Introduction
Le poisson zèbre est un modèle vertébré organisme bien établi pour étudier de nombreux aspects du développement, de la physiologie, de la maladie, et la régénération. Avec l'adoption croissante de poisson zèbre comme un modèle pour les processus biologiques post-embryonnaires, des outils expérimentaux pour la manipulation inductible, tissu-spécifique de l'expression des gènes ou des voies de signalisation sont devenus de plus en plus importante. En particulier, des études sur l'orgue et la régénération appendice chez le poisson zèbre adultes ont souffert d'un manque d'outils pour la dissection des exigences spatio-temporelles de voies de signalisation au cours de ces processus de régénération.
Actuellement, trois systèmes différents ont été utilisés pour atteindre conditionnelle, expression tissu-spécifique gène dans la régénération des organes de poisson zèbre adulte: le système Cre-lox, expression mosaïque de choc thermique transgènes inductibles utilisant transposon médiée par transgenèse somatique, et le système de Teton 1 -3. Teton se réfère à une variante d'un tétracycline suiteSystème d'activation de la transcription roulé, où l'expression est activée en présence de l'antibiotique tétracycline ou un de ses dérivés, par exemple la doxycycline. Le système Cre-lox, comme il a jusqu'à présent été utilisé chez les poissons adultes, repose sur une recombinase Cre tamoxifène contrôlée (CreERT2), dont l'expression est restreinte spatialement par des éléments régulateurs spécifiques d'un tissu. Enlèvement mécanique de Cre une cassette d'arrêt facilite l'expression du gène d'intérêt entraîné par un promoteur qui devraient être actifs dans tous les types cellulaires 1. création de transposon à médiation par des transgènes exprimés somatiques mosaically fournit un système pour l'expression inductible du transgène dans des lignées cellulaires individuelles. L'injection d'embryons de poisson zèbre avec un transposon Tol2 portant un gène d'intérêt sous contrôle transcriptionnel d'un choc thermique résultats de promoteurs chimériques chez les individus portant généralement le transgène seulement dans les lignées de cellules discrètes d'un organe 2 de régénération. Bien que les deux systèmes permettent conditionnelle tissu spel'expression du gène cifique, le système Cre-lox est pas réversible, et de la stratégie en utilisant l'étiquetage clonale à base de transposons souffre de sa nature stochastique. Ainsi, nous et d'autres avons récemment adapté systèmes de Teton transgéniques pour une utilisation chez le poisson zèbre, qui facilitent le temps et dans l'expression des gènes dans l'espace contrôlé qui est en plus réglable et réversible 3-5.
Le système de Teton utilisé ici comprend une ligne de pilote transgénique (TetActivator) dans lequel un doxycycline (DOX) activateur transcriptionnel inductible par (amélioré transactivateur tetracycline inverse, irtTA, court TetA) est sous le contrôle de séquences régulatrices génomiques spécifiques de tissus. Deuxièmement, il faut une ligne de répondeur transgénique (TetResponder) qui abrite un gène d'intérêt sous le contrôle transcriptionnel de l'opérateur de la tétracycline (élément de réponse Tet; Tetre) (figure 1A). Ainsi, l'utilisation de combinaisons spécifiques de lignes TetActivator et TetResponder permet conditionnelle tissu-spécifiquemanipulation de fic de l'expression génique.
Nous avons récemment utilisé le système de Teton pour sonder pour des fonctions spécifiques de tissus de signalisation Wnt / beta-caténine dans l'adulte régénération queue de poisson zèbre ailette 3. Dans le protocole décrit ici, nous décrivons un flux de travail pour les set-up et l'utilisation du système Teton chez le poisson zèbre, en particulier pour les études de la régénération des nageoires. Cela inclut des instructions détaillées sur la façon de générer TetActivator et TetResponder lignées transgéniques stables et un protocole pour l'induction du transgène dans les embryons de poisson zèbre et adulte. En outre, nous décrivons les techniques de vérification de l'expression du gène tissu-spécifique dans le régénérer fin, y compris un protocole pour la préparation de cryosections d'ailerons de poisson zèbre adultes. En outre, nous discutons de considérations pour la conception du transgène TetActivator, le choix d'une méthode de transgénèse, et la détection de l'expression TetResponder. Par conséquent, l'objectif global de ce protocole est de servir de modèlepour la mise en place d'un système de Teton fonctionnelle chez le poisson zèbre pour obtenir l'expression du gène tissu-spécifique conditionnelle, qui peut être appliquée à tout tissu d'intérêt.
Nous avons créé un vecteur permettant TetActivator pour I-Scel ou génération Tol2 à médiation par des lignes de TetActivator stables utilisant des séquences régulatrices courtes (fragments génomiques d'amplificateur; Weidinger base de plasmide d'aucun laboratoire 1247;. La Figure 1B). Ce produit d'assemblage contient une cassette constituée du TetActivator variante mutant M2 du domaine répresseur Tet inverse condensé avec le virus de l'herpès simplex VP16 domaine de transactivation dérivé 3F [irtTAM2 (3F)]. L'expression de la TetActivator (TETA) peut être facilement surveillée car il est co-exprimé avec l'AmCyan de fluorophore dans le même cadre de lecture ouvert; un peptide p2a médiateur ribosomique à sauter, qui devrait aboutir à la production de TetA et AmCyan que les protéines séparées à un ratio de 1: 5,6 1. Le produit d'assemblage contient également un poylinker 5 'du TCassette etActivator pour faciliter l'insertion de séquences régulatrices du génome d'intérêt en utilisant des procédés de clonage classiques.
En outre, nous avons créé un produit d'assemblage constitué de la cassette décrite ci-dessus TetActivator plus une cassette de sélection à la kanamycine (Weidinger laboratoire base de données de plasmide non 1180;. La figure 1C), qui peut être recombiné dans un chromosome artificiel bactérien (BAC) contenant une grande région génomique ( habituellement dans le codon d'initiation d'un gène dont l'expression motif doit être imité par le transgène). Les deux constructions sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande.
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Protocol
1. Génération de poissons transgéniques TetActivator Lines
- La génération d'assemblage TetActivator
- Séquences régulatrices Clone d'intérêt en amont de la cassette dans le vecteur TetActivator # 1247 utilisant des techniques standard. En variante, en utilisant des techniques de recombinaison pour générer un taux d'alcoolémie, dans lequel la cassette d'TetActivator (vector # 1180) est insérée dans le premier exon du gène cible, et où la Tol2 répétitions inversées sont introduits dans le squelette du BAC (pour un protocole de recombineering détaillée, voir 7,8).
- Préparer l'ADN plasmidique sans toxines ou des préparations BAC ADN en utilisant des kits disponibles dans le commerce.
- Génération de lignées de poisson transgénique TetActivator
- Effectuer microinjection de la construction d'TetActivator selon des procédures standard 9.
- Injecter 25 à 50 pg de l'ADN plasmidique ou l'ADN jusqu'à 250 pg de BAC dans des embryons une cellule à un stade couvert avec codage d'ARN sens pour tra Tol2nsposase pour la transgenèse du transposon médiation, ou avec la protéine I-Scel pour la transgenèse I-Scel-médiation.
NOTE: Considérations sur le choix de la méthode de la transgénèse peuvent être trouvés dans la section de discussion.
REMARQUE: Injecter dans le cytoplasme de préférence, pas le jaune, étant donné que l'efficacité de la transgenèse peut diminuer lorsque l'ADN est pas remis dans le cytoplasme.
- Injecter 25 à 50 pg de l'ADN plasmidique ou l'ADN jusqu'à 250 pg de BAC dans des embryons une cellule à un stade couvert avec codage d'ARN sens pour tra Tol2nsposase pour la transgenèse du transposon médiation, ou avec la protéine I-Scel pour la transgenèse I-Scel-médiation.
- Levez embryons G0 injectés à l'âge adulte. Eventuellement, les embryons G0 écran pour AmCyan fluorescence et préférentiellement poussent embryons présentant le profil d'expression souhaitée. Ceci pourrait augmenter le taux de transmission de la lignée germinale, en particulier pour la transgénèse Tol2 médiation.
- Évaluer l'intégration réussie de la lignée germinale par pollinisation croisée poissons G0 individu de poissons sauvages et l'apparence de la fluorescence AmCyan dans le modèle d'expression prévue dans des embryons de F1 ou de larves en utilisant un stéréomicroscope fluorescent (exemple est montré dans la figure 1D).
- Levez la fluorescence positiveEmbryons F1 à l'âge adulte et de les accoupler avec poissons sauvages pour obtenir stable poissons F2 transgénique.
- Relever et caractériser au moins 3 lignées différentes provenant de différents poissons G0 fondateur, car les lignes individuelles peuvent différer des niveaux d'expression, modèle d'expression, capacité à induire des lignes de TetResponder, perméabilité, et leur sensibilité à taire.
NOTE: Beaucoup transgènes qui sont exprimés dans les embryons robuste sont partiellement ou totalement silencieux dans les larves de stade tardif ou du poisson adulte. Ainsi, si les lignes sont destinés à être utilisés chez les poissons adultes, caractériser plusieurs lignes indépendantes pour leur expression et la fonction TetActivator au cours de l'âge adulte.
NOTE: Nous avons généré un panel de lignées TetActivator pour l'expression tissu-spécifique de la TetActivator à la fois dans les embryons et les poissons adultes, qui sont énumérés dans le tableau 1 Ces lignes sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande..
- Effectuer microinjection de la construction d'TetActivator selon des procédures standard 9.
2. Génération de T transgéniquesetResponder poisson Lines
NOTE: On a généré un produit d'assemblage d'TetResponder permettant de I-Scel ou génération Tol2 à médiation de lignes de TetResponder stables, ce qui est accessible à partir du laboratoire Weidinger sur demande (Weidinger base de données de laboratoire ne plasmide 1444; figure 1E.). Cette construction contient un opérateur tétracycline, suivie par une région de lieur multisite de faciliter l'insertion de séquences codantes (CDS) d'un gène d'intérêt et la séquence codante de la YFP-YPet dérivé. Ainsi, le produit d'assemblage est conçu pour l'expression à médiation par TetA d'une fusion C-terminale de la protéine d'intérêt avec YPet. Si l'expression d'une protéine de fusion étiquetée doit être évitée, un p2a ou t2a peptide peut être introduit avec le gène de la CDS d'intérêt, ce qui facilite la co-expression de la protéine d'intérêt et YPet que des polypeptides séparés 6,10.
- La génération d'assemblage TetResponder
- CDS clone du gène d'intérêt 3 'de l'opérateur de la tétracyclineet 5 'des CDS YPet selon des procédures standard. Assurez-vous que le codon d'arrêt a été enlevé à partir du gène d'intérêt de la CDS.
- Préparer des préparations d'ADN de plasmide libre toxine utilisant des kits disponibles dans le commerce.
- Génération de lignées de poisson transgénique TetResponder
- Lancer la micro-injection de TetResponder construire selon des procédures standard 9.
- Injecter 25 à 50 pg de l'ADN plasmidique dans le cytoplasme d'une cellule d'embryons au stade sens coiffé avec de l'ARN codant pour la transposase de TOL2 transgénèse médiée par transposon ou par enzyme I-Scel pour la transgenèse de la méganucléase assistée.
NOTE: Considérations sur le choix de la méthode de la transgénèse peuvent être trouvés dans la section de discussion.
REMARQUE: Injecter dans le cytoplasme de préférence, pas le jaune, étant donné que l'efficacité de la transgenèse peut diminuer lorsque l'ADN est pas remis dans le cytoplasme.
- Injecter 25 à 50 pg de l'ADN plasmidique dans le cytoplasme d'une cellule d'embryons au stade sens coiffé avec de l'ARN codant pour la transposase de TOL2 transgénèse médiée par transposon ou par enzyme I-Scel pour la transgenèse de la méganucléase assistée.
- Levez injectés embryons G0 à unedulthood.
- Évaluer l'intégration réussie de la lignée germinale et inductibilité du transgène par accouplement poissons G0 individu avec une ligne de TetActivator précédemment établie suivie par le traitement Doxycycline d'embryons de F1 ou de larves de F1.
NOTE: Habituellement, nous utilisons une ligne de TetActivator promoteur axée ubiquitine (ubiquitine: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, court ubiquitine: TetA AmCyan 3) pour dépister les porteurs de TetResponder fonctionnels, que cette ligne entraîne l'expression assez omniprésent dans les embryons et les adultes poissons et est donc bien adapté pour évaluer TetResponder inductibilité dans tous les tissus d'intérêt. Cette ligne est disponible à partir du laboratoire Weidinger sur demande. - Recueillir des embryons de chaque embrayage dans une boîte de 10 cm séparée Pétri contenant du milieu de l'embryon E3 (voir le tableau des matériaux) et incuber plats à 28,5 ° C.
- Lieu G0 poisson qui a donné des embryons dans les réservoirs individuels numérotés (boîtes de reproduction; voir le tableau des matériaux) jusqu'à ce que les embryons ont été écranéd. Ce qui permet une récupération de G0 poissons qui montrent germe transmission en ligne du transgène.
- Si seulement la moitié des embryons sont supposées effectuer le transgène TetActivator (dans le cas d'un support de TetActivator hétérozygote a été franchi à un fondateur poissons TetResponder), sélectionnez pour les embryons contenant le transgène de TetActivator par l'apparition d'AmCyan fluorescence au stade de développement approprié.
- Induire une activité transcriptionnelle TetActivator en traitant embryons avec doxycycline (DOX), comme décrit dans la section 2.3.
- Embryons écran F1 pour YPet émergence de fluorescence. Préférez lignes (poissons G0) qui produisent de l'expression de YPet homogène, qui est embryons dans l'embrayage devraient afficher peu de mosaïque dans le domaine d'expression attendu et peu de variation entre les embryons individuels. Voir pointes de flèches en figure 1F et la figure 1G pour des exemples représentatifs.
- Compagnon G0 poissons transmettre un transgène TetResponder inductible identifiés dansl'étape 2.2.8 avec poissons sauvages et d'élever tous les embryons F1 à l'âge adulte.
- Identifier les poissons adultes F1 transgénique soit par génotypage basé sur la PCR (voir section ou par croisement poisson F1 individu à une ligne de TetActivator suivie par un traitement DOX d'embryons de F2 et l'émergence de YPet fluorescence (voir section 2.5).
- Établir et caractériser au moins 3 lignées de TetResponder différentes provenant de différents poissons G0 fondateur, depuis inductibilité peut différer dans les lignes individuelles. En particulier, les niveaux d'expression et réalisables si le répondeur peut être activé dans tous les types de cellules peuvent varier. En outre, la sensibilité à silençage sera différent entre les lignes. Enfin, dans certains cas, il peut être préférable de sélectionner des lignes qui interviennent seulement les niveaux d'expression modérée de la protéine d'intérêt, en particulier si on prévoit que l'expression fuit produit en combinaison avec une ligne de TetActivator en l'absence de doxycycline de causer des anomalies du développement ou de la toxicité.
NOTE: Tetlignes de répondeur qui sont solidement inductible dans les embryons peuvent être partiellement ou complètement réduits au silence dans les larves de stade tardif ou du poisson adulte. Ainsi, si les lignes sont destinées à être utilisées dans les poissons adultes, plusieurs lignes indépendantes devraient être caractérisés pour inductibilité chez les adultes. Si l'induction du gène d'intérêt est compatible avec le développement, il a été prouvé utile pour créer des embryons doubles transgéniques (TetActivator x TetResponder), pour induire une expression GOI dans les embryons et pour sélectionner et augmenter seulement les individus montrant la mosaïque plus robuste et moins induction. - Pour maintenir et propager lignes de TetResponder établies, poissons adultes de génotype tel que décrit à la section 2.5).
- Lancer la micro-injection de TetResponder construire selon des procédures standard 9.
- Doxycycline traitement des embryons
- Préparer 2,000x doxycycline (DOX) des stocks. Résoudre DOX dans 50% de EtOH pour obtenir une concentration de 50 mg / ml (97 mM). Magasin des stocks DOX abri de la lumière à -20 ° C.
- Décanter la majorité de milieu E3 à partir d'embryons et le remplacer parE3 moyen d'embryons contenant DOX à une concentration finale de 25 pg / ml DOX (2,5 pi de 2,000x DOX stocks par 50 ml E3). Dechorionation est pas nécessaire.
- Embryons revenir à 28,5 ° C pendant un minimum de 6 heures avant d'évaluer l'expression du gène d'intérêt marqué par l'apparition d'YPet fluorescence.
- Évaluer perméabilité de la TetActivator / TetResponder combinaison en traitant embryons avec EtOH solvant seulement.
NOTE: L'hybridation in situ (ISH) ou RT-PCR pour détecter l'ARNm TetResponder peut être utilisé en tant que mesures de perméabilité plus sensibles que la fluorescence du gène marqué d'intérêt. L'étendue de la perméabilité dépend de la combinaison de ligne TetActivator / de TetResponder particulier et elle peut aussi varier entre des tissus et des stades de développement.
- L'anesthésie de poisson zèbre adulte
- Préparer 10 cm de diamètre boîte de Pétri ou petit gobelet rempli d'eau du système de poisson contenant 1 mg / ml de tricaïne (Ethyl-3 benzoate methanesulfonate, MS-222).
- Transfert des poissons dans un conteneur contenant un anesthésique et d'attendre jusqu'à ce qu'il atteigne le niveau 4 de l'anesthésie, comme indiqué par la perte complète de l'équilibre (le poisson se trouve sur le côté), pas de mouvements et pas de réponse à toucher 11.
- Transvaser soigneusement le poisson avec des ciseaux ou une cuillère sur une lame de verre, couvercle d'une boîte de Petri en plastique, ou boîte de Pétri agarose revêtues et effectuer amputation ailette ou l'imagerie (voir section 3.2).
- Poissons revenir à un récipient contenant un grand volume d'eau du système de poisson frais et de le surveiller. Si les mouvements maillants ne reprennent pas moins de 3 min, aider par l'eau qui souffle sur les branchies en utilisant une pipette de transfert en plastique.
- Génotypage de poissons TetResponder basé sur la PCR
- Effectuer amputation partielle de la nageoire caudale 12. Placer le poisson dans les réservoirs individuels, numérotées (boîtes de reproduction; voir le tableau des matériaux). Cela permet la récupération des poissons transgéniques suivante génotypage succès.
- Tratissus ailettes nsfer à puits individuels d'une plaque à 96 puits PCR pré-rempli avec de l'eau libre de DNase 20 pi pour l'isolement de l'ADN génomique 13.
- Ajouter 120 ul de NaOH 1 M à chaque puits et incuber les échantillons pendant 20 min à 95 ° C en utilisant un thermocycleur.
- Chill échantillons à 4 ° C, ajouter 14 pl de 1 M de Tris-HCl (pH 8,0) à chaque puits, et les échantillons de vortex brièvement. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 16 000 x g pour sédimenter les débris cellulaires. Stocker l'ADN génomique à 4 ° C jusqu'à utilisation.
- Concevoir des amorces pour amplifier spécifiquement un fragment du transgène TetResponder. Utiliser 2 ul d'ADN isolé dans une réaction PCR standard et d'analyser les produits de PCR sur un gel d'agarose.
Induction 3. Tissue-spécifique de l'expression transgénique dans la queue de poisson zèbre adulte Régénérant Fin
- Mise en place d'TetActivator; TetResponder deux poissons transgéniques
- Accoupler transporteurs TetActivator avec TetResponder carriERS.
- Sélectionnez embryons portant le transgène de TetActivator à un stade de développement où les éléments de régulation de conduire la cassette de TetActivator sont actifs. Embryons transgéniques peuvent être facilement identifiés par l'apparition d'AmCyan fluorescence en utilisant un microscope à fluorescence stéréo.
REMARQUE: les poissons transgéniques positif TetActivator peuvent également être identifiés au cours de l'âge adulte par imagerie de poissons anesthésié, par exemple. suite de l'amputation de la nageoire caudale et l'émergence de la fluorescence AmCyan dans le régénérer. - Levez embryons sélectionnés à l'âge adulte.
- Identifier les poissons à double transgénique adulte (qui portent le poisson TetResponder en plus de la TetActivator) par génotypage basé sur la PCR ou (de préférence) par leur aptitude à induire l'expression de la TetResponder dans le tissu d'intérêt. Un protocole pour TetResponder induction et la détection dans la queue régénération ailette est décrit à la section 2.3 et l'article 4.
NOTE: Si l'expression de TetResponder transitoire est compatibleavec la poursuite du développement embryonnaire ou larvaire, il est utile d'identifier les embryons doubles transgéniques portant TetActivator et TetResponder transgènes après le traitement DOX pendant le développement embryonnaire comme décrit ci-dessus (point 2.3, figure 1H). Embryons doubles positifs montrer AmCyan et YPet fluorescence. Levez embryons positifs à l'âge adulte.
- L'amputation des ailerons de queue de poisson zèbre et l'induction de l'expression du transgène dans la régénération de l'ailette
- Effectuer amputation partielle de la nageoire caudale des poissons anesthésiés (voir section 2.4) 12. Traiter les poissons soit immédiatement avec DOX ou les renvoyer au système de logements de poisson.
- Préparer boîte de reproduction (figure 2A; voir le tableau des matériaux) rempli avec 1 L d'eau du système de poisson contenant 25 pg / ml DOX (ajouter 500 pi de 2,000x 50 mg / ml ml à 1 L d'eau du système de poisson).
NOTE: L'induction de l'expression du transgène immédiatement après amputation permet aussiimposition d 'effets sur les premiers événements au cours de la régénération, tandis que l'induction à 3 jours après l'amputation (3 dpa) devrait être utilisé pour évaluer l'expression ou la fonction transgène pendant la croissance régénératrice. - Transférer jusqu'à 10 précédemment amputée, double poisson transgénique à la boîte de l'élevage et à proximité boîte avec un couvercle tels que les poissons ne peuvent pas échapper (figure 2A).
- Placer des boîtes de reproduction dans le noir pour réduire le stress. Nous plaçons généralement les boîtes dans un C air incubateur 28,5 ° pour assurer l'obscurité et à température constante.
- Traiter négative double contrôle poissons transgéniques avec EtOH seulement (250 pi par l'eau du système de poisson 1L).
NOTE: transgénique simple ou de type sauvage poissons traités avec DOX peuvent être utilisées comme contrôle négatif supplémentaire, bien que nous ayons jamais observé des effets indésirables des doses DOX utilisées ici sur la régénération des nageoires. - Anesthésier poissons comme décrit dans la section 2.4 et les poissons de transfert en utilisant une pince à épiler ou une cuillère sur une Pétri d'agarose revêtues mouillée plat. Étaler soigneusement la nageoire caudale en utilisant une pince à épiler.
- poissons de l'écran pour l'apparence de YPet dans le régénérer avec une chaîne stéréo-microscope à fluorescence (figure 2B).
NOTE: Habituellement, la fluorescence entraîné TetResponder-peut être observée robuste suivante 6 h du traitement DOX. Toutefois, nous vous recommandons pour caractériser la dynamique d'expression TetResponder pour chaque ligne générée. - Poissons revenir au système de logements de poissons de mettre fin à TetResponder induction du transgène ou de poursuivre les traitements.
NOTE: Pour les traitements> 24 h (traitements à long terme), il est essentiel d'échanger l'eau et nettoyer les zones de reproduction quotidienne. - Pendant les traitements à long terme, les poissons d'alimentation tous les 2-3 jours en transférant les poissons dans un récipient propre avec de l'eau du système de poisson frais avant de les renvoyer à des boîtes de reproduction après le repas.
4. Caractérisation des TetResponder expression dans Fin Régénère
t "> NOTE:. Nous vérifions généralement l'expression de gènes spécifiques de tissu dans la nageoire caudale régénération utilisant l'imagerie de fluorescence de cryosections à 3 dpa A ce point de temps, les différents compartiments de tissus d'un régénéré sont formés et peuvent être clairement identifiés sur tissus-sections, et cryosectioning est plus simple que lors des étapes ultérieures de la régénération. Figure 2C montre les domaines de tissus qui peuvent être distingués dans le régénérer et énumère quelques marqueurs moléculaires pour ces domaines. Le protocole suivant décrit la préparation de cryosections longitudinales ou transversales pour l'imagerie directe ou immunocoloration .- Cryosectioning des adultes ailerons
- Traiter les poissons dont les nageoires de queue ont été amputée de 2 dpa jusqu'au 3 dpa avec DOX comme décrit dans la section 3.2
- Anesthésier poissons comme décrit dans la section 2.4
- Utilisez une cuillère ou une pince à épiler pour transférer délicatement le poisson sur un couvercle d'une boîte de Petri en plastique.
- Re-amputer la régénérer fin à environ 4-5 segments osseuxs proximale au plan d'amputation initiale à l'aide d'un scalpel et retourner le poisson à l'eau du système de poisson frais.
- Soigneusement transfert régénère à une petite boîte de Pétri (par exemple, 35 mm) contenant 4% (p / v) paraformaldéhyde (PFA) dans une solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS; voir le tableau des matériaux) en utilisant des pinces fines. Ne touchez pas la régénérer mais seulement la partie de souche du tissu.
- Placez le tissu à plat sur le fond de la boîte de Pétri et fixer O / N à 4 ° C.
- Laver régénère deux fois dans 1 x PBS contenant 0,1% de Tween (PBT) pour éliminer PFA et incuber régénère o / n à 4 ° C dans 0,5 M de PBS-EDTA (pH 7,5) à décalcifier la matrice osseuse.
- Incuber régénère à la température ambiante dans 10% de saccharose-PBS, 20% de saccharose-PBS, 30% de saccharose-PBS et 30% de saccharose-PBS: tissu milieu de congélation à un rapport 1: 1 (TFM; voir le tableau des matériaux) pendant 30 minutes chacun. Par la suite, ailettes incuber à 4 ° C pendant> 2 heures dans le tissu milieu de congélation.
- Placez cryomoules sur une lame de microscope et remplir lem avec un milieu de congélation de tissu. Éviter d'introduire des bulles d'air.
- Transfert régénère en cryomoules et tissu orienter de manière appropriée pour obtenir des sections longitudinales ou transversales de régénère ailettes (Figure 2D). Veiller à ce que régénéré est droit, ce qui facilite la coupe.
- Transfert cryomoules avec lame de microscope sur une grille métallique placé sur un lit de glace sèche pour démarrer le processus de congélation (figure 2D).
- Une fois que le milieu de congélation de tissu est devenu solide, placez cryomoule sur banc et laisser reposer à température ambiante pendant quelques minutes de telle sorte que le tissu milieu de congélation dégèle à l'interface en plastique moyennes.
- Utilisez un stylo ou similaire pour pousser le bloc congelé de la cryomoule. cryoblocks de magasins dans une boîte à -80 ° C jusqu'à ce que le sectionnement de tissu.
- Préparer 10-14 um d'épaisseur en utilisant un cryosections Cryo-microtome et de recueillir des coupes sur des lames de microscope d'adhésion (voir le tableau des matériaux). Stocker les lames à -20 ° C jusqu'à ce que neEDED.
- Caractérisation de l'expression TetResponder sur des sections d'ailettes basées sur la fluorescence YPet
- Traiter sections d'ailettes pendant 30 min avec 100% de MeOH refroidi à -20 ° C pour améliorer l'adhérence à la lame de microscope suivie par deux lavages à RT en PBT et 1 lavage dans PBS, 5 minutes chacun.
- Visualiser les noyaux par des sections en incubation pendant 10 min à 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (DAPI) dans le PBS (1: 5000), suivi par deux lavages de 10 minutes chacun dans du PBS.
- Sections de montage dans 75% de glycérol-PBS ou disponibles dans le commerce monte Antifade, et couvrent avec une lamelle.
- YPet image et la fluorescence confocale AmCyan sous un grand champ ou microscope à fluorescence (figure 1E).
Remarque: Afin de faciliter l'identification sans ambiguïté des types cellulaires exprimant YPet, immunohistochimie ou immunofluorescence avec des anticorps contre des antigènes spécifiques de type de cellule avec des anticorps anti-GFP (qui réagissent avec YPet, mais pas AmCyan) peut être effectuée. Sinon, pour faciliter la détection de faible expression de YPet, hybridation d'ARN in situ contre YPet ARN peut être effectuée soit sur l'ensemble de montage des ailettes ou des sections de paraffine d'ailettes.
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Representative Results
Pour établir un système de Teton fonctionnel pour l'expression du gène inductible tissu-spécifique, TetActivator lignées transgéniques et TetResponder besoin d'être généré (figure 1A). Ceci est réalisé par micro-injection TetActivator (figure 1B - C) ou TetResponder (figure 1E) construit en début des embryons de poisson zèbre et l'intégration de la lignée germinale ultérieure. Constructions de TetActivator fonctionnels peuvent soit être générés par clonage de séquences régulatrices courtes (éléments amplificateurs) en amont de la cassette de TetActivator (figure 1B), ou par recombinaison de la cassette de TetActivator dans un BAC contenant des éléments de régulation du gène d'intérêt (Figure 1C). l'intégration de la lignée germinale de la construction de TetActivator peut être évaluée par des croisements individuelle injecté poissons G0 et l'apparence de AmCyan fluorescence dans des embryons de F1 dans le modèle d'expression attendu (figure 1D). Germline integration et la fonctionnalité du transgène TetResponder peuvent être évalués en traversant G0 individu poisson à poisson injecté TetActivator établi (ici ubiquitine: TetA AmCyan), suivie d'un traitement avec DOX et de l'apparence de la YFP / YPet fluorescence (figure 1F). Poissons montrant l'expression YFP / YPet forte et homogène doit être préférée à établir une ligne de TetResponder stable (figure 1G). Ayant établi TetActivator stable et les lignes de poissons TetResponder, des combinaisons spécifiques TetActivator / de TetResponder peut être générée par le croisement. Les transporteurs de TetActiator et TetResponder transgènes peuvent être identifiés lors de l'embryogenèse après le traitement DOX fin émergence de YFP / Ypet au stade du développement de la TetActivator est actif (Figure 1H). Alternativement, doubles poissons transgéniques peuvent être identifiés après le traitement DOX et TetResponder induction du transgène dans la queue régénération ailette (Figure 2A - B).
< p class = "jove_content"> Nous utilisons régulièrement ce système pour atteindre inductible, l'expression du gène tissu-spécifique dans la queue de poisson zèbre régénération fin. Nous vérifions tissu-spécifique TetResponder expression du transgène par imagerie de fluorescence de cryosections de 3 dpa régénère ailettes, puisque les différents compartiments de tissus d'un régénéré peuvent être clairement identifiés sur les tissus-sections à ce point dans le temps (figure 2C). Ailette longitudinale ou transversale régénérer sections sont obtenus par cryosectioning après tissus cryoprotecteur et l'incorporation fin régénérer de manière appropriée (figure 2D). Après sectionnement, l'expression du transgène TetResponder (Ypet / YFP de fluorescence) peut être imagée en utilisant la fluorescence ou la microscopie confocale (figure 2E). Notez que le TetActivator her4.3 promoteur axée induit l'expression TetResponder dans le blastème médiale proximale, tandis que le blastème distale (pointe de flèche) et l'épiderme (flèche) sont dépourvues d'expression. ove_content ">
Figure 1: Génération de TetActivator et TetResponder lignées transgéniques. (A) de bande dessinée montrant la stratégie pour l'expression génique inductible tissu-spécifique en utilisant le système de Teton. (B) transgénique TetActivator construire (base de données de plasmide laboratoire Weidinger pas. 1247). Un lieur multisite 5 'de la TetActivator irtTAM2 (3F) facilite cLoning de séquences régulatrices d'intérêt. La séquence codante AmCyan est séparée de la TetActivator via un peptide p2a 'auto-clivage. La cassette contient également un signal de polyadénylation du SV40, est flanqué de répétitions inversées Tol2 transposon et contient un seul site de reconnaissance de la méganucléase I-Scel. (C) cassette TetActivator pour BAC recombineering (base de données de plasmide laboratoire Weidinger pas. 1180). La cassette comprend le gène de kanamycine pour la sélection, qui est entraînée par un promoteur procaryote Gb3. Sites FRT flanquant le gène de résistance à la kanamycine permettent pour son Flp recombinase élimination médiée par suite de l'intégration réussie dans la BAC. (D) d'identification de G0 fondateur poissons transmettre le her4.3: TetA AmCyan construire à travers leur lignée germinale. Les transporteurs sont identifiés par l'émergence de la fluorescence AmCyan dans certains embryons F1 (pointes de flèche). (E) transgénique TetResponder construire (base de données de plasmide laboratoire Weidinger pas. 1444).Ce construit se compose d'un polylinker et YPet CDS sous le contrôle d'éléments de réponse optimisés Tet (Tetre étanche, Clontech) et terminé par le signal de polyadénylation de SV40. Elle est flanquée par des répétitions inversées Tol2 transposon et contient un seul site de reconnaissance de la méganucléase I-Scel. (F) d'identification de G0 fondateur poissons transmettre un fonctionnelle TetResponder Tetre: Axin1-YFP construire à travers leur lignée germinale. Les transporteurs sont identifiés par croisement avec une ligne établie de TetActivator (ici ubiquitine: TetA AmCyan) et l'induction de la YFP fluorescence après traitement DOX pendant 6 heures (pointes de flèches). (G) Close up ofembryos indiquées dans (F) après un total de 12 heures de traitement DOX. Remarque induction assez omniprésente de YFP fluorescence. (H) d'identification des embryons doubles transgéniques portant TetActivator (her4.3: TetA AmCyan) et TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgènes (pointes de flèches). Embryons nousêtes traité avec DOX pendant 6 heures. (A - H) Barre d'échelle: 500 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Utilisation du système de téton pour l'expression génique spécifique à un tissu dans la queue du poisson zèbre régénération ailette. (A) des boîtes d'élevage utilisés pour le traitement du poisson zèbre DOX adulte. (B) Induction de Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgène par le her4.3: TetA AmCyan TetActivatordans la queue régénération fin après 12 h de traitement DOX. Notez l'absence de YFP fluorescence dans le poisson de contrôle EtOH-traitée. (C) Caricature montrant certains des compartiments de tissus trouvés dans un régénérer fin au 3 dpa dans une vue en coupe longitudinale. (D) La préparation des échantillons pour cryosectioning. Régénère ailettes sont placés dans un milieu de tissu-gel (TFM) -filled cryomoules, orientées de manière appropriée pour obtenir des sections soit longitudinal ou transversal de la régénérer, et transférés à un support en métal assis sur le dessus de la glace sèche jusqu'à ce que TFM a solidifié. Plan de coupe est indiquée en rouge. Abréviations: dist .: distale, prox .: proximales, évent .: ventrale, dors .: dorsale. (E) l'image confocale de fluorescence YFP dans une section longitudinale d'un régénérer rayon de la nageoire dérivé de nageoires indiqués en (B). Notez que le her4.3: ligne TetA AmCyan TetActivator conduit YFP induction spécifiquement dans le blastème proximale-médiale. YFPla fluorescence est détecté dans une série de compartiments, dont l'épiderme de la plaie (flèche), et la plus distale du domaine mésenchyme (tête de flèche) (BC) de la barre d'échelle: 500 um; (E) Barre d'échelle:. 100 um S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Ligne TetActivator | Référence | Les éléments de régulation utilisés | Principalement exprimée en |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner & Weidinger, inédit | 7xTCF-Xla.Siam Wnt journaliste 1 | Tissus sensibles Wnt- |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase & Weidinger, inédit | myl7 (cmlc2) 2 | cardiomyocytes matures |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | système nerveux central |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | épiderme, dans la nageoire adulte à l'exclusion de la couche basale |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | épiderme, dans la nageoire adulte exclusivement dans la couche basale |
| sp7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | sp7 / osx 7 | (Commis) ostéoblastes |
| ubiquitine: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitine 8 | (Assez) ubiquitaire |
Tableau 1:. Lignes de TetActivator transgéniques disponibles Ce tableau répertorie TetActiva transgéniquelignes de Tor expression tissu-spécifique de la TetActivator dans les deux poissons embryonnaires et adultes, qui sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande.
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Discussion
Le poisson zèbre adulte a une étonnante capacité à se régénérer avec succès de nombreux organes internes et des appendices. Une compréhension approfondie des mécanismes moléculaires et cellulaires impliqués requiert une analyse spécifique du tissu des fonctions des gènes et voies de signalisation. Dans ce sens, le système de Teton fournit un outil efficace pour l'expression du gène spatiotemporellement contrôlée chez le poisson zèbre embryonnaire et adulte. Les constructions du système de Teton et de la méthodologie décrits dans ce manuscrit ont été utilisés avec succès dans une étude récente de notre laboratoire 3. Les questions supplémentaires suivants doivent être considérés lors de l'établissement du système de Teton:
TetActivator considérations de conception du transgène
Nous avons précédemment montré que seul un TetActivator inductible consistant en le variant mutant M2 du domaine répresseur Tet inverse condensé avec le virus de l'herpès simplex VP16 domaine de transactivation dérivé 3F [irtTAM2 (3F), in court TetA-M2] confère induction efficace, mais peut montrer faible, quoique leakiness mesurable, qui est fond induire une activité en l'absence de doxycycline (DOX) 5. Par conséquent, nous avons décrit doublement systèmes inductibles en utilisant des fusions avec un récepteur de glucocorticoïdes (TETA-GBD) ou un domaine du récepteur de l'ecdysone (TETA-CER), qui éliminent 5 perméabilité. Ainsi, si le système sera utilisé pour exprimer des protéines toxiques ou très puissants (par exemple, oncogènes) l'utilisation d'une variante doublement inductible devrait être envisagée. Sinon, lors de l'établissement de lignes TetActivator et TetResponder une gamme de lignes de production différents niveaux d'expression peut être sélectionné et inducteurs faibles choisis en cas perméabilité est une question avec des lignes fortement induisant. constructions de TetActivator contenant la variante TetA-GBD ou TetA-EcR sont disponibles auprès du laboratoire Weidinger sur demande.
méthodes de transgenèse pour la production de lignes de poisson zèbre transgénique
TetResponder analyse de l'expression du transgène
Pour détecter l'expression TetResponder transgène tissu-spécifique dans les ailettes adultes nous utilisons habituellement l'imagerie de fluorescence de cryosections. Dans notre expérience, la fluorescence des protéines fluorescentes exprimées par le transgène est préservée tout au long du FIXATIOn et cryosectioning procédure et peut donc être directement imagé. Des procédés supplémentaires pour la détection de l'expression TetResponder, qui ont été décrits ailleurs, sont les suivants: i) immunocoloration sur des coupes, de préférence contre l'étiquette de la protéine fluorescente, ici YPet, en utilisant un anticorps anti-GFP, ii) fluorescent ou chromogène ISH sur les sections, ou iii ) toute monture ISH suivie par sectionnement.
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Disclosures
Les auteurs ont rien à révéler.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Christa Haase, Doris Weber et Brigitte Korte pour l'assistance technique. Le travail dans le laboratoire Weidinger est financé par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 et par la Deutsche Gesellschaft für Kardiologie via un Oskar-Lapp-Stipendium et Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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