Introduction
斑马鱼是一种行之有效的脊椎动物模式生物研究的发展，生理学，疾病和再生的许多方面。随着越来越多地采用斑马鱼作为模型用于后胚胎的生物过程，实验工具为诱导型，组织特异性操纵基因表达或信号转导途径已经变得越来越重要。具体地讲，研究成器官和附属物再生在成年斑马鱼都遭受缺乏工具的过程中，这些再生过程信号通路的时空要求清扫。
目前，三种不同的系统已被用于实现在再生成年斑马鱼的内脏有条件的，组织特异性的基因表达：在的Cre-lox系统中，使用转座子介导的体细胞的转基因热休克诱导转基因拼接表达，并且顿系统1 -3。堤是指四环素续的变体轧制转录激活系统，其中表达在抗生素四环素或其衍生物， 例如多西环素存在下激活。在的Cre-lox系统，因为它迄今已在成年鱼使用的，依赖于他莫昔芬控制Cre重组酶（CreERT2），其表达在空间上受限于组织特异性调控元件。 Cre的驱动除去一个STOP盒的促进的兴趣的启动子应是活性在所有细胞类型1驱动的基因的表达。转座子介导的创作mosaically表达的转基因体细胞提供了在单个细胞系诱导转基因表达系统。注射斑马鱼的胚胎与TOL2座子携带目的基因下的热休克启动子的结果在嵌合个体通常携带外源基因仅在再生器官2的离散细胞谱系的转录控制。虽然这两个系统允许有条件的组织SPEcific基因表达方法，将Cre-lox系统是不可逆的，并且使用转座子为基础的克隆标记策略从它的随机性质受到影响。因此，我们和其他人已经最近适于转基因TETON系统用于在斑马鱼中，这有利于在时间上和空间上控制基因的表达是在附加的可调和可逆3-5。
此处所用的提顿系统包括转基因驱动线（TetActivator），其中多西环素（DOX）诱导性转录激活（改进反向四环素反式激活，irtTA，短TETA）是根据组织特异性基因调控序列的控制。其次，它要求的转基因应答线（TetResponder），该港口的在转录控制下的四环素操作员感兴趣的基因（四环素响应元件; TetRE）（ 图1A）。因此，使用的TetActivator和TetResponder线路特定组合允许有条件组织特定基因表达的FIC操纵。
最近，我们利用了系统顿探测的Wnt /β-catenin信号通路的成人斑马鱼再生尾鳍3组织特异性的功能。在这里介绍的协议中，我们描述了用于在斑马鱼中的建立的顿系统和使用，特别是用于鳍再生的研究工作流。这包括如何生成稳定的转基因TetActivator和TetResponder线的详细说明和协议，用于在胚胎和成年斑马鱼转基因诱导。此外，我们描述了在鳍再生技术验证组织特异性基因表达，包括一个协议的成年斑马鱼翅片冷冻切片的制备方法。此外，我们将讨论考虑的TetActivator转基因的表达TetResponder的设计，的转基因方法的选择和检测。因此，该协议的总体目标是作为一个蓝图设置式的官能顿系统在斑马鱼实现有条件组织特异性基因的表达，这可以适用于任何感兴趣的组织。
我们已经创建了一个TetActivator向量允许I-SceI的或TOL2介导的一代使用短基因的调控序列稳定TetActivator线（增强片段; Weidinger实验室质粒数据库中没有1247; 图1B）。此构建体含有一个TetActivator盒，其组成稠合与单纯疱疹病毒VP16的激活结构域衍生3F [irtTAM2（3F）]反向的Tet阻抑物结构域的M2突变体变体。所述TetActivator（TETA）的表达可以容易地监测，因为它是共表达与来自相同的开放阅读框架的荧光团AmCyan;一个P2A肽介导核糖体跳跃，这将导致生产TETA和AmCyan截至1独立的蛋白质：1的比例5,6。该构建体也包含一个poylinker 5'T形etActivator盒，以便于插入的兴趣使用常规的克隆方法的基因组调节序列。
此外，我们已经创建了一个构建体由上述TetActivator盒外加一个卡那霉素选择盒（Weidinger实验室质粒数据库没有1180; 图1C）含有大量的基因组区域，可以重组到细菌人工染色体（BAC）（通常成基因的表达模式是由转基因来模拟）的起始密码子。这两种结构都可以从应要求Weidinger实验室。
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Protocol
1.代转基因鱼TetActivator的行
- TetActivator结构的生成
- 在TetActivator盒兴趣上游的矢量＃克隆的调控序列1247采用标准技术。可替代地，可使用重组技术来生成的BAC，其中TetActivator盒（矢量＃1180）被插入靶基因的第一外显子，并且其中所述TOL2反向重复被引入BAC骨干（详细重组工程协议见7,8）。
- 准备无毒素分解质粒DNA或用市售试剂盒BAC DNA的准备工作。
- 转基因鱼TetActivator代线
- 根据标准程序9执行TetActivator构建体的显微注射。
- 注入25-50皮克的质粒DNA或高达250皮克BAC DNA导入单细胞阶段的胚胎一起封义RNA编码TOL2 TRAnsposase转座子介导的转基因，或I-SceI的蛋白I-SceI的介导的转基因。
注：考虑对转基因方法的选择可以在讨论部分。
注：优选注入到细胞质，而不是蛋黄中，由于当DNA不传递到细胞质转基因的效率可能会降低。
- 注入25-50皮克的质粒DNA或高达250皮克BAC DNA导入单细胞阶段的胚胎一起封义RNA编码TOL2 TRAnsposase转座子介导的转基因，或I-SceI的蛋白I-SceI的介导的转基因。
- 提高注入胚胎G0到成年。可选，屏幕G0胚胎AmCyan荧光和优先发展的胚胎显示所需的表达模式。这可能增加了种系传递的速率，特别是用于TOL2介导的转基因。
- 通过使用荧光立体显微镜在F1中的胚胎或幼虫的预期表达模式异交个体G0鱼与野生型鱼和外观AmCyan荧光的（实施例示于图1D）评估成功种系整合。
- 提高荧光阳性F1胚胎到成年和队友它们与野生型鱼类，以获得稳定的F2转基因鱼。
- 提高和表征不同G0创始人鱼的至少3个不同的亚系，由于个别线路可能会有所不同的表达水平，表达模式，能够诱发TetResponder线，泄漏，他们易患沉默。
注：如果强劲表现在胚胎许多转基因是部分或完全沉默的后期幼体或成鱼。因此，如果线是指在成鱼中使用，在成年期表征为其TetActivator表达和功能几个独立的行。
注意：我们已经产生的TetActivator线为TetActivator在两个胚胎和成鱼，其列于表1组织特异性表达一个面板，这些线可从根据请求Weidinger实验室。
- 根据标准程序9执行TetActivator构建体的显微注射。
2.代转基因TetResponder鱼线
注：我们已经产生了TetResponder结构允许I-SceI的或TOL2介导产生稳定TetResponder线，这是根据要求可从Weidinger实验室（Weidinger实验室质粒数据库中没有1444; 图1E）。此构建体含有一个四环素算子，其后为多接头区有利于感兴趣的基因和YFP - 衍生物YPet编码序列的编码序列（CDS）的插入。因此，该构建体被设计为与YPet目的蛋白质的C-末端融合的TETA介导的表达。如果已要避免一个标签的融合蛋白的表达，一个P2A或T2A肽可与感兴趣的CDS的基因，这有利于共表达的兴趣和YPet蛋白作为单独的多肽6,10引入。
- TetResponder结构的生成
- 感兴趣3基因的克隆CDS“四环素运营商和5'YPet CDS的根据标准方法。确保该终止密码子已被来自感兴趣的CDS的基因去除。
- 制备使用市售的试剂盒毒素无质粒DNA制备。
- 转基因鱼TetResponder代线
- 执行根据标准程序9 TetResponder的显微注射构建。
- 注入25-50皮克质粒DNA的成一细胞期胚胎的细胞质连同封义RNA编码TOL2转座转座子介导的转基因或与Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位酶为大范围核酸酶辅助转基因。
注：考虑对转基因方法的选择可以在讨论部分。
注：优选注入到细胞质，而不是蛋黄中，由于当DNA不传递到细胞质转基因的效率可能会降低。
- 注入25-50皮克质粒DNA的成一细胞期胚胎的细胞质连同封义RNA编码TOL2转座转座子介导的转基因或与Ⅰ-SceⅠ限制性酶切位酶为大范围核酸酶辅助转基因。
- 提高注入胚胎G0到dulthood。
- 通过与先前建立TetActivator线后跟强力霉素治疗的F1胚或F1的幼虫配合个别G0鱼评估成功种系整合的转基因和诱导能力。
注：通常我们使用泛素启动子驱动TetActivator线（ 泛素 ：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm2，短泛素 ：TETA AmCyan 3）筛选功能TetResponder运营商，因为这条线在胚胎和成人相当驱动无处不体现鱼，因此非常适合于评估在所有感兴趣的组织TetResponder诱导能力。这条线路是从可应要求Weidinger实验室。 - 收集各离合器的胚在含有E3胚胎培养基一个单独的10cm培养皿（见材料表）和孵化菜在28.5℃。
- 地方G0鱼胚胎了成单独编号的坦克（箱养殖;见材料表），直到胚胎已屏幕ED。这允许对G0鱼，显示转基因的种系传递恢复。
- 如果预计只有一半的胚胎携带TetActivator转基因（如遇杂TetActivator载体进行杂交到一个TetResponder创始人鱼），选择用于包含TetActivator转基因由外观AmCyan荧光的在适当的发育阶段的胚胎。
- 通过在2.3节所述治疗用胚胎多西环素（DOX）诱导TetActivator转录活性。
- 屏幕F1胚胎YPet荧光出现。偏爱线（G0鱼）产生均匀YPet表达，即在离合器胚胎应预期表达结构域和单个胚胎之间很少变化内显示小嵌合体。见箭头在图1F和图1G为代表性实例。
- 队友G0鱼在传输的标识诱导TetResponder转基因步骤2.2.8与野生型鱼类，并提高所有F1胚胎到成年。
- 确定成人F1转基因鱼或者通过基于PCR的基因分型（见或个人渡鱼F1到TetActivator线之后DOX处理F2胚胎和YPet荧光（参见2.5节）的出现。
- 建立和特点从不同的G0创始人鱼的至少3个不同的TetResponder亚系，因为诱导性可能会有所不同的个别线路。特别是可实现的表达水平，以及是否响应可以在所有类型的细胞被激活可能会有所不同。此外，易患沉默将行之间不同。最后，在某些情况下，可能优选选择介导感兴趣的蛋白质的唯一中等表达水平，尤其是如果与在不存在强力霉素的TetActivator线组合产生渗漏表达预期导致发育缺陷或毒性行。
注：春节应答线是在胚胎鲁棒诱导可以部分或完全沉默的后期幼体或成鱼。因此，如果线是指在成鱼中使用，几个独立的线路应被表征为诱导成人。如果诱导感兴趣的基因的是进一步发展兼容，它已被证明是有益的，以创造双转基因胚胎（TetActivator x TetResponder），以诱导GOI表达在胚胎和选择并提高仅个人表示最健壮和至少镶嵌感应。 - 为了保持并按照2.5节所述传播建立TetResponder线，型成鱼）。
- 执行根据标准程序9 TetResponder的显微注射构建。
- 胚胎多西环素治疗
- 准备2000倍多西环素（DOX）的股票。解决DOX在50％EtOH中以达到50毫克/毫升（97毫摩尔）的浓度。商店DOX股避光在-20℃。
- 从胚胎中倒出了广大E3媒体和其替换含有DOX以25微克/毫升阿霉素的最终浓度E3胚胎培养基（2.5微升2000倍的DOX股票每50毫升E3）。 Dechorionation不是必需的。
- 通过评估外观YPet荧光感兴趣的标记基因的表达返回前的胚胎28.5℃，最低6小时的。
- 通过把胚胎只有乙醇溶剂评估TetActivator / TetResponder组合的泄漏。
注： 在原位杂交（ISH）或RT-PCR，以检测TetResponder的mRNA可以用作泄漏比感兴趣的标记基因的荧光的更敏感的措施。泄漏的程度将取决于特定TetActivator / TetResponder线组合，它也可以组织和发育阶段之间变化。
- 成年斑马鱼麻醉
- 准备好10厘米直径的陪替氏培养皿或小烧杯充满含有鱼系统水1mg / ml的三卡因（3-氨基苯甲酸乙酯methanesulfonate，MS-222）。
- 鱼转移到含有麻醉剂的容器，并等待，直到它达到麻醉4水平的均衡完全丧失（鱼就在于在其一侧），无运动和触摸11没有回应表示。
- 仔细用镊子或勺子载玻片上，盖的塑料培养皿中，或琼脂糖涂层培养皿转移鱼类和执行鳍截肢或成像（参见3.2节）。
- 返回鱼含有大量的新鲜鱼系统水的容器中，并进行监控。如果刺的动作不会在3分钟内恢复，帮助超过使用塑料移液管鳃吹水。
- 的TetResponder鱼基于PCR的基因分型
- 执行尾鳍12的部分截肢。将鱼放入单独的，编号为坦克（养殖箱;见材料表）。这允许对转基因鱼以下成功基因型分型的恢复。
- TRAnsfer鳍组织到一个96孔PCR板预先填充与20μl无DNase的水为基因组DNA 13隔离各个孔。
- 添加120微升的1M氢氧化钠至每孔，并使用热循环仪在95℃孵育样品20分钟。
- 寒意样品4℃，加入14微升的1M的Tris-HCl（pH值8.0），每孔，并简要涡样品。在16000×g离心离心机样品5分钟以沉淀细胞碎片。直到需要存储的基因组DNA在4℃下。
- 设计引物以特异性地扩增TetResponder转基因的片段。使用2微升分离的DNA在标准的PCR反应，分析PCR产物在琼脂糖凝胶上。
转基因表达在成人再生斑马鱼尾鳍3组织特异性的诱导
- 建立TetActivator的; TetResponder双转基因鱼
- 队友TetActivator携带者TetResponder CARRIERS。
- 选择胚胎携带TetActivator转基因在发育阶段时，调节元件驱动TetActivator盒活跃。通过外观AmCyan荧光使用立体声荧光显微镜转基因胚胎很容易被识别。
注：TetActivator转基因阳性的鱼可替代地在成年期由成像的麻醉鱼，例如鉴定。以下尾鳍的截肢和在再生AmCyan荧光的出现。 - 提高选胚胎到成年。
- 通过其诱导在感兴趣的组织的TetResponder的表达能力通过基于PCR的基因分型或（优选）确定双转基因成鱼（鱼携带TetResponder除了TetActivator）。一种协议，用于TetResponder诱导和检测再生尾鳍在2.3节和第4节进行说明。
注：如果瞬时表达TetResponder兼容进一步胚胎或幼虫发育，上面所描述的胚胎发育过程中，以确定下治疗DOX携带TetActivator和TetResponder转基因双转基因胚胎是非常有用的（2.3节， 图1H）。双阳性的胚胎会显示AmCyan和YPet荧光。积极提高胚胎到成年。
- 斑马鱼尾鳍截肢和诱导转基因表达在再生鳍
- 执行尾鳍上麻醉鱼的部分截肢（参见2.4节）12。与DOX或者立即把鱼或退回给鱼住房制度。
- 准备繁殖箱（ 图2A;见材料表）充满了1升含25微克/毫升DOX鱼制水（加入500μl的2000倍50毫克/毫升股票1升的鱼制水）。
注：转基因诱导表达后，立即截肢允许作为sessment对再生过程中的早期事件的影响，而感应在后3天截肢（3 DPA），应使用在再生生长来评估转基因表达或功能。 - 传输高达10以前截肢，双转基因鱼的养殖箱，接近盒的盖子，这样的鱼无法逃脱（ 图2A）。
- 将养殖箱到黑暗减轻压力。我们通常把箱子到28.5℃的空气孵化器，以确保持续的黑暗和温度。
- 与乙醇只（250元1L鱼制水微升）治疗阴性对照双转基因鱼。
注：单转基因或用阿霉素处理的野生型鱼可以用作附加的阴性对照，尽管我们从未观察到这里使用的鳍再生的DOX剂量的不利影响。 - 如在2.4节和使用镊子或勺子鱼转移到描述湿润的琼脂糖涂层的培养皿麻醉鱼菜。仔细用镊子传播尾鳍。
- 屏幕鱼用荧光立体显微镜（ 图2B）的再生内外观YPet的。
注：通常情况下，TetResponder驱动的荧光可以观察到稳健以下6个小时DOX治疗。但是，我们建议TetResponder表达的动态表征为生成的每个行。 - 回到鱼鱼住房制度终止TetResponder转基因诱导或继续治疗。
注：对于治疗> 24小时（长期治疗）有必要交换水和每日彻底清洗育种框。 - 在长期的治疗，饲料鱼每隔2-3天喂养后，他们返回到养殖箱前转移到鱼干净的容器中，新鲜的鱼水系统。
在鳍再生TetResponder表达4.表征
吨“>注意：我们通常验证组织特异性基因表达中使用的冷冻切片的荧光成像在3 DPA再生尾鳍在这个时间点一个再生的不同组织区室已经形成，并且可以清楚地识别在组织切片，和cryosectioning比在以后再生阶段简单。 图2C示出了可以在再生区分开的组织结构域，并列出了几个分子标记对这些域。以下方案描述了制备的纵向或横向的冰冻切片进行直接成像或免疫染色。- 成人尾翼Cryosectioning
- 治疗鱼的尾鳍从2 DPA如第3.2节截肢，直到3政治部与DOX
- 如在2.4节所述麻醉鱼
- 用勺子或镊子轻轻地转移到鱼的塑料培养皿的盖子。
- 再截肢的鳍再生约4-5段骨s近端到初始截肢平面使用手术刀和鱼返回到新鲜的鱼水系统。
- 小心转移再生的小皮氏培养皿（ 例如，35毫米）含有4％（重量/体积）低聚甲醛（PFA）在1×磷酸盐缓冲盐水（PBS;见材料表），使用细镊子。请勿触摸再生，但组织只有残端的一部分。
- 将组织平放在培养皿底部和修复O / N在4℃。
- 洗涤再生两次在1×PBS中含有0.1％吐温（PBT）以除去煤灰和孵化再生在o / n 4℃在0.5M的EDTA-PBS（pH7.5）中脱钙骨基质。
- 在10％的蔗糖的PBS，20％蔗糖的PBS，30％蔗糖的PBS和30％的孵育回收物在RT蔗糖的PBS：组织冷冻介质以1：1的比例（TFM;见材料表）为各30分钟。随后，孵化鳍在4℃> 2小时组织冷冻介质。
- 将cryomolds到显微镜载玻片，并填写米，组织冷冻介质。避免引入气泡。
- 转印再生成cryomolds和定向组织适当地获得鳍回收物（ 图2D）的纵向或横向的部分。确保再生是直的，这有利于切片。
- 转印与显微镜载玻片到定位在一个床干冰启动冷冻过程（ 图2D）的金属架一起cryomolds。
- 一旦组织冷冻介质已成为固体，地点cryomold到工作台并让坐在RT几分钟，使得组织冷冻培养基解冻在塑料介质界面。
- 使用钢笔或类似推冻堵出cryomold的。商店cryoblocks在一个盒子在-80℃直至组织切片。
- 用冷冻切片机准备10-14微米厚的冰冻切片和收集粘连显微镜载玻片部分（见材料表）。商店载玻片在-20℃直至ねEDED。
- TetResponder表达对基于YPet荧光翅片区段表征
- 治疗翅片区段30分钟用100％MeOH中冷却至-20℃，以提高粘附到显微镜载片随后在PBT中洗涤两次，在室温和1次洗涤在PBS，每次5分钟。
- 可视化晶核孵育切片10分钟，4'，6-二脒基-2- phenylinodole（DAPI）在PBS中（1：5000），随后洗涤两次，每次10分钟的PBS。
- 山段75％甘油PBS或市售的抗淬灭坐骑，并盖上盖玻片。
- 图像YPet和共焦或宽视场荧光显微镜下AmCyan荧光（ 图1E）。
注意：为了便于明确识别表达YPet，免疫荧光或免疫组织化学与抗细胞类型特异性抗原连同抗GFP抗体的细胞类型（其与YPet反应，但不AmCyan）可以执行。或者，为了便于检测弱YPet表达，RNA 原位杂交对YPet RNA可被执行或者在整个安装翅片或翼片的石蜡切片。
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Representative Results
建立用于组织特异性诱导的基因表达时，转基因TetActivator和TetResponder线的官能TETON系统需要生成（ 图1A）。这是通过显微注射TetActivator（ 图1B - C）的完成或TetResponder（ 图1E）构造成早期斑马鱼的胚胎和随后的生殖系融合。官能TetActivator构建体既可以由短的调节序列（增强子元件）的TetActivator盒（ 图1B）的上游克隆产生，或者由重组的TetActivator盒放入含有目的（ 图1C）的基因的调节元件的BAC。所述TetActivator构建体的种系整合可以通过异交个体在预期的表达模式（ 图1D）注入G0鱼和F1中的胚胎的外观AmCyan荧光来评估。生殖INTEG，接着用DOX和外观YFP / YPet荧光（ 图1F）处理：定量和TetResponder转基因的功能性可以通过杂交个体G0注入鱼既定TetActivator鱼（TETA AmCyan这里泛素 ）进行评估。鱼表现出较强且均匀YFP / YPet表达应优先建立了稳定的TetResponder线（ 图1G）。其建立了稳定的TetActivator和TetResponder鱼线，具体TetActivator / TetResponder组合可以通过杂交产生。以下YFP / Ypet的DOX治疗结束出现在发育阶段的TetActivator有效（ 图1H）胚胎发育过程中可被识别的TetActiator和TetResponder转基因载体。可替代地，双转基因鱼可以识别以下DOX治疗，并在再生尾鳍TetResponder转基因诱导（ 图2A - B）。
< P类=“jove_content”>我们经常使用这个系统实现了在斑马鱼再生尾鳍诱导，组织特异性基因表达。我们验证通过的3 DPA鳍回收物的冷冻切片的荧光成像组织特异性TetResponder转基因表达，由于再生的不同组织区室可以清楚地在此时间点（ 图2C）上确定的组织切片。纵向或横向鳍再生部分通过cryoprotecting组织和嵌入鳍再生适当（ 图2D）后cryosectioning获得。以下切片，TetResponder转基因表达（Ypet / YFP荧光）可以使用荧光或共聚焦显微镜（ 图2E）进行成像。需要注意的是her4.3启动子驱动TetActivator诱导近端内侧胚TetResponder表达，而远端胚（箭头）和表皮（箭头）是没有任何表情。 ove_content“>
图1：转基因TetActivator和TetResponder线生成。 （ 一 ）卡通显示策略使用提顿系统组织特异性诱导的基因表达。 （ 二）转基因TetActivator构造（Weidinger实验室质粒数据库中没有。1247）。多接头5'的TetActivator irtTAM2（3F）的方便Çloning感兴趣的调控序列。的AmCyan编码序列从TetActivator经由P2A'自切割“肽分离。该盒还包含一个SV40聚腺苷酸化信号，由TOL2转座子的反向重复序列侧翼并包含一个单一的I-SceI位大范围核酸酶识别位点。 （C）TetActivator卡带BAC重组工程（Weidinger实验室质粒数据库中没有。1180）。所述盒包括的卡那霉素基因的选择，这是由一个GB3原核启动子驱动。 FRT位点侧翼的卡那霉素抗性基因允许其FLP-重组酶去除以下成功融入BAC。 （D）的创始人G0鱼传输her4.3鉴定：泰塔AmCyan构建通过他们的生殖系。运营商通过AmCyan荧光一些F1胚胎（箭头）出现确定。 （ 五）转基因TetResponder构造（Weidinger实验室质粒数据库中没有。1444）。这种构造包括多接头和YPet CDS下优化四环素响应元件控制（TetRE紧，Clontech公司）以及由SV40聚腺苷酸化信号终止。它是由TOL2转座子的反向重复序列侧翼并包含一个单一的I-SceI位大范围核酸酶识别位点。 G0的创始人鱼（F）确定发射功能TetResponder TetRE：AXIN1-YFP构建通过他们的种系。电信运营商是通过用与建立TetActivator线（这里泛素 ：TETA AmCyan）穿越以下DOX治疗6小时（箭头）和诱导YFP荧光。总共12小时DOX治疗后（G）关闭了在（F）表示ofembryos。注还算无处不感应YFP荧光。 （H）搭载鉴定TetActivator（her4.3：TETA AmCyan）双转基因胚胎和TetResponder（TetRE：AXIN1-YFP）的转基因（箭头）。我们的胚胎重新与DOX处理6小时。 （A -高）比例尺：500微米请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在再生斑马鱼尾鳍使用顿系统的组织特异性基因表达。 用于治疗DOX成年斑马鱼（ 一 ）培育箱。 TetRE（二）感应：AXIN1-YFP TetResponder转由her4.3：TETA AmCyan TetActivator在再生尾鳍下12小时DOX治疗。注意没有YFP的荧光在乙醇处理的对照鱼。 （C）的卡通描绘一些中的纵向剖面图中鳍再生发现在3 DPA所述组织区室的。对于cryosectioning（D）样品制备。鳍回收物被放置在组织冷冻介质（TFM）-filled cryomolds，适当定向以获得再生的任一纵向或横向的部分，并转移到一个金属机架上坐在干冰的顶部，直到TFM凝固。剖切面是用红色表示。简称：DIST：远端，PROX：近端，发泄：腹，DORS：背。 （E）的共焦YFP荧光的从在（B）中所示的鳍衍生的鳍射线再生的纵剖面图像。需要注意的是her4.3：TETA AmCyan TetActivator线的近端内侧胚驱动YFP专门诱导。 YFP在各种隔间未检测荧光，包括伤口表皮（箭头），和最远侧域间质（箭头）（BC）的比例尺的：500微米; （五）比例尺：100微米请点击此处查看该图的放大版本。
| TetActivator线 | 参考 | 用于调节元件 | 主要表达于 |
| 7xTCF-Xla.Siam：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan | 韦纳和Weidinger，未公布 | 7xTCF-Xla.Siam的Wnt记者1 | Wnt信号响应组织 |
| MYL7：irtTAM2（3F）-p2a-mCherry | 哈泽和Weidinger，未公布 | MYL7（cmlc2）2 | 成熟的心肌细胞 |
| her4.3：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | 中枢神经系统 |
| keratin4：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | 表皮，在成人翅片不含基底层 |
| keratin18：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | 表皮，在只成年翅片在基底层 |
| SP7：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / OSX 7 | （承诺），成骨细胞 |
| 泛素：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm2 | 3 | 泛素8 | （相当）无处不在 |
表1：可用的转基因TetActivator线下表列出了转基因TetActiva器线用于TetActivator在两个胚胎和成年鱼组织特异性表达，这些都可以从应要求Weidinger实验室。
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Discussion
成年斑马鱼有一个惊人的能力，成功地再生许多内部器官和附属物。深入了解涉及的分子和细胞机制的需要的基因功能和信号通路组织特异性分析。朝此，特顿系统提供了在胚胎和成年斑马鱼spatiotemporally控制基因表达的有效工具。特顿体系结构和方法论在这个手稿中描述已成功应用于最近我们实验室3的研究。建立系统顿时下列几个问题应考虑：
TetActivator转基因设计注意事项
我们以前曾表明，单个诱导TetActivator选自稠合与单纯疱疹病毒VP16反式激活的反四环素阻遏域的M2突变体变体的结构域，衍生物3F [irtTAM2（3F），我N短期TETA-M2]赋予高效的诱导，但可以显示的低，尽管衡量泄漏，这是背景诱导活性在没有强力霉素（DOX）5。因此，我们已经双重描述使用融合与糖皮质激素受体 （TETA-GBD）或蜕皮激素受体 （TETA-ECR）的结构域，其消除泄漏5诱导系统。因此，如果系统将用于表达有毒或非常强的蛋白（ 如，癌基因）使用双重诱导变体应该被考虑。可替代地，建立TetActivator和TetResponder线期间的范围内产生不同的表达水平的行可以选择和选择的情况下泄漏弱诱导剂是一个问题，强烈诱导线。可从应要求Weidinger实验室含TETA-GBD或TETA-ECR变种TetActivator结构。
转基因方法产生的转基因斑马鱼线
TetResponder转基因表达分析
为了检测成人片组织特异性TetResponder转基因的表达，我们通常用冷冻切片的荧光成像。根据我们的经验，通过转基因表达的荧光蛋白的荧光在整个fixatio保存n和cryosectioning过程，因此可以直接成像。额外的方法进行检测TetResponder表达，这已在别处描述的，是：i）免疫染色上的部分，优选地针对荧光蛋白标签，这里YPet，使用抗GFP抗体上的部分，ⅱ）的荧光或显色原位杂交，或iii ）全安装的ISH随后切片。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
作者感谢克里斯塔·哈泽，多丽丝·韦伯和布里吉特科特技术援助。在Weidinger实验室工作是由德意志研究联合会WE 4223 / 3-1的补助，我们4223 / 4-1和德意志GESELLSCHAFT献给Kardiologie通过奥斯卡 - 拉普 - Stipendium和克劳斯 - 乔治·UND-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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