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Developmental Biology

Teton सिस्टम का प्रयोग आणविक तंत्र Zebrafish उत्थान के अध्ययन के लिए

Published: June 25, 2015 doi: 10.3791/52756
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Institute for Biochemistry and Molecular Biology, Ulm University
* These authors contributed equally

Introduction

zebrafish विकास, शरीर क्रिया विज्ञान, रोग, और उत्थान के कई पहलुओं का अध्ययन करने के लिए एक अच्छी तरह से स्थापित कशेरुकी मॉडल जीव है। जीन की अभिव्यक्ति या संकेत दे रास्ते के inducible, ऊतक विशेष हेरफेर के लिए पोस्ट-भ्रूण जैविक प्रक्रियाओं, प्रायोगिक उपकरण के लिए एक मॉडल के रूप में zebrafish के बढ़ते गोद लेने के साथ तेजी से महत्वपूर्ण बन गए हैं। विशेष रूप से, वयस्क zebrafish में अंग और उपांग उत्थान में पढ़ाई इन पुनर्योजी प्रक्रिया के दौरान रास्ते संकेतन की spatio- लौकिक आवश्यकताओं के विच्छेदन के लिए उपकरणों की कमी से नुकसान उठाना पड़ा है।

वर्तमान में, तीन अलग अलग प्रणालियों सशर्त, ऊतक विशेष वयस्क zebrafish के अंगों regenerating में जीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया गया है: रचनात्मक-Lox प्रणाली, transposon की मध्यस्थता दैहिक transgenesis का उपयोग कर गर्मी सदमे inducible transgenes की मोज़ेक अभिव्यक्ति, और Teton प्रणाली 1 -3। Teton एक टेट्रासाइक्लिन शेष भाग का एक संस्करण को संदर्भित करता हैअभिव्यक्ति एंटीबायोटिक टेट्रासाइक्लिन या एक व्युत्पन्न, जैसे डॉक्सीसाइक्लिन की उपस्थिति में सक्रिय है, जहां लुढ़का ट्रांसक्रिप्शनल सक्रियण प्रणाली,। यह अब तक वयस्क मछली में इस्तेमाल किया गया है के रूप में रचनात्मक-Lox प्रणाली, जिनकी अभिव्यक्ति स्थानिक ऊतक विशेष नियामक तत्वों के द्वारा प्रतिबंधित है एक Tamoxifen नियंत्रित Cre recombinase (CreERT2), पर निर्भर करता है। एक बंद करो कैसेट की रचनात्मक चालित हटाने सभी प्रकार की कोशिकाओं 1 में सक्रिय होना चाहिए कि एक प्रमोटर द्वारा संचालित हित के जीन की अभिव्यक्ति की सुविधा। Mosaically व्यक्त दैहिक transgenes की transposon की मध्यस्थता सृजन व्यक्तिगत सेल प्रजातियों में inducible transgene अभिव्यक्ति के लिए एक प्रणाली प्रदान करता है। आम तौर पर केवल एक regenerating अंग 2 के असतत सेल प्रजातियों में transgene ले जाने काइमेरिक व्यक्तियों में एक गर्मी झटका प्रमोटर परिणामों की ट्रांसक्रिप्शनल नियंत्रण के तहत ब्याज की एक जीन ले जाने के एक Tol2 transposon साथ zebrafish भ्रूण का इंजेक्शन। दोनों प्रणालियों सशर्त ऊतक-विशेष के लिए अनुमतिcific जीन अभिव्यक्ति, रचनात्मक-Lox प्रणाली प्रतिवर्ती नहीं है, और transposon आधारित प्रतिरूप लेबलिंग का उपयोग कर रणनीति से उसके स्टोकेस्टिक प्रकृति से ग्रस्त है। इस प्रकार, हम और दूसरों को हाल ही में अस्थायी और इसके अलावा ट्यून करने योग्य और प्रतिवर्ती 3-5 में है कि स्थानिक नियंत्रित जीन की अभिव्यक्ति को सुविधाजनक बनाने के जो zebrafish में उपयोग के लिए ट्रांसजेनिक Teton प्रणाली, ढाल लिया है।

यहां इस्तेमाल किया Teton प्रणाली एक डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) -inducible ट्रांसक्रिप्शनल उत्प्रेरक (रिवर्स टेट्रासाइक्लिन transactivator, irtTA, लघु Teta सुधार हुआ) ऊतक विशेष जीनोमिक विनियामक दृश्यों के नियंत्रण में है, जिसमें एक ट्रांसजेनिक चालक लाइन (TetActivator) शामिल हैं। (; TetRE Tet प्रतिक्रिया तत्व) (चित्रा 1 ए) दूसरे, यह एक ट्रांसजेनिक प्रत्युत्तर लाइन टेट्रासाइक्लिन ऑपरेटर के transcriptional नियंत्रण के तहत ब्याज की एक जीन बंदरगाहों कि (TetResponder) की आवश्यकता है। इस प्रकार, TetActivator और TetResponder लाइनों के विशिष्ट संयोजन का उपयोग सशर्त ऊतक-तकनीक और नवीनता के लिए अनुमति देता हैजीन अभिव्यक्ति की FIC हेरफेर।

हमने हाल ही में zebrafish पूंछ पंख 3 regenerating वयस्क में Wnt / बीटा catenin संकेतन के ऊतक विशेष कार्यों के लिए जांच करने के लिए Teton प्रणाली का उपयोग किया है। यहाँ उल्लिखित प्रोटोकॉल में हम फिन उत्थान के अध्ययन के लिए विशेष रूप से zebrafish में Teton प्रणाली का सेट अप और उपयोग करते हैं, के लिए एक काम के प्रवाह का वर्णन है। इस विस्तृत स्थिर ट्रांसजेनिक TetActivator और TetResponder लाइनों उत्पन्न करने के निर्देश और भ्रूण और वयस्क zebrafish में transgene शामिल करने के लिए एक प्रोटोकॉल शामिल है। इसके अलावा, हम वयस्क zebrafish पंख की cryosections की तैयारी के लिए एक प्रोटोकॉल सहित फिन पुनर्जन्म में ऊतक विशेष जीन की अभिव्यक्ति के सत्यापन के लिए तकनीक का वर्णन है। इसके अतिरिक्त, हम TetResponder अभिव्यक्ति की TetActivator transgene की डिजाइन, एक transgenesis विधि का विकल्प है, और पता लगाने के लिए विचार पर चर्चा की। इसलिए, इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य के लिए एक खाका के रूप में सेवा करने के लिए हैसेटिंग-अप एक कार्यात्मक Teton प्रणाली zebrafish में ब्याज की किसी भी ऊतक को लागू किया जा सकता है, जो सशर्त ऊतक विशेष जीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए।

हम मैं-SCEI या कम जीनोमिक विनियामक दृश्यों का उपयोग स्थिर TetActivator लाइनों की Tol2 की मध्यस्थता पीढ़ी के लिए अनुमति TetActivator वेक्टर बनाया है (बढ़ाने के टुकड़े; Weidinger प्रयोगशाला प्लाज्मिड डेटाबेस में कोई 1247;। चित्रा 1 बी)। इस का निर्माण दाद सिंप्लेक्स वायरस VP16 transactivation डोमेन-व्युत्पन्न 3F [irtTAM2 (3F)] के साथ जुड़े हुए रिवर्स Tet repressor डोमेन के m2 उत्परिवर्ती संस्करण से मिलकर TetActivator कैसेट शामिल हैं। यह सह व्यक्त ही खुला पढ़ने फ्रेम से फ्लोरोफोरे AmCyan के साथ है के बाद से TetActivator (Teta) की अभिव्यक्ति आसानी से नजर रखी जा सकती है; 1 के अनुपात 5,6: एक P2A पेप्टाइड एक 1 पर अलग प्रोटीन के रूप में Teta और AmCyan के उत्पादन में परिणाम चाहिए जो राइबोसोमल लंघन, मध्यस्थता करता है। निर्माण भी टी की 'एक poylinker 5 में शामिलetActivator कैसेट पारंपरिक क्लोनिंग तरीकों का उपयोग कर ब्याज की जीनोमिक विनियामक दृश्यों की प्रविष्टि की सुविधा के लिए।

(एक बड़े जीनोमिक क्षेत्र से युक्त एक जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्र में recombined किया जा सकता है, जो (बीएसी); इसके अतिरिक्त, हम ऊपर वर्णित TetActivator कैसेट प्लस एक kanamycin चयन कैसेट (चित्रा 1C। Weidinger प्रयोगशाला प्लाज्मिड डेटाबेस में कोई 1180) से मिलकर निर्माण बनाया है आमतौर पर जिनकी अभिव्यक्ति पैटर्न है transgene द्वारा मजाक उड़ाया जा सकता है) एक जीन की शुरुआत कोडोन में। दोनों निर्माणों अनुरोध पर Weidinger प्रयोगशाला से उपलब्ध हैं।

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Protocol

ट्रांसजेनिक TetActivator मछली लाइन्स 1. पीढ़ी

  1. TetActivator निर्माण का सृजन
    1. वेक्टर # में TetActivator कैसेट के हित नदी के ऊपर का क्लोन विनियामक दृश्यों 1247 मानक तकनीक का उपयोग कर। वैकल्पिक रूप से, TetActivator कैसेट (वेक्टर # 1180) लक्ष्य जीन की पहली एक्सॉन में डाला जाता है, जिसमें एक बीएसी, उत्पन्न करने के लिए पुनर्संयोजन तकनीक का उपयोग करें, और Tol2 दोहराता देखना एक विस्तृत recombineering प्रोटोकॉल के लिए (बीएसी रीढ़ की हड्डी में पेश कर रहे हैं उल्टे जहां 7,8)।
    2. विष से मुक्त प्लास्मिड डीएनए या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर बीएसी डीएनए की तैयारी तैयार करें।
  2. ट्रांसजेनिक TetActivator मछली लाइनों की पीढ़ी
    1. मानक प्रक्रियाओं 9 के अनुसार TetActivator निर्माण के microinjection प्रदर्शन करते हैं।
      1. Tol2 टीआरए के लिए छाया हुआ समझ में शाही सेना कोडिंग के साथ एक साथ एक सेल चरण भ्रूण में 250 पीजी बीएसी डीएनए के लिए 25-50 प्लास्मिड डीएनए के पीजी या इंजेक्षनtransposon की मध्यस्थता transgenesis के लिए, या मैं-SCEI की मध्यस्थता transgenesis के लिए मैं-SCEI प्रोटीन के साथ nsposase।
        नोट: transgenesis विधि के विकल्प पर विचार चर्चा अनुभाग में पाया जा सकता है।
        नोट: डीएनए कोशिका द्रव्य में डिलीवर नहीं है जब transgenesis की दक्षता में कमी हो सकती है, क्योंकि कोशिका द्रव्य, नहीं जर्दी में अधिमानतः इंजेक्षन।
    2. वयस्कता के लिए इंजेक्शन G0 भ्रूण उठाएँ। वैकल्पिक रूप से, स्क्रीन G0 AmCyan प्रतिदीप्ति के लिए भ्रूण और अधिमान्यतया वांछित अभिव्यक्ति पैटर्न दिखा भ्रूण बढ़ता है। इस Tol2 की मध्यस्थता transgenesis के लिए विशेष रूप से रोगाणु-लाइन संचरण की दर से वृद्धि हो सकती है।
    3. (उदाहरण चित्रा -1 में दिखाया गया है) एक फ्लोरोसेंट stereomicroscope का उपयोग एफ 1 भ्रूण या लार्वा में उम्मीद की अभिव्यक्ति पैटर्न में जंगली प्रकार मछली और AmCyan प्रतिदीप्ति की उपस्थिति के लिए अलग-अलग G0 मछली outcrossing द्वारा सफल रोगाणु-लाइन एकीकरण का आकलन करें।
    4. प्रतिदीप्ति पॉजिटिव उठाएँएफ 1 भ्रूण वयस्कता और स्थिर F2 ट्रांसजेनिक मछली प्राप्त करने के लिए जंगली प्रकार की मछली के साथ उन्हें दोस्त के लिए।
    5. अलग-अलग लाइनों अभिव्यक्ति के स्तर, अभिव्यक्ति पैटर्न, TetResponder लाइनों, leakiness प्रेरित करने की क्षमता है, और मुंह बंद करने के लिए अपनी संवेदनशीलता में अंतर हो सकता है, के बाद से उठाएँ और विभिन्न G0 संस्थापक मछली से प्राप्त होता है कम से कम 3 अलग sublines की विशेषताएँ।
      नोट: मजबूती भ्रूण में व्यक्त कर रहे हैं कि कई ट्रांसजीन या तो आंशिक रूप से या पूरी तरह से देर चरण लार्वा या वयस्क मछली में खामोश हैं। लाइनों वयस्क मछली में इस्तेमाल के लिए होती हैं, तो इस प्रकार, वयस्कता के दौरान उनके TetActivator अभिव्यक्ति और समारोह के लिए कई स्वतंत्र लाइनों की विशेषताएँ।
      नोट: हम 1 टेबल में सूचीबद्ध हैं जो दोनों भ्रूण और वयस्क मछली, में TetActivator के ऊतक विशेष अभिव्यक्ति के लिए TetActivator लाइनों के एक पैनल उत्पन्न किया है इन पंक्तियों के अनुरोध पर Weidinger प्रयोगशाला से उपलब्ध हैं।।

ट्रांसजेनिक टी 2. जनरेशनetResponder मछली लाइन्स

नोट: हम अनुरोध पर Weidinger प्रयोगशाला से उपलब्ध है जो मैं-SCEI या स्थिर TetResponder लाइनों की Tol2 की मध्यस्थता पीढ़ी के लिए अनुमति TetResponder निर्माण (।; चित्रा 1E Weidinger प्रयोगशाला प्लाज्मिड डेटाबेस में कोई 1444) उत्पन्न किया है। इस का निर्माण ब्याज की एक जीन और YFP-व्युत्पन्न YPet अनुक्रम कोडन की कोडिंग दृश्यों (सीडीएस) की प्रविष्टि की सुविधा एक polylinker क्षेत्र द्वारा पीछा एक टेट्रासाइक्लिन ऑपरेटर, शामिल हैं। इस प्रकार, निर्माण YPet के साथ ब्याज की प्रोटीन की एक सी टर्मिनल संलयन की Teta की मध्यस्थता अभिव्यक्ति के लिए बनाया गया है। एक टैग संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति को टाला जा सकता है, एक P2A या t2a पेप्टाइड अलग polypeptides 6,10 के रूप में ब्याज और YPet के प्रोटीन के सह-अभिव्यक्ति की सुविधा है, जो ब्याज सीडीएस के जीन के साथ पेश किया जा सकता है।

  1. TetResponder निर्माण का सृजन
    1. टेट्रासाइक्लिन ऑपरेटर के 'हित 3 की जीन का क्लोन सीडीएसऔर 5 YPet सीडीएस के 'मानक प्रक्रिया के अनुसार। स्टॉप कोडोन ब्याज सीडीएस के जीन से हटा दिया गया है कि सुनिश्चित करें।
    2. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग कर विष मुक्त प्लास्मिड डीएनए की तैयारी तैयार करें।
  2. ट्रांसजेनिक TetResponder मछली लाइनों की पीढ़ी
    1. TetResponder के microinjection मानक प्रक्रियाओं 9 के अनुसार निर्माण कार्य करें।
      1. Transposon की मध्यस्थता transgenesis के लिए या meganuclease सहायता प्राप्त transgenesis के लिए मैं-SCEI एंजाइम के साथ tol2 transposase के लिए छाया हुआ समझ में शाही सेना कोडिंग के साथ एक साथ एक सेल चरण भ्रूण की कोशिका द्रव्य में प्लास्मिड डीएनए के 25-50 पीजी इंजेक्षन।
        नोट: transgenesis विधि के विकल्प पर विचार चर्चा अनुभाग में पाया जा सकता है।
        नोट: डीएनए कोशिका द्रव्य में डिलीवर नहीं है जब transgenesis की दक्षता में कमी हो सकती है, क्योंकि कोशिका द्रव्य, नहीं जर्दी में अधिमानतः इंजेक्षन।
    2. एक करने के लिए इंजेक्शन G0 भ्रूण उठाएँdulthood।
    3. एफ 1 भ्रूण या F1 लार्वा की Doxycycline उपचार के बाद एक पहले से स्थापित TetActivator लाइन के साथ अलग-अलग G0 मछली संभोग से transgene की सफल रोगाणु-लाइन एकीकरण और inducibility का आकलन करें।
      नोट: आमतौर पर हम एक ubiquitin प्रमोटर संचालित TetActivator लाइन का उपयोग करें (ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, लघु ubiquitin: Teta AmCyan 3) इस लाइन भ्रूण और वयस्क में काफी सर्वव्यापक अभिव्यक्ति ड्राइव के रूप में, कार्यात्मक TetResponder वाहकों के लिए स्क्रीन करने के लिए इस प्रकार की मछली और अच्छी तरह से ब्याज के सभी ऊतकों में TetResponder inducibility का आकलन करने के लिए अनुकूल है। इस लाइन के अनुरोध पर Weidinger प्रयोगशाला से उपलब्ध है।
    4. E3 के भ्रूण मध्यम युक्त एक अलग 10 सेमी पेट्री डिश में प्रत्येक क्लच का भ्रूण लीजिए (सामग्री तालिका देखें) और 28.5 डिग्री सेल्सियस पर व्यंजन सेते हैं।
    5. व्यक्तिगत गिने टैंक में भ्रूण दिया उस जगह G0 मछली (प्रजनन बक्से, सामग्री तालिका देखें) भ्रूण स्क्रीन गया है जब तकएड। इस transgene की रोगाणु लाइन संचरण बताते हैं कि G0 मछली की वसूली के लिए अनुमति देता है।
    6. भ्रूण का केवल आधा TetActivator transgene (मामले में एक विषमयुग्मजी TetActivator वाहक एक TetResponder संस्थापक मछली को पार कर गया था) ले जाने की उम्मीद कर रहे हैं, तो उचित विकास के चरण में AmCyan प्रतिदीप्ति की उपस्थिति से TetActivator transgene युक्त भ्रूण के लिए चयन करें।
    7. खंड 2.3 में वर्णित के रूप में डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) के साथ भ्रूण के इलाज से TetActivator ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि प्रेरित।
    8. YPet प्रतिदीप्ति के उद्भव के लिए स्क्रीन एफ 1 भ्रूण। कि क्लच में भ्रूण की उम्मीद है और अभिव्यक्ति डोमेन और व्यक्तिगत भ्रूण के बीच थोड़ा बदलाव के भीतर थोड़ा mosaicism प्रदर्शित करना चाहिए है, समरूप YPet अभिव्यक्ति है कि उत्पादन लाइनें (G0 मछली) पसंद करते हैं। प्रतिनिधि उदाहरण के लिए चित्रा 1F और चित्रा 1G में तीर मिलते हैं।
    9. में पहचान एक inducible TetResponder transgene संचारण मेट G0 मछलीजंगली प्रकार मछली के साथ 2.2.8 कदम और वयस्कता के लिए सभी एफ 1 भ्रूण बढ़ा।
    10. वयस्क एफ 1 ट्रांसजेनिक मछली या तो पीसीआर आधारित जीनोटाइपिंग द्वारा पहचानें (खंड देखें या F2 भ्रूण और YPet प्रतिदीप्ति (2.5 अनुभाग देखें) के उद्भव के DOX उपचार के बाद एक TetActivator लाइन के लिए अलग-अलग एफ 1 मछली पार करके।
    11. Inducibility व्यक्ति लाइनों में अंतर हो सकता है, के बाद से स्थापित करने और विभिन्न G0 संस्थापक मछली से प्राप्त होता है कम से कम 3 अलग TetResponder sublines की विशेषताएँ। विशेष रूप से प्राप्त अभिव्यक्ति के स्तर में और चाहे प्रत्युत्तर भिन्न हो सकता है सभी प्रकार की कोशिकाओं में सक्रिय किया जा सकता है। इसके अलावा, मुंह बंद करने के लिए संवेदनशीलता लाइनों के बीच अलग होगा। अंत में, कुछ मामलों में यह Doxycycline के अभाव में एक TetActivator लाइन के साथ संयोजन में उत्पादित टपकाया अभिव्यक्ति विकास संबंधी दोषों या विषाक्तता के कारण होने की उम्मीद है, अगर विशेष रूप से, ब्याज की प्रोटीन का केवल मध्यम अभिव्यक्ति के स्तर मध्यस्थता कि लाइनों का चयन करने के लिए बेहतर हो सकता है।
      नोट: Tetभ्रूण में मजबूती inducible हैं कि प्रत्युत्तर लाइनों या तो आंशिक रूप से या पूरी तरह से देर चरण लार्वा या वयस्क मछली में खामोश किया जा सकता है। लाइनों वयस्क मछली में इस्तेमाल के लिए होती हैं, तो इस प्रकार, कई स्वतंत्र लाइनों वयस्कों में inducibility के लिए विशेषता किया जाना चाहिए। ब्याज की जीन की प्रेरण आगे के विकास के साथ संगत है, यह भ्रूण में भारत सरकार अभिव्यक्ति को प्रेरित करने के लिए और चयन और सबसे मजबूत और कम से कम मोज़ेक दिखा केवल व्यक्तियों को बढ़ाने के लिए, डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण (TetActivator एक्स TetResponder) बनाने के लिए उपयोगी साबित हो गया है प्रेरण।
    12. ) को बनाए रखने और धारा 2.5 में वर्णित के रूप में स्थापित TetResponder लाइनों, जीनोटाइप वयस्क मछली प्रचार करने के लिए।
  3. भ्रूण के Doxycycline उपचार
    1. 2,000x डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) के शेयरों में तैयार करें। 50 मिलीग्राम / एमएल (97 मिमी) के एक एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए 50% EtOH में DOX का समाधान। स्टोर DOX शेयरों -20 डिग्री सेल्सियस पर प्रकाश से रक्षा की।
    2. भ्रूण से E3 के माध्यम से बहुमत छानना और इसे बदलने के साथ25 माइक्रोग्राम / एमएल DOX के अंतिम एकाग्रता में DOX युक्त E3 के भ्रूण मध्यम (50 मिलीलीटर E3 के प्रति 2,000x DOX स्टॉक के 2.5 μl)। Dechorionation की आवश्यकता नहीं है।
    3. YPet प्रतिदीप्ति की उपस्थिति से ब्याज के साथ टैग जीन की अभिव्यक्ति का आकलन करने से पहले 6 घंटे की एक न्यूनतम के लिए 28.5 डिग्री सेल्सियस भ्रूण लौटें।
    4. केवल EtOH के विलायक के साथ भ्रूण के इलाज से TetActivator / TetResponder संयोजन के leakiness का आकलन करें।
      नोट: TetResponder mRNA के पता लगाने के लिए स्वस्थानी संकरण (ISH) या आरटी पीसीआर में रुचि के साथ टैग जीन की प्रतिदीप्ति की तुलना में leakiness के और अधिक संवेदनशील उपायों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। leakiness की हद तक विशेष TetActivator / TetResponder लाइन संयोजन पर निर्भर करेगा और यह ऊतकों और विकास के चरणों के बीच भी अलग-अलग हो सकता है।
  4. वयस्क zebrafish की संवेदनहीनता
    1. 10 सेमी व्यास पेट्री डिश या युक्त मछली प्रणाली पानी 1 मिलीग्राम / एमएल Tricaine (इथाइल 3-aminobenzoate methanesu से भर छोटे बीकर तैयार करेंlfonate, एमएस-222)।
    2. कंटेनर युक्त संवेदनाहारी के लिए मछली स्थानांतरण और पूरा संतुलन की हानि (मछली अपने पक्ष पर झूठ), कोई आंदोलनों और 11 को छू करने के लिए कोई प्रतिक्रिया से संकेत के रूप में यह संज्ञाहरण के स्तर 4 तक पहुँचता है जब तक प्रतीक्षा करें।
    3. ध्यान से चिमटी या एक गिलास स्लाइड पर एक चम्मच, एक प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन, या agarose लेपित पेट्री डिश का उपयोग कर मछली हस्तांतरण और फिन विच्छेदन या इमेजिंग प्रदर्शन (धारा 3.2 देखें)।
    4. ताजा मछली प्रणाली पानी की एक बड़ी मात्रा युक्त एक कंटेनर के लिए मछली लौटें और यह निगरानी। गिल आंदोलनों 3 मिनट के भीतर फिर से शुरू नहीं करते हैं, तो एक प्लास्टिक हस्तांतरण pipet का उपयोग गहरे नाले के ऊपर पानी बह द्वारा सहायता करते हैं।
  5. TetResponder मछली की पीसीआर आधारित जीनोटाइपिंग
    1. 12 फिन पूंछ का आंशिक विच्छेदन प्रदर्शन करते हैं। व्यक्तिगत, गिने टैंक में मछली प्लेस (प्रजनन बक्से, सामग्री तालिका देखें)। इस सफल जीनोटाइपिंग निम्नलिखित ट्रांसजेनिक मछली की वसूली के लिए अनुमति देता है।
    2. ट्राएक 96 अच्छी तरह से पीसीआर थाली जीनोमिक डीएनए 13 के अलगाव के लिए 20 μl DNase मुक्त पानी पहले से ही भरे के अलग-अलग कुओं को nsfer फिन ऊतकों।
      1. प्रत्येक के लिए 120 μl 1 एम NaOH अच्छी तरह से जोड़ें और एक thermocycler का उपयोग कर 95 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए नमूने सेते हैं।
      2. 4 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा नमूने, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1 एम Tris-एचसीएल (8.0 पीएच) के 14 μl जोड़ने के लिए, और संक्षेप में भंवर नमूने हैं। 16,000 XG पर 5 मिनट के लिए नमूने अपकेंद्रित्र सेल मलबे गोली। जब तक जरूरत 4 डिग्री सेल्सियस पर जीनोमिक डीएनए स्टोर।
    3. डिजाइन प्राइमरों विशेष रूप से TetResponder transgene की एक टुकड़ा बढ़ाना। एक मानक पीसीआर प्रतिक्रिया में पृथक डीएनए के 2 μl का प्रयोग करें और एक agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद का विश्लेषण।

वयस्क Regenerating Zebrafish पूंछ पंख में transgene अभिव्यक्ति की 3. ऊतक विशेष प्रेरण

  1. TetActivator की स्थापना; डबल ट्रांसजेनिक मछली TetResponder
    1. TetResponder Carri साथ TetActivator वाहक मेटनेताओं।
    2. TetActivator कैसेट ड्राइविंग नियामक तत्व सक्रिय हैं जब एक विकास के चरण में TetActivator transgene ले जाने के लिए चयन भ्रूण। ट्रांसजेनिक भ्रूण आसानी से एक स्टीरियो फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग AmCyan प्रतिदीप्ति की उपस्थिति से पहचाना जा सकता है।
      नोट: TetActivator transgene पॉजिटिव मछली वैकल्पिक रूप से उदाहरण से anesthetized मछली की इमेजिंग, से वयस्कता के दौरान पहचाना जा सकता है। पूंछ फिन के विच्छेदन और पुनर्जन्म में AmCyan प्रतिदीप्ति के उद्भव के बाद।
    3. वयस्कता के लिए चयनित भ्रूण उठाएँ।
    4. ब्याज के ऊतकों में TetResponder की अभिव्यक्ति के लिए प्रेरित करने की क्षमता से (अधिमानतः) पीसीआर आधारित जीनोटाइपिंग या द्वारा (TetActivator के अलावा TetResponder ले कि मछली) डबल ट्रांसजेनिक वयस्क मछली को पहचानें। Regenerating पूंछ पंख में TetResponder प्रेरण और पता लगाने के लिए एक प्रोटोकॉल खंड 2.3 और धारा 4 में वर्णित है।
      नोट: क्षणिक TetResponder अभिव्यक्ति संगत हैआगे भ्रूण या लार्वा विकास के साथ, यह ऊपर वर्णित के रूप में भ्रूण के विकास के दौरान DOX इलाज के बाद TetActivator और TetResponder ट्रांसजीन ले जाने डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण की पहचान के लिए उपयोगी है (धारा 2.3, चित्रा 1H)। डबल सकारात्मक भ्रूण AmCyan और YPet प्रतिदीप्ति दिखाएगा। वयस्कता के लिए सकारात्मक भ्रूण उठाएँ।
  2. Regenerating पंख में zebrafish पूंछ पंख के विच्छेदन और transgene अभिव्यक्ति की प्रेरण
    1. Anesthetized मछली पर पूंछ पंख के आंशिक विच्छेदन प्रदर्शन करना 12 (खंड 2.4 देखें)। DOX के साथ या तो तुरंत मछली समझो या मछली आवास व्यवस्था करने के लिए उन्हें वापस।
    2. प्रजनन बॉक्स तैयार करें (2A चित्रा, सामग्री तालिका देखें) (मछली प्रणाली पानी का 1 एल 2,000x 50 मिलीग्राम / एमएल शेयर के 500 μl जोड़ें) 25 माइक्रोग्राम / एमएल DOX युक्त मछली प्रणाली पानी का 1 एल के साथ भर दिया।
      नोट: transgene अभिव्यक्ति की प्रेरण विच्छेदन के रूप में के लिए अनुमति देता है के तुरंत बादपद-विच्छेदन (3 डीपीए) 3 दिनों में प्रेरण पुनर्योजी विकास के दौरान transgene अभिव्यक्ति या समारोह का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, जबकि उत्थान के दौरान जल्दी घटनाओं पर प्रभाव के sessment।
    3. मछली बच नहीं सकते हैं कि इस तरह के एक ढक्कन (2A चित्रा) के साथ प्रजनन बॉक्स और करीब बॉक्स करने के लिए 10 पहले से कटे, डबल ट्रांसजेनिक मछली अप करने के लिए स्थानांतरण।
    4. तनाव को कम करने के लिए अंधेरे में प्रजनन बक्से रखें। हम आम तौर पर लगातार अंधेरे और तापमान सुनिश्चित करने के लिए एक 28.5 डिग्री सेल्सियस हवा इनक्यूबेटर में बक्से जगह है।
    5. EtOH के केवल (1L मछली प्रणाली पानी प्रति 250 μl) के साथ नकारात्मक नियंत्रण डबल ट्रांसजेनिक मछली समझो।
      नोट: हम फिन उत्थान पर यहां इस्तेमाल किया DOX खुराक के प्रतिकूल प्रभावों को कभी नहीं देखा है, हालांकि एकल ट्रांसजेनिक या DOX के साथ इलाज जंगली प्रकार की मछली, अतिरिक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    6. एक गीला agarose लेपित पेट्री पर खंड 2.4 और चिमटी या एक चम्मच का उपयोग करते हुए स्थानांतरण मछली के रूप में वर्णित मछली चतनाशून्य पकवान। ध्यान से चिमटी का उपयोग कर पूंछ पंख फैला।
    7. एक फ्लोरोसेंट स्टीरियो माइक्रोस्कोप (चित्रा 2 बी) का उपयोग पुनर्जन्म के भीतर YPet की उपस्थिति के लिए स्क्रीन मछली।
      नोट: आमतौर पर, TetResponder संचालित प्रतिदीप्ति मजबूती DOX उपचार के 6 घंटा निम्नलिखित मनाया जा सकता है। हालांकि, हम उत्पन्न प्रत्येक पंक्ति के लिए TetResponder अभिव्यक्ति की गतिशीलता को चिह्नित करने के लिए सलाह देते हैं।
    8. TetResponder transgene प्रेरण समाप्त या उपचार जारी रखने के लिए मछली आवास व्यवस्था करने के लिए मछली लौटें।
      नोट: उपचार के लिए> 24 घंटा (लंबी अवधि के उपचार) यह पानी का आदान-प्रदान और अच्छी तरह से दैनिक प्रजनन बक्से साफ करने के लिए आवश्यक है।
    9. लंबी अवधि के उपचार, फ़ीड मछली खिलाने के बाद प्रजनन बक्से के लिए उन्हें लौटने से पहले ताजा मछली प्रणाली पानी के साथ एक साफ कंटेनर में मछली के हस्तांतरण से हर 2-3 दिनों के दौरान।

फिन regenerates में TetResponder अभिव्यक्ति की 4. विशेषता

टी "> नोट:। हम आम तौर पर 3 डीपीए पर cryosections के फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग regenerating पूंछ पंख में ऊतक विशेष जीन अभिव्यक्ति सत्यापित एक पुनर्जन्म के विभिन्न ऊतक डिब्बों का गठन किया है और स्पष्ट रूप से ऊतक वर्गों पर पहचाना जा सकता है इस समय बिंदु पर, और cryosectioning उत्थान के बाद के चरणों में की तुलना में आसान है। चित्रा -2 पुनर्जन्म में प्रतिष्ठित किया जा सकता है कि ऊतक डोमेन के दर्शाया गया है और इन डोमेन के लिए कुछ आणविक मार्कर सूचीबद्ध करता है। निम्नलिखित प्रोटोकॉल प्रत्यक्ष इमेजिंग या immunostaining के लिए अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ cryosections की तैयारी का वर्णन ।

  1. वयस्क पूंछ पंख के Cryosectioning
    1. जिसका पूंछ पंख खंड 3.2 में वर्णित के रूप में DOX के साथ 3 डीपीए तक 2 डीपीए से काट रहे थे मछली दावत
    2. खंड 2.4 में वर्णित के रूप में मछली चतनाशून्य
    3. धीरे से एक प्लास्टिक पेट्री डिश के ढक्कन पर मछली स्थानांतरित करने के लिए एक चम्मच या चिमटी का प्रयोग करें।
    4. के बारे में 4-5 बोनी खंड पर फिन पुनर्जन्म पुनः काटनाप्रारंभिक विच्छेदन विमान करने के समीपस्थ एक स्केलपेल का उपयोग और ताजा मछली प्रणाली पानी के लिए मछली वापसी।
    5. ठीक चिमटी का उपयोग करते हुए, (सामग्री तालिका देखें पीबीएस) ध्यान से स्थानांतरण 1x फॉस्फेट बफर खारा में paraformaldehyde (पीएफए) (w / v) 4% से युक्त एक छोटा सा पेट्री डिश (उदाहरण के लिए, 35 मिमी) को पुन: बनाता है। पुनर्जन्म लेकिन ऊतक के ही स्टंप हिस्सा मत छुओ।
    6. पेट्री डिश तल पर फ्लैट ऊतक प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन तय कर लो।
    7. धो हड्डी मैट्रिक्स अम्लो व्दारा कैल्सियम ओ / एन 4 डिग्री सेल्सियस पर 0.5 एम EDTA-पीबीएस (7.5 पीएच) में पुन: बनाता है 1x पीबीएस 0.1% बीच (पीबीटी) पीएफए ​​हटाने और सेते युक्त में दो बार पुन: बनाता है।
    8. 10% सूक्रोज-पीबीएस 20%, सूक्रोज-पीबीएस 30%, सूक्रोज पीबीएस और 30% में आरटी पर पुन: बनाता है सेते सूक्रोज-पीबीएस: एक 1 पर ऊतक ठंड मध्यम: 1 के अनुपात; 30 मिनट प्रत्येक के लिए (TFM सामग्री तालिका देखें)। बाद में, ऊतक ठंड मध्यम में> 2 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पंख सेते हैं।
    9. एक खुर्दबीन स्लाइड पर cryomolds प्लेस और भरनेऊतक ठंड माध्यम के साथ मी। हवाई बुलबुले शुरू करने से बचें।
    10. स्थानांतरण फिन पुन: बनाता है (चित्रा 2 डी) के अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ वर्गों को प्राप्त करने के लिए उचित cryomolds और ओरिएंट के ऊतकों में पुन: बनाता है। कि पुनर्जन्म सुनिश्चित करें सेक्शनिंग की सुविधा है, जो सीधे है।
    11. स्थानांतरण जमने की प्रक्रिया (चित्रा 2 डी) शुरू करने के लिए सूखी बर्फ की एक बिस्तर पर तैनात एक धातु रैक पर खुर्दबीन स्लाइड के साथ एक साथ cryomolds।
    12. ऊतक ठंड मध्यम ठोस बन गया है एक बार, बेंच पर cryomold जगह है और ठंड मध्यम ऊतक प्लास्टिक-मध्यम इंटरफेस में thaws कि इस तरह के कुछ मिनट के लिए आरटी पर बैठते हैं।
    13. Cryomold के बाहर जमे हुए ब्लॉक पुश करने के लिए एक पेन या इसी तरह का प्रयोग करें। ऊतक सेक्शनिंग जब तक -80 डिग्री सेल्सियस पर एक बॉक्स में स्टोर cryoblocks।
    14. एक क्रायो-सूक्ष्म का उपयोग कर 10-14 माइक्रोन मोटी cryosections तैयार है और आसंजन खुर्दबीन स्लाइड पर वर्गों (सामग्री तालिका देखें) इकट्ठा। पूर्वोत्तर तक -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर स्लाइड्सeded।
  2. YPet प्रतिदीप्ति के आधार पर पंख वर्गों पर TetResponder अभिव्यक्ति की विशेषता
    1. पीबीटी में आरटी पर दो washes और पीबीएस में 1 धोने, 5 मिनट प्रत्येक के द्वारा पीछा खुर्दबीन स्लाइड के पालन में सुधार करने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा 100% MeOH के साथ 30 मिनट के लिए पंख वर्गों समझो।
    2. दो washes 10 मिनट पीबीएस में प्रत्येक के द्वारा पीछा किया: पीबीएस में 4 में 10 मिनट ', 6- diamidino-2-phenylinodole (DAPI) (5,000 1) के लिए incubating वर्गों द्वारा नाभिक कल्पना।
    3. 75% ग्लिसरॉल पीबीएस में माउंट वर्गों या व्यावसायिक रूप से उपलब्ध antifade mounts, और एक कवर स्लाइड के साथ कवर किया।
    4. छवि YPet और एक confocal या व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे AmCyan प्रतिदीप्ति (चित्रा 1E)।
      नोट: प्रदर्शन किया जा सकता स्पष्ट (YPet के साथ प्रतिक्रिया है, जो नहीं बल्कि AmCyan) विरोधी GFP एंटीबॉडी के साथ एक साथ सेल प्रकार विशिष्ट एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ YPet, इम्यूनोफ्लोरेसेंस या immunohistochemistry व्यक्त प्रकार की कोशिकाओं की पहचान की सुविधा के लिए। वैकल्पिक रूप से, कमजोर YPet अभिव्यक्ति का पता लगाने की सुविधा है, YPet शाही सेना के खिलाफ सीटू संकरण में शाही सेना पर या तो किया जा सकता है पंख या पंख की आयल वर्गों पूरे माउंट।

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Representative Results

ऊतक विशेष inducible जीन अभिव्यक्ति, ट्रांसजेनिक TetActivator और TetResponder लाइनों के लिए एक कार्यात्मक Teton प्रणाली स्थापित करने के लिए उत्पन्न (चित्रा 1 ए) की जरूरत है। जल्दी zebrafish भ्रूण और बाद में रोगाणु-लाइन एकीकरण में constructs या TetResponder (चित्रा 1E) - यह TetActivator (सी चित्रा 1 बी) microinjecting द्वारा पूरा किया है। कार्यात्मक TetActivator निर्माणों, या ब्याज की जीन (चित्रा 1C) के नियामक तत्वों से युक्त एक बीएसी में TetActivator कैसेट पुनर्संयोजन द्वारा TetActivator कैसेट (चित्रा 1 बी) के अपस्ट्रीम कम विनियामक दृश्यों (बढ़ाने तत्व) की क्लोनिंग द्वारा उत्पन्न किया जा सकता है। TetActivator निर्माण के जर्मलाइन एकीकरण व्यक्ति की उम्मीद है और अभिव्यक्ति पैटर्न (चित्रा -1) में G0 मछली और F1 भ्रूण में AmCyan प्रतिदीप्ति की उपस्थिति इंजेक्ट outcrossing द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। जर्मलाइन integ, DOX और YFP / YPet प्रतिदीप्ति (चित्रा 1F) की उपस्थिति के साथ उपचार के बाद: राशन और TetResponder transgene की कार्यक्षमता (Teta AmCyan ubiquitin यहाँ) की स्थापना की TetActivator मछली के लिए अलग-अलग G0 इंजेक्ट मछली को पार करने से मूल्यांकन किया जा सकता है। मजबूत और समरूप YFP / YPet अभिव्यक्ति दिखा मछली एक स्थिर TetResponder लाइन (चित्रा 1G) स्थापित करने के लिए प्राथमिकता दी जानी चाहिए। स्थापित स्थिर TetActivator और TetResponder मछली लाइनों, विशिष्ट TetActivator / TetResponder संयोजन होने पार करके उत्पन्न किया जा सकता है। TetActiator और TetResponder transgenes की वाहक TetActivator सक्रिय है विकास मंच (चित्रा 1H) में YFP / Ypet की DOX उपचार अंत उद्भव निम्नलिखित embryogenesis दौरान पहचाना जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, डबल ट्रांसजेनिक मछली DOX उपचार और regenerating पूंछ पंख में TetResponder transgene प्रेरण (- बी 2A चित्रा) निम्नलिखित पहचाना जा सकता है।

< पी वर्ग = "jove_content"> हम नियमित regenerating zebrafish पूंछ पंख में inducible, ऊतक विशेष जीन की अभिव्यक्ति को प्राप्त करने के लिए इस प्रणाली का उपयोग करें। एक पुनर्जन्म के विभिन्न ऊतक डिब्बों स्पष्ट रूप से इस समय बिंदु (चित्रा -2) में ऊतक वर्गों पर पहचाना जा सकता है के बाद से हम 3 डीपीए फिन पुन: बनाता है की cryosections की प्रतिदीप्ति इमेजिंग द्वारा ऊतक विशेष TetResponder transgene अभिव्यक्ति की पुष्टि करें। अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ फिन पुनर्जन्म वर्गों ऊतक cryoprotecting और फिन उचित (चित्रा 2 डी) पुनर्जन्म एम्बेड करने के बाद cryosectioning द्वारा प्राप्त कर रहे हैं। सेक्शनिंग के बाद, TetResponder transgene अभिव्यक्ति (Ypet / YFP प्रतिदीप्ति) प्रतिदीप्ति या confocal माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2 ई) का उपयोग imaged किया जा सकता है। बाहर का भ्रूण की गिलाफ (नोक) और एपिडर्मिस (तीर) अभिव्यक्ति से रहित हैं, जबकि her4.3 प्रमोटर संचालित TetActivator, समीपस्थ औसत दर्जे का भ्रूण की गिलाफ में TetResponder अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है कि ध्यान दें।

> "ove_content चित्रा 1 ए
चित्रा 1 बी
चित्रा 1C
चित्रा -1
चित्रा 1E
चित्रा 1F
चित्रा 1G
चित्रा 1H
चित्रा 1: ट्रांसजेनिक TetActivator और TetResponder लाइनों की पीढ़ी। (ए) कार्टून Teton प्रणाली का उपयोग ऊतक विशेष inducible जीन की अभिव्यक्ति के लिए रणनीति दिखा। (बी) ट्रांसजेनिक TetActivator (Weidinger प्रयोगशाला प्लाज्मिड डेटाबेस नं। 1247) का निर्माण किया। 5 'TetActivator irtTAM2 (3F) के एक polylinker ग की सुविधाब्याज की नियामक दृश्यों के loning। AmCyan अनुक्रम कोडन एक P2A 'आत्म cleaving' पेप्टाइड के माध्यम से TetActivator से अलग है। कैसेट भी, Tol2 transposon उल्टे दोहराता द्वारा flanked है एक SV40 polyadenylation संकेत होता है और एक भी मैं-SCEI meganuclease मान्यता साइट शामिल हैं। बीएसी recombineering के लिए (सी) TetActivator कैसेट (Weidinger प्रयोगशाला प्लाज्मिड डेटाबेस नं। 1180)। कैसेट एक gb3 प्रोकार्योटिक प्रमोटर द्वारा संचालित किया जाता है, जो चयन के लिए kanamycin जीन शामिल हैं। Kanamycin प्रतिरोध जीन flanking FRT साइटों बीएसी में सफल एकीकरण के बाद अपनी FLP-recombinase मध्यस्थता हटाने के लिए अनुमति देते हैं। (डी) her4.3 संचारण G0 संस्थापक मछली की पहचान: Teta AmCyan उनके रोगाणु-लाइन के माध्यम से निर्माण। वाहक कुछ एफ 1 भ्रूण (तीर) में AmCyan प्रतिदीप्ति के उद्भव के माध्यम से पहचाने जाते हैं। (ई) ट्रांसजेनिक TetResponder (Weidinger प्रयोगशाला प्लाज्मिड डेटाबेस नं। 1444) का निर्माण किया।इस constructs अनुकूलित Tet प्रतिक्रिया तत्वों के नियंत्रण के अधीन एक polylinker और YPet सीडीएस के होते हैं (TetRE तंग Clontech,) और SV40 polyadenylation संकेत से समाप्त हो गया। यह Tol2 transposon उल्टे दोहराता से घिरे हुए हैं और एक भी मैं-SCEI meganuclease मान्यता साइट शामिल है। एक कार्यात्मक TetResponder TetRE संचारण G0 संस्थापक मछली की (एफ) पहचान: Axin1-YFP उनके germline के माध्यम से निर्माण। 6 घंटा (तीर) के लिए DOX इलाज के बाद YFP प्रतिदीप्ति की और प्रेरण: वाहक एक स्थापित TetActivator (Teta AmCyan यहाँ ubiquitin) लाइन के साथ पार करने से पहचाने जाते हैं। (जी) DOX इलाज के 12 घंटे की कुल के बाद (एफ) में दिखाया गया ofembryos ऊपर बंद करें। YFP प्रतिदीप्ति की काफी सर्वव्यापक प्रेरण ध्यान दें। और TetResponder (TetRE: Axin1-YFP) ट्रांसजीन (तीर): TetActivator (Teta AmCyan her4.3) ले जाने डबल ट्रांसजेनिक भ्रूण के (एच) पहचान। हम भ्रूण6 घंटे के लिए DOX के साथ इलाज कर रहे हैं। (ए - एच) स्केल बार: 500 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2A चित्रा
चित्रा 2B
चित्रा -2
चित्रा 2 डी
चित्रा 2 ई
चित्रा 2: regenerating zebrafish पूंछ पंख में ऊतक विशेष जीन की अभिव्यक्ति के लिए Teton प्रणाली का प्रयोग करें। वयस्क zebrafish के DOX के इलाज के लिए प्रयोग किया जाता है (ए) ब्रीडिंग बक्से। TetRE की (ख) शामिल: her4.3 द्वारा Axin1-YFP TetResponder transgene: Teta AmCyan TetActivatorregenerating पूंछ पंख में DOX इलाज के 12 घंटे के बाद। EtOH के इलाज नियंत्रण मछली में YFP प्रतिदीप्ति के अभाव ध्यान दें। (सी) कार्टून एक अनुदैर्ध्य खंड दृश्य में 3 डीपीए पर एक पंख पुनर्जन्म के भीतर पाया ऊतक डिब्बों में से कुछ का चित्रण। Cryosectioning के लिए (डी) नमूना तैयार करना। फिन पुन: बनाता है ऊतक ठंड मध्यम (TFM) में रखा पुनर्जन्म के अनुदैर्ध्य या अनुप्रस्थ या तो वर्गों को प्राप्त करने के लिए उचित रूप से उन्मुख cryomolds, -filled, और TFM जम गया है जब तक सूखी बर्फ के शीर्ष पर बैठे एक धातु रैक करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। सेक्शनिंग विमान लाल रंग में संकेत दिया है। लघुरूप: जिले .: बाहर का, प्रोक्स .: समीपस्थ, वेंट .: उदर, .: पृष्ठीय Dors। (बी) में दिखाया गया पंख से ली गई एक पंख रे पुनर्जन्म के एक अनुदैर्ध्य खंड में YFP प्रतिदीप्ति (ई) confocal छवि। Teta AmCyan TetActivator लाइन समीपस्थ औसत दर्जे का भ्रूण की गिलाफ में विशेष रूप से YFP प्रेरण ड्राइव: her4.3 ध्यान दें। YFPप्रतिदीप्ति घाव एपिडर्मिस (तीर), और mesenchyme (नोक) (ईसा पूर्व) स्केल बार के बाहर का सबसे डोमेन सहित, डिब्बों की एक किस्म में नहीं पाया जाता है: 500 माइक्रोन; (ई) स्केल बार:। 100 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

TetActivator लाइन संदर्भ नियामक तत्वों का इस्तेमाल मुख्य रूप में व्यक्त किया
7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan अप्रकाशित Wehner और Weidinger, 7xTCF-Xla.Siam Wnt संवाददाता 1 Wnt उत्तरदायी ऊतकों
myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry अप्रकाशित हासे और Weidinger, myl7 (cmlc2) 2 परिपक्व cardiomyocytes
her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 3 her4.3 4 केंद्रीय तंत्रिका तंत्र
keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 3 keratin4 5 एपिडर्मिस, वयस्क पंख में बेसल परत को छोड़कर
keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 3 keratin18 6 एपिडर्मिस, बेसल परत में विशेष रूप से वयस्क पंख में
SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 3 SP7 / OSX 7 (प्रतिबद्ध) अस्थिकोरक
ubiquitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 3 ubiquitin 8 (काफी) सर्वव्यापक

तालिका 1:। बिकाऊ ट्रांसजेनिक TetActivator लाइनों इस तालिका में ट्रांसजेनिक TetActiva सूचीबद्ध करता हैअनुरोध पर Weidinger प्रयोगशाला से उपलब्ध हैं, जो दोनों भ्रूण और वयस्क मछली में TetActivator के ऊतक विशेष अभिव्यक्ति के लिए टो लाइनों,।

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Discussion

वयस्क zebrafish सफलतापूर्वक कई आंतरिक अंगों और उपांग पुनर्जीवित करने के लिए एक अद्भुत क्षमता है। शामिल आणविक और सेलुलर तंत्र की एक पूरी तरह से समझ जीन कार्यों और संकेत रास्ते में से ऊतक विशेष विश्लेषण की आवश्यकता है। इस दिशा में, Teton प्रणाली भ्रूण और वयस्क zebrafish में spatiotemporally नियंत्रित जीन की अभिव्यक्ति के लिए एक कुशल उपकरण प्रदान करता है। इस पांडुलिपि में वर्णित Teton प्रणाली निर्माणों और पद्धति को सफलतापूर्वक हमारी प्रयोगशाला 3 के हाल के एक अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है। Teton प्रणाली की स्थापना करते समय निम्न अतिरिक्त मुद्दों पर विचार किया जाना चाहिए:

TetActivator transgene के डिजाइन संबंधी

हम पहले से पता चला है कि दाद सिंप्लेक्स वायरस VP16 transactivation के साथ जुड़े हुए रिवर्स Tet repressor डोमेन के m2 उत्परिवर्ती संस्करण से मिलकर एक एकल inducible TetActivator डोमेन-व्युत्पन्न 3F [irtTAM2 (3F), मैंएन कम Teta-M2] कुशल प्रेरण प्रदान, लेकिन कम दिखा सकते हैं, औसत दर्जे का leakiness हालांकि, कि डॉक्सीसाइक्लिन (DOX) के अभाव में गतिविधि उत्प्रेरण पृष्ठभूमि 5 है। इसलिए, हम leakiness 5 को खत्म जो एक glucocorticoid रिसेप्टर (Teta-GBD) या Ecdysone रिसेप्टर (Teta-ईसीआर) के एक डोमेन के साथ fusions, का उपयोग कर inducible सिस्टम dually वर्णन किया है। प्रणाली एक dually inducible संस्करण का उपयोग विषाक्त या बहुत शक्तिशाली प्रोटीन (जैसे, ओंकोजीन) को व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जाएगा इस प्रकार, यदि विचार किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, TetActivator और TetResponder लाइनों की स्थापना के दौरान विभिन्न अभिव्यक्ति के स्तर के उत्पादन लाइनों की एक श्रृंखला के लिए चयनित किया जा सकता है और इस मामले leakiness में चुना कमजोर inducers जोरदार उत्प्रेरण लाइनों के साथ एक मुद्दा है। Teta-GBD या Teta-ईसीआर संस्करण युक्त TetActivator निर्माणों अनुरोध पर Weidinger प्रयोगशाला से उपलब्ध हैं।

ट्रांसजेनिक zebrafish लाइनों की पीढ़ी के लिए transgenesis तरीकों

14 का उपयोग कर प्लाज्मिड एकीकरण दक्षता i) वृद्धि, और ii) Tol2 transgenesis 15 transposon की मध्यस्थता। पहले प्लाज्मिड की linearization में यह परिणाम है और इस तरह मेजबान जीनोम 16 में प्लाज्मिड एकीकरण की क्षमता में वृद्धि करने के लिए सोचा है, जो मैं-SCEI meganuclease प्रोटीन, के साथ मिलकर प्लास्मिड डीएनए के सह इंजेक्शन पर निर्भर करता है। बाद के जीनोम में transposase की मध्यस्थता एकीकरण के लिए Tol2 transposable तत्वों से युक्त डीएनए के साथ एक साथ tol2 transposase शाही सेना के सह इंजेक्शन की आवश्यकता है। Tol2 की मध्यस्थता transgenesis रणनीति आम तौर पर <, और अधिक कुशल होने के लिए और बड़े डीएनए निर्माणों को एकीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है सोचा हैउन्हें> उदाहरण के लिए, बैक्टीरियल कृत्रिम गुणसूत्रों (BACS) या P1 के व्युत्पन्न कृत्रिम गुणसूत्रों (पैक्स), हालांकि अक्सर वर्दी अभिव्यक्ति के स्तर और मेंडेलियाई विरासत दिखा एक स्थिर ट्रांसजेनिक लाइन की स्थापना कर सकते हैं, जो कई जीनोमिक loci में कई एकल प्रतिलिपि सम्मिलन में यह परिणाम transgene की समय लेने वाली है। इसके विपरीत, मैं-SCEI meganuclease तकनीक को आम तौर पर कम कुशल और नहीं की सिफारिश की बीएसी transgenesis के लिए है, लेकिन एक भी जीनोमिक ठिकाना पर एकल नकल या मिलकर सरणी transgene एकीकरण अर्जित करता है। हम सफलतापूर्वक कार्यात्मक TetActivator या TetResponder लाइनें बनाने के लिए दोनों transgenesis तरीकों का इस्तेमाल किया है।

TetResponder transgene अभिव्यक्ति विश्लेषण

वयस्क पंख में ऊतक विशेष TetResponder transgene अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए हम आमतौर पर cryosections के फ्लोरोसेंट इमेजिंग का उपयोग करें। हमारे अनुभव में, transgene द्वारा व्यक्त फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रतिदीप्ति fixatio भर में संरक्षित हैn और इस प्रकार की प्रक्रिया cryosectioning और सीधे imaged किया जा सकता है। कहीं वर्णित किया गया है जो TetResponder अभिव्यक्ति, का पता लगाने के लिए अतिरिक्त तरीके: वर्गों पर, द्वितीय) फ्लोरोसेंट या वर्णजनीय ISH के एक विरोधी GFP एंटीबॉडी का उपयोग, अधिमानतः यहाँ फ्लोरोसेंट प्रोटीन टैग, YPet के खिलाफ, वर्गों पर immunostaining मैं), या III ) पूरे माउंट ISH के सेक्शनिंग द्वारा पीछा किया।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों तकनीकी सहायता के लिए क्रिस्टा हासे, डोरिस वेबर और ब्रिजित Korte धन्यवाद। Weidinger प्रयोगशाला में कार्य ड्यूश Forschungsgemeinschaft हम 4223 / 3-1 के अनुदान द्वारा समर्थित है, 4223 / 4-1 और ड्यूश Gesellschaft für Kardiologie एक ऑस्कर-लैप-Stipendium के माध्यम से और एक क्लाउस-जोर्ज-अंड-Sigrid- द्वारा हम Hengstberger-Forschungsstipendium।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Breeding boxes Aqua Schwarz AquaBox 1
Compound fluorescent microscope e.g., Leica, Zeiss varies with the manufacturer to image fluorescent tissue sections
Confocal microscope e.g., Leica, Zeiss varies with the manufacturer to image fluorescent tissue sections
Cryostat e.g., Leica, Thermo-Scientific varies with the manufacturer for cryosectioning
4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) Sigma-Aldrich D9542 use 1/5,000 in PBS
for visualization of nuclei
Doxycycline Sigma-Aldrich D9891 prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM)
for TetResponder induction
Paraformaldehyde (PFA) Sigma-Aldrich P6148 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5
for fixation
1x Phosphat-buffer saline (PBS) 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5
1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) 1x PBS with 0.1% Tween 20
Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides Thermo Scientific  1014356190 for collection of tissue sections
Stereo fluorescent microscope e.g., Leica, Zeiss varies with the manufacturer for fluorescence-based genotyping
Thermocycler e.g., Biorad, Applied Biosystems varies with the manufacturer for PCR-based genotyping
Tissue freezing medium (TFM) Triangel Biomedical Sciences TFM-C for embedding of tissue samples
Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) Sigma-Aldrich E10521 for anesthesia
use at 1 mg/ml in E3 embryo medium

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References

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Wehner, D., Jahn, C., Weidinger, G. Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration. J. Vis. Exp. (100), e52756, doi:10.3791/52756 (2015).

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