 360 μl; Cell growth area: 0.32 cm2; Individually wrapped
Seahorse Trough SeahorseBio 201308-100 Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs
Gilson Tips Gilson F167023 10 racks gilson 96 tips D200 tips
DMEM/F12 Life Technologies 12500062 DMEM/F12 powder.  Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.
Growth Factor Reduced Matrigel Corning 354230 Referred to as, "extracellular matrix gel" in the text. Matrigel GFR, 10 ml
mTeSR1 StemCell Technologies 5857 mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.
E8 Media StemCell Technologies 5940 TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance
Y27632 AdooQ BioScience A11001-50 Rock inhinitor Y-27632 2HCI
Accutase Innovative Cell Technologies ACCUTASE Referred to as, "proteolytic and collagenolytic dissociation reagent" in the text. Accutase 500 ml sterile cell solution
PBS Fisher SH30256FS PBS w/o Ca Mg 500 ml, 6/pk
Gilson PIPETMAX Gilson PIPETMAX http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Okita, K., Nakagawa, M., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nature protocols. 2 (12), 3081-3089 (2007).
  2. Grskovic, M., Javaherian, A., Strulovici, B., Daley, G. Q. Induced pluripotent stem cells--opportunities for disease modelling and drug discovery. Nature reviews. Drug discovery. 10, 915-929 (2011).
  3. Shi, Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies. Current Molecular Pharmacology. 2, 15-18 (2009).
  4. Xu, X., Zhong, Z. Disease modeling and drug screening for neurological diseases using human induced pluripotent stem cells. Nature Publishing Group. 34 (6), 755-764 (2013).
  5. Kirouac, D. C., Zandstra, P. W. The systematic production of cells for cell therapies. Cell stem cell. 3 (4), 369-381 (2008).
  6. Ebert, P., Liang, J. W. Induced Pluripotent Stem Cells as a Disease Modeling and Drug Screening Platform. Journal of Cardiovascular Pharmacology. 60 (4), 408-416 (2012).
  7. Pa Lalit,, Hei, D. J., Raval, A. N., Kamp, T. J. Induced pluripotent stem cells for post-myocardial infarction repair: remarkable opportunities and challenges. Circulation research. 114, 1328-1345 (2014).
  8. Compagnucci, C., Nizzardo, M., Corti, S., Zanni, G., Bertini, E. In vitro neurogenesis: development and functional implications of iPSC technology. Cellular and Molecular Life Sciences. , 1-17 (2013).
  9. Yi, F., Liu, G. -H., Belmonte, J. C. I. Human induced pluripotent stem cells derived hepatocytes: rising promise for disease modeling, drug development and cell therapy. Protein & Cell. 3, 246-250 (2012).
  10. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. a, Elefanty, aG., Kamp, T. J. Differentiation of Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes: A Methods Overview. Circulation Research. 111 (3), 344-358 (2012).
  11. Okano, H., et al. Steps toward safe cell therapy using induced pluripotent stem cells. Circulation Research. 112, 523-533 (2013).
  12. Scheiner, Z. S., Talib, S., Feigal, E. G. The Potential for Immunogenicity of Autologous Induced Pluripotent Stem Cell-derived Therapies. The Journal of biological chemistry. 289, 4571-4577 (2014).
  13. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science translational medicine. 4 (130), 130ra47 (2012).
  14. Gunaseeli, I., Doss, M. X., Antzelevitch, C., Hescheler, J., Sachinidis, A. Induced pluripotent stem cells as a model for accelerated patient- and disease-specific drug discovery. Current medicinal chemistry. 17, 759-766 (2010).
  15. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 114, 201-235 (2009).
  16. Serra, M., Brito, C., Correia, C., Alves, P. M. Process engineering of human pluripotent stem cells for clinical application. Trends in Biotechnology. 30, 350-359 (2012).
  17. Lock, L. T., Tzanakakis, E. S. Stem/Progenitor cell sources of insulin-producing cells for the treatment of diabetes. Tissue engineering. 13, 1399-1412 (2007).
  18. Jing, D., Parikh, A., Canty, J. M., Tzanakakis, E. S. Stem cells for heart cell therapies. Tissue engineering. Part B, Reviews. 14, 393-406 (2008).
  19. Soldner, F., Jaenisch, R. iPSC Disease Modeling. Science. 338, 1155-1156 (2012).
  20. Olmer, R., et al. Long term expansion of undifferentiated human iPS and ES cells in suspension culture using a defined medium. Stem cell research. 5 (1), 51-64 (2010).
  21. Wang, Y., Chou, B. -K., Dowey, S., He, C., Gerecht, S., Cheng, L. Scalable expansion of human induced pluripotent stem cells in the defined xeno-free E8 medium under adherent and suspension culture conditions. Stem cell research. 11 (3), 1103-1116 (2013).
  22. Chen, V. C., et al. Scalable GMP compliant suspension culture system for human ES cells. Stem cell research. 8 (3), 388-402 (2012).
  23. Amit, M., Laevsky, I., Miropolsky, Y., Shariki, K., Peri, M., Itskovitz-Eldor, J. Dynamic suspension culture for scalable expansion of undifferentiated human pluripotent stem cells. Nature protocols. 6 (5), 572-579 (2011).
  24. Olmer, R., et al. Suspension Culture of Human Pluripotent Stem Cells in Controlled. Stirred Bioreactors. Tissue engineering. Part C. 18 (10), (2012).
  25. Kehoe, D. E., Jing, D., Lock, L. T., Tzanakakis, E. S., Ph, D. Scalable Stirred-Suspension Bioreactor Culture. Tissue engineering. Part A. 16 (2), (2010).
  26. Oh, S. K. W., et al. Long-term microcarrier suspension cultures of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 2, 219-230 (2009).
  27. Chen, A. K. -L., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnology advances. 31, 1032-1046 (2013).
  28. Yang, H. S., Jeon, O., Bhang, S. H., Lee, S. -H., Kim, B. -S. Suspension culture of mammalian cells using thermosensitive microcarrier that allows cell detachment without proteolytic enzyme treatment. Cell transplantation. 19, 1123-1132 (2010).
  29. Zweigerdt, R., Olmer, R., Singh, H., Haverich, A., Martin, U. Scalable expansion of human pluripotent stem cells in suspension culture. Nature. 6 (5), (2011).
  30. Kami, D., et al. Large-scale cell production of stem cells for clinical application using the automated cell processing machine. BMC biotechnology. 13, 102 (2013).
  31. Hussain, W., Moens, N., Veraitch, F. S., Hernandez, D., Mason, C., Lye, G. J. Reproducible culture and differentiation of mouse embryonic stem cells using an automated microwell platform. Biochemical engineering journal. 77 (100), 246-257 (2013).
  32. Tandon, N., Marolt, D., Cimetta, E., Vunjak-Novakovic, G. Bioreactor engineering of stem cell environments. Biotechnology Advances. 31, 1020-1031 (2013).
  33. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 15720-15725 (2009).
  34. Ludwig, T. E., Bergendahl, V., Levenstein, M. E., Yu, J., Probasco, M. D., Thomson, J. A. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature. 3, 637-646 (2006).
  35. Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  36. Kinney, M. A., Sargent, C. Y., McDevitt, T. C. The multiparametric effects of hydrodynamic environments on stem cell culture. Tissue engineering. Part B, Reviews. 17, 249-262 (2011).
  37. Villa-Diaz, L. G., Ross, A. M., Lahann, J., Krebsbach, P. H. Concise review: The evolution of human pluripotent stem cell culture: from feeder cells to synthetic coatings. Stem cells (Dayton, Ohio). 31, (2013).
  38. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451 (7175), 141-146 (2008).
  39. Chambers, I., et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell. 113 (5), (2003).
  40. Wright, A. J., Andrews, P. W. Surface marker antigens in the characterization of human embryonic stem cells. Stem cell research. 3 (1), 3-11 (2009).
  41. Thomson, J. a Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  42. Mayshar, Y., et al. Identification and classification of chromosomal aberrations in human induced pluripotent stem cells. Cell stem cell. 7 (4), 521-531 (2010).
  43. Martins-Taylor, K., Xu, R. -H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem cells(Dayton, Ohio). 30 (1), 22-27 (2012).
  44. Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature. 448 (7151), 313-317 (2007).
  45. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  46. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (27), E1848-E1857 (2012).
  47. Ludwig, T. E., et al. Derivation of human embryonic stem cells in defined conditions. Nature biotechnology. 24 (2), 185-187 (2006).
  48. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., Bhatia, M. Human embryonic stem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts or conditioned media are capable of hematopoietic development. Blood. 105 (12), 4598-4603 (2005).
  49. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science(New York, N.Y.). 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  50. Kim, C. Disease modeling and cell based therapy with iPSC: future therapeutic option with fast and safe application. Blood research. 49, 7-14 (2014).
  51. Jung, E. -M., et al. Evaluation of developmental toxicity using undifferentiated human embryonic stem cells. Journal of applied toxicology: JAT. (February. , (2014).

Tags

Biologia do Desenvolvimento Edição 99 iPSC de alto rendimento robótica manipulação de líquidos escalável células-tronco cultura automatizada de células-tronco de 96 poços
Escalável placa de 96 poços Baseado iPSC Cultura e Produção Usando um sistema de manipulação robótica Líquido
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, … More

Conway, M. K., Gerger, M. J., Balay, E. E., O'Connell, R., Hanson, S., Daily, N. J., Wakatsuki, T. Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System. J. Vis. Exp. (99), e52755, doi:10.3791/52755 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter