Introduction
ゼブラフィッシュは、開発、生理学、疾病、および再生の多くの側面を研究するための十分に確立された脊椎動物のモデル生物です。後胚生物学的プロセスのモデルとしてゼブラフィッシュの成長採用により、遺伝子発現またはシグナル伝達経路の誘導性、組織特異的な操作のための実験的なツールは、ますます重要になってきました。特に、成人のゼブラフィッシュにおける臓器や付属物の再生への研究は、これらの再生プロセスの間、シグナル伝達経路の時空間的な要件の解剖のためのツールの不足に苦しんでいます。
のCre-lox系、トランスポゾン媒介体形質転換を用いて、熱ショック誘導性導入遺伝子のモザイク発現、及びティシステム1：現在、三つの異なるシステムが成体ゼブラフィッシュの器官の再生の条件、組織特異的遺伝子発現を達成するために使用されています-3。ティトンはテトラサイクリン続きの変種を指します発現は、抗生物質テトラサイクリンまたはその誘導体、 例えば、ドキシサイクリンの存在下で活性化されたロール転写活性化システム。それまで成魚に使用されているようのCre-lox系は、その発現が空間的に組織特異的調節エレメントによって制限されているタモキシフェン制御Creリコンビナーゼ（CreERT2）に依存しています。 STOPカセットのCreドリブン除去は、全ての細胞型1でアクティブであるべきであるプロモーターによって駆動される目的の遺伝子の発現を促進します。モザイク状に発現体細胞導入遺伝子のトランスポゾン媒介性の作成は、個々の細胞系統における誘導性導入遺伝子発現のためのシステムを提供します。一般的にのみ再生臓器2の離散的な細胞系統に導入遺伝子を有するキメラ個体においてヒートショックプロモーター結果の転写制御下に目的の遺伝子を運ぶのTol2トランスポゾンとゼブラフィッシュ胚の注入。両方のシステムは、条件付き組織-SPEを可能にしながら、cific遺伝子発現、のCre-lox系は可逆的ではない、とトランスポゾンクローンの標識を使用しての戦略は、その確率的性質に苦しんでいます。このように、私たちと他の人は最近、時間的に容易に、ゼブラフィッシュで使用するためのトランスジェニックテトン·システム、および添加調整可能と可逆3-5にある空間的に制御された遺伝子発現を適応しています。
ここで使用されるティシステムは、ドキシサイクリン（DOX）誘導性転写活性化因子（改善されたリバーステトラサイクリントランスアクチベーター、irtTA、短いたTetA）は、トランスジェニックドライバ行（TetActivator）を含む組織特異的ゲノム調節配列の制御下にあります。 （ 図1A）;第二に、テトラサイクリンオペレーター（TetREのTet応答エレメント）の転写制御下で目的の遺伝子を保有するトランスジェニックレスポンダライン（TetResponder）が必要です。したがって、TetActivatorとTetResponderラインの特定の組み合わせの使用が条件付き組織特異することが可能遺伝子発現のFIC操作。
我々は最近、ゼブラフィッシュテールフィン3を再生成人におけるWnt /β-カテニンシグナル伝達の組織特異的機能を探索するためにテトンシステムを利用してきました。ここで説明したプロトコルでは、フィン再生の研究のために、特に、ゼブラフィッシュにおけるテトンシステムのセットアップおよび使用のための作業の流れを説明します。これは、安定したトランスジェニックTetActivatorとTetResponderラインと胚および成体ゼブラフィッシュにおける導入遺伝子の誘導のためのプロトコルを生成する方法の詳細な手順が含まれています。さらに、我々は、成体ゼブラフィッシュフィンの凍結切片の調製のためのプロトコルを含むフィン再生成における組織特異的遺伝子発現の検証のための技術を説明します。さらに、当社はTetActivator導入遺伝子の設計、遺伝子導入方法の選択、およびTetResponder発現の検出のための考慮事項について説明します。したがって、このプロトコルの全体的な目標は、設計図として機能しますセット·アップ機能ティシステムのゼブラフィッシュの関心の任意の組織に適用することができる条件組織特異的遺伝子発現を達成するために。
我々は、（エンハンサー断片;ワイディンガーラボのプラスミドデータベースはありません1247; 図1B）の短いゲノム調節配列を用いて、安定したTetActivatorラインのI-SceIでまたはTol2の媒介性の発生を可能にするTetActivatorベクトルを作成しました。この構築物は、単純ヘルペスウイルスのVP16トランス活性化ドメイン誘導体3F [irtTAM2（3F）]と融合リバースTetリプレッサードメインのM2突然変異体からなるTetActivatorカセットを含みます。それは、同じオープンリーディングフレームからフルオロフォアAmCyanと共発現されているのでTetActivatorエチレンテトラミン（TETA）の発現を容易に監視することができます。 1比5,6：P2Aペプチドは1で別々のタンパク質としてたTetAとAmCyanの産生をもたらすべきであるリボソームスキッピングを媒介します。構築物はまた、Tのpoylinker 5 'を含みます従来のクローニング方法を用いて、対象のゲノム調節配列の挿入を容易にするetActivatorカセット。
、細菌人工染色体（BAC）に再結合することができる（大きなゲノム領域を含む;さらに、我々は、上記のTetActivatorカセットプラスカナマイシン選択カセットからなる構築物（ 図1C。ワイディンガーラボプラスミドデータベースなし1180）作成しました通常発現パターン）導入遺伝子によって模倣される遺伝子の開始コドンに。両方の構築物は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。
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Protocol
トランスジェニックTetActivator魚ラインの1世代
- TetActivator構築物の生成
- 標準的な技術を用いて、ベクトル＃1247でTetActivatorカセットの上流に関心の調節配列を複製します。あるいは、参照詳細コンビニアリングプロトコルの（TetActivatorカセット（ベクター＃1180）は、標的遺伝子の第一エキソンに挿入され、Tol2の逆方向反復配列は、BACの骨格に導入されるた、BACを生成するための組換え技術を使用し7,8）。
- 毒素を含まないプラスミドDNAまたは市販のキットを使用して、BAC DNA調製物を準備します。
- トランスジェニックTetActivator魚ラインの生成
- 標準的な手順9に記載TetActivator構築物のマイクロインジェクションを実行します。
- 一緒TOL2の TRAのためのキャップされたセンスRNAをコードして1細胞期胚に25〜50のプラスミドDNAのPGまたは最大250のPGのBAC DNAを注入トランスポゾン媒介遺伝子導入のための、またはI-SceI制限酵素媒介性の遺伝子導入のためのI-SceI制限酵素タンパク質とnsposase。
注：遺伝子導入方法の選択の考察は、議論のセクションで見つけることができます。
注：DNAが細胞質中に送達されていない場合に遺伝子導入の効率が低下するかもしれないので、細胞質ではなく、卵黄に好ましくは注入します。
- 一緒TOL2の TRAのためのキャップされたセンスRNAをコードして1細胞期胚に25〜50のプラスミドDNAのPGまたは最大250のPGのBAC DNAを注入トランスポゾン媒介遺伝子導入のための、またはI-SceI制限酵素媒介性の遺伝子導入のためのI-SceI制限酵素タンパク質とnsposase。
- 成人期に注入G0胚を上げます。必要に応じて、画面G0のAmCyan蛍光のための胚および優先的には、所望の発現パターンを示す胚を成長させます。これはTol2の媒介性の遺伝子導入に特に生殖系列伝達の速度を増加させる可能性があります。
- （例を図1Dに示されている）は、蛍光実体顕微鏡を用いて、野生型の魚とF1胚または幼虫における予想される発現パターンのAmCyan蛍光の出現に、個々のG0魚を異系交雑することによって成功した生殖系列の統合を評価します。
- 蛍光陽性上げF1胚を成体と安定したF2トランスジェニック魚を得るために、野生型の魚で、それらを結合するように。
- 個々の行は、発現レベル、発現パターン、TetResponderライン、漏出を誘導する能力、およびサイレンシングに対する感受性が異なる場合がありますので、上げ、異なるG0の創始魚に由来する少なくとも3つの異なる亜系統を特徴づけます。
注：確実に胚で発現している多くの導入遺伝子が部分的または完全に後期の幼虫や成魚にサイレンシングされています。ラインは成魚で使用されることを意図している場合したがって、成人期の間にそれらのTetActivatorの発現および機能のために、いくつかの独立した系統を特徴づけます。
注：私たちは、表1に列挙されている両方の胚および成魚、中TetActivatorの組織特異的発現のためのTetActivator株のパネルを生成したこれらの行は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。
- 標準的な手順9に記載TetActivator構築物のマイクロインジェクションを実行します。
トランスジェニックTの2世代etResponder魚ライン
注：私たちはTetResponderリクエストに応じワイディンガーラボから入手可能である、安定したTetResponderラインのI-SceIでまたはTol2の媒介性の発生を可能に構築する生成した（ワイディンガーラボのプラスミドデータベースなし1444; 図1E）。この構築物は、目的の遺伝子とYFP誘導体YPetコード配列のコード配列（CDS）の挿入を容易にするポリリンカー領域に続いてテトラサイクリンオペレーターが含まれています。したがって、構築物はYPetと目的のタンパク質のC末端融合のたTetA媒介発現のために設計されています。タグ融合タンパク質の発現を回避する必要がある場合には、P2AまたはT2Aペプチドは別々のポリペプチドとして、6,10及びYPet関心のタンパク質の同時発現を促進する関心CDSの遺伝子に導入することができます。
- TetResponder構築物の生成
- テトラサイクリンオペレーターの「関心3の遺伝子のクローンCDS5 YPetのCDSの 'が標準的な手順に従いました。終止コドンは、関心のCDSの遺伝子から除去されたことを確認してください。
- 市販のキットを使用して毒素を含まないプラスミドDNA調製物を準備します。
- トランスジェニックTetResponder魚ラインの生成
- TetResponderのマイクロインジェクションを行う標準的な手順9に記載の構築物。
- トランスポゾン媒介遺伝子導入のための、またはメガヌクレアーゼ支援遺伝子導入のためのI-SceI制限酵素酵素とTOL2トランスポザーゼのためのキャップされたセンスRNAをコードと一緒に1細胞期胚の細胞質へのプラスミドDNAの25〜50頁を注入します。
注：遺伝子導入方法の選択の考察は、議論のセクションで見つけることができます。
注：DNAが細胞質中に送達されていない場合に遺伝子導入の効率が低下するかもしれないので、細胞質ではなく、卵黄に好ましくは注入します。
- トランスポゾン媒介遺伝子導入のための、またはメガヌクレアーゼ支援遺伝子導入のためのI-SceI制限酵素酵素とTOL2トランスポザーゼのためのキャップされたセンスRNAをコードと一緒に1細胞期胚の細胞質へのプラスミドDNAの25〜50頁を注入します。
- に注入G0胚を上げますdulthood。
- F1胚またはF1幼虫のドキシサイクリン処理に続いて、以前に確立TetActivatorラインで個々のG0魚を交配することにより、導入遺伝子の成功した生殖系列の統合と誘導能を評価します。
注：この行は、胚および成体ではかなりユビキタス発現を駆動するように、機能TetResponderキャリアをスクリーニングするためにエチレンテトラミン（TETA AmCyan 3：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm2、短いユビキチンユビキチン ）通常、我々は、 ユビキチンプロモーター駆動TetActivatorラインを使用します魚、したがっては、関心のある全ての組織でTetResponder誘導能を評価するのに非常に適しています。この行は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。 - E3胚培地を含む別個の10センチメートルシャーレに各クラッチの胚を収集する（材料表を参照）、28.5℃で皿をインキュベートします。
- 個々の番号のタンクに胚が得られた場所のG0の魚（飼育箱を、材料の表を参照）胚は画面されるまでエド。これは、導入遺伝子の生殖系列伝達を示すG0魚の回収を可能にします。
- 胚の半分だけがTetActivator導入遺伝子を運ぶことが予想される場合（場合にヘテロ接合TetActivatorキャリアはTetResponderの創設者の魚と交配された）、適切な発達段階でAmCyan蛍光の出現によってTetActivator導入遺伝子を含む胚を選択。
- 2.3節で説明したように、ドキシサイクリン（DOX）で胚を処理することによりTetActivator転写活性を誘導します。
- YPet蛍光の出現の画面F1胚。それは、クラッチで胚が予想される発現ドメインと個々の胚の間にほとんど変化の中に少しモザイクが表示されるはずである、均質なYPet式を生成ライン（G0魚を）好みます。代表的な例については、図1Fおよび図1Gに矢じりを参照してください。
- で同定された誘導性TetResponder導入遺伝子を送信メイトG0の魚野生型の魚とステップ2.2.8および成人期にすべてのF1胚を発生させます。
- （セクションを参照するか（2.5節を参照）F2胚およびYPet蛍光の出現のDOX処理を行っTetActivatorラインに個々のF1魚を交配することによって、PCRベースのジェノタイピングのいずれかによって、成人F1トランスジェニック魚を識別します。
- 誘導性は、個々の行に異なる場合がありますので、異なるG0の創始魚に由来する少なくとも3つの異なるTetResponderサブラインを確立し、特徴づけます。特定の達成可能な発現レベルのと異なる場合があります応答者が全ての細胞型で活性化することができるかどうか。また、サイレンシングに対する感受性はラインの間異なります。最後に、いくつかの場合には、ドキシサイクリンの非存在下でTetActivatorラインとの組み合わせで製造さ漏出性発現が発達障害または毒性を引き起こすことが予想される場合は特に、目的のタンパク質の中程度の発現レベルを仲介する行を選択することが好ましいかもしれません。
注：テト胚において確実に誘導されているレスポンダ線が部分的または完全に後期の幼虫や成魚にサイレンシングすることができます。ラインは成魚で使用されることを意図している場合したがって、いくつかの独立した系統は、成人における誘導能について特徴付けされるべきです。目的の遺伝子の誘導はさらなる発展と互換性がある場合は、胚におけるGOIの発現を誘導するために、最も堅牢で少なくともモザイクを示す個体だけを選択し、高めるために、二重トランスジェニック胚（TetActivatorがTetResponderをX）を作成するのに有用であることが証明されました誘導。 - ）を維持し、2.5節で説明したように確立されたTetResponder株、遺伝子型の成魚を伝播します。
- TetResponderのマイクロインジェクションを行う標準的な手順9に記載の構築物。
- 胚のドキシサイクリン処理
- 2,000xドキシサイクリン（DOX）の株式を準備します。を50mg / mlの（97ミリモル）の濃度を達成するために、50％EtOHにDOXを解きます。店舗DOXストックを-20℃で光から保護します。
- 胚からE3媒体の大部分をデカントし、それを置き換えます25 / mlのDOX（50ミリリットルE3あたり2,000x DOXの株式の2.5μL）の最終濃度でDOXを含むE3胚媒体。 Dechorionationは必要ありません。
- YPet蛍光の出現によって、目的のタグ付けされた遺伝子の発現を評価する前に、6時間の最低28.5℃に胚を返します。
- 溶媒のみEtOHで胚を処理することによりTetActivator / TetResponderの組み合わせの漏出を評価します。
注：TetResponderのmRNAを検出するためのin situハイブリダイゼーション （ISH）、またはRT-PCR では 、目的のタグ付けされた遺伝子の蛍光よりも漏出のより敏感な尺度として使用することができます。漏出の程度は、特定のTetActivator / TetResponderラインの組み合わせに依存し、それが組織や発達段階の間でも異なる場合があります。
- 大人のゼブラフィッシュの麻酔
- 直径10cmのペトリ皿または1 mg / mlのトリカイン（エチル3-アミノベンゾエートmethanesuを含む魚系の水で満たされた小さなビーカーを準備lfonate、MS-222）。
- 麻酔薬を含む容器に魚を移し、完全な平衡の損失（魚は、その側にある）、ない動きや11にタッチすることに応答なしで示したように、それは麻酔のレベル4になるまで待ちます。
- 慎重に（セクション3.2を参照）、スライドガラス上にプラスチックシャーレ、またはアガロースでコーティングされたシャーレの蓋をピンセットを用いて、魚やスプーンを転送し、フィン切断または撮影を行います。
- 鮮魚システム大量の水を容器に魚を戻し、それを監視します。鰓の動きが3分以内に再開されない場合は、プラスチック製のトランスファーピペットを用いて鰓に水を吹き付けてアシスト。
- TetResponder魚のPCRベースのジェノタイピング
- テールフィン12の部分的な切断を実行します。個々の、番号付きタンクに魚を置き（飼育箱、 材料の表を参照）。これが成功したジェノタイピング以下、トランスジェニック魚の回収を可能にします。
- トラ96ウェルPCRプレートは、ゲノムDNA 13の単離のための20μlのDNアーゼを含まない水を予め充填された個々のウェルにフィン組織nsfer。
- 各ウェルに120μlの1 MのNaOHを添加し、サーマルサイクラーを用いて95℃で20分間サンプルをインキュベートします。
- 4°Cまでチル試料を、各ウェルに1 MのTris-HCl（pH8.0）を14μlを添加し、短時間ボルテックスサンプル。 16,000×gで5分間遠心サンプルは、細胞破片をペレット化します。必要になるまで4℃でゲノムDNAを保管してください。
- 設計プライマーは特にTetResponder導入遺伝子の断片を増幅しました。標準的なPCR反応で単離されたDNAの2μLを使用し、アガロースゲルでPCR産物を分析します。
アダルトリジェネゼブラフィッシュテールフィンにおける導入遺伝子発現の3組織特異的誘導
- TetActivatorの確立;二重トランスジェニック魚TetResponder
- TetResponder CARRIでTetActivatorキャリアメイトERS。
- TetActivatorカセットを駆動する調節要素がアクティブなときに発生段階でTetActivator導入遺伝子を保有する選択した胚。トランスジェニック胚は容易に立体蛍光顕微鏡を用いてAmCyan蛍光の出現によって同定することができます。
注：TetActivator導入遺伝子陽性の魚は、あるいは、例えば、麻酔した魚の撮像によって、成人期に識別することができます。尾びれの切断と再生成中AmCyan蛍光の出現以下。 - 成人期に選択した胚を上げます。
- 目的の組織にTetResponderの発現を誘導する能力によって、PCRベースのジェノタイピングまたは（好ましくは）によって（TetActivatorに加えてTetResponderを運ぶ魚）ダブルトランスジェニック成魚を特定します。再生テールフィンでTetResponder誘導および検出のためのプロトコルは、セクション2.3とセクション4に記載されています。
注：一過TetResponder式に互換性がある場合さらに、胚または幼虫の発育と、それは上記のように、胚発生の間DOX処理後TetActivatorとTetResponder導入遺伝子を保有する二重トランスジェニック胚を同定するのに有用である（2.3節、 図1H）。二重陽性胚はAmCyanとYPet蛍光を表示します。成人期に正の胚を上げます。
- ゼブラフィッシュテールフィンの切断と再生フィンにおける導入遺伝子発現の誘導
- 麻酔魚の尾びれの部分的な切断を行う12（2.4節を参照）。 DOXのいずれかすぐに魚を治療または魚ハウジングシステムに戻します。
- 飼育箱の準備（ 図2A;材料の表を参照）（魚のシステム水1リットルに2,000x 50 mg / mlのストックの500μlを添加する）を25μg/ mlのDOXを含む魚系水1Lを充填しました。
注：すぐに切断した後、導入遺伝子発現の誘導は、を可能にします再生時の初期の事象に影響sessment、3日目の誘導後に切断（3 DPA）は、回生成長中に導入遺伝子の発現または機能を評価するために使用されるべきです。 - 魚が逃げることができないように蓋（ 図2A）で飼育箱やクローズボックスに10以前に切断し、二重トランスジェニック魚まで移します。
- ストレスを軽減するために暗いに飼育箱を置きます。私たちは通常、一定の暗さと温度を確保するために28.5℃の空気インキュベーターにボックスを配置します。
- エタノールのみ（1L魚系の水あたり250μl）を用いて、陰性対照二重トランスジェニック魚を扱います。
注：私たちは、フィンの再生にここで使用されるDOXの用量の影響を観察したことがありませんが、DOXで処理されたシングルトランスジェニックまたは野生型の魚は、追加の陰性対照として使用することができます。 - 湿ったアガロースでコーティングされたペトリにセクション2.4と転送ピンセットを使用して魚やスプーンで説明したように魚を麻酔皿。慎重にピンセットを使用して、尾びれを広げます。
- 蛍光立体顕微鏡を使用して再生成内YPetの出現のためのスクリーンの魚（ 図2B）。
注：通常、TetResponder駆動型蛍光が確実にDOX処置の6時間後に観察することができます。しかし、生成された各ラインについてTetResponder発現のダイナミクスを特徴づけることをお勧めします。 - TetResponder導入遺伝子誘導を終了したり、治療を継続する魚ハウジングシステムに魚を返します。
注：処置は> 24時間（長期治療）のために、水を交換し、徹底的に毎日の飼育箱をきれいにすることが不可欠です。 - 長期治療中に、供給した後、飼育箱に戻す前に、新鮮な魚系水できれいな容器に魚を転送することにより、2〜3日ごとに魚を食べます。
フィン再生成でTetResponder発現の4キャラクタリゼーション
T ">注：私達は通常3 DPAで凍結切片の蛍光イメージングを使用して、フィン再生尾部に組織特異的な遺伝子発現を確認し、この時点で再生成の異なる組織区画を形成していると明らかに組織切片上で識別することができます。および凍結切片は、再生の後の段階でより単純である。 図2Cは、再生成に区別することができる組織のドメインを示し、これらのドメインのためのいくつかの分子マーカーを示しています。以下のプロトコルは、直接イメージングまたは免疫染色のために縦または横凍結切片の調製を記載します。- 大人のテールフィンの凍結切片
- そのテールフィンのセクション3.2で説明したようにDOXと3 DPAまで2 DPAから切断された魚を扱います
- 2.4節で説明したように魚を麻酔
- 優しくプラスチックシャーレの蓋の上に魚を転送するためにスプーンやピンセットを使用してください。
- 約4-5骨セグメントでフィン再生成を再切断しますSメスを使用して初期切断面に近接し、新鮮な魚のシステム水に魚を戻します。
- 慎重転送は1Xリン酸緩衝生理食塩水で4％（w / v）のパラホルムアルデヒド（PFA）を含む小さなペトリ皿（ 例えば、35ミリメートル）で再生する（PBS;材料の表を参照）、微細ピンセットを用いて。再生成が、組織の唯一の切り株部分には触れないでください。
- シャーレの底に平らな組織を置き、4℃でO / Nを固定します。
- 洗浄は、PFAを除去し、骨基質を脱灰するO / N 0.5 M EDTA-PBS（pH7.5）を4℃で再生成をインキュベートし、0.1％のTween（PBT）を含む1×PBSで2回再生します。
- 10％スクロースのPBS、20％スクロースのPBS、30％スクロースのPBSおよび30％RTで再生成をインキュベートスクロース-PBS：1での組織凍結培地：1の比率、30分ごとに（TFM材料の表を参照）。続いて、組織凍結培地中> 2時間、4℃でフィンをインキュベートします。
- 顕微鏡スライド上cryomoldsを置き、フィル組織凍結培地でM。気泡を導入することは避けてください。
- 転送は、フィン再生成（ 図2D）の縦または横方向のセクションを得るために適切にcryomoldsオリエント組織に再生します。その再生成を確認切片容易にする、直線状です。
- 転送は、凍結プロセス（ 図2D）を開始するためにドライアイスのベッドの上に位置する金属ラックに顕微鏡用スライドと一緒にcryomolds。
- 組織凍結培地が固体になった後、ベンチにcryomold置き、培地を凍結組織は、プラスチック媒体の界面で解凍するように、数分間室温で放置します。
- cryomoldから凍結ブロックをプッシュするペンまたは同様のを使用してください。組織切片まで-80℃でのボックスに保管してcryoblocks。
- （材料の表を参照）クライオミクロトームを用いて、10〜14ミクロンの厚さの凍結切片を作成し、接着顕微鏡スライド上のセクションを収集します。 NEまで-20℃で保存スライドeded。
- YPet蛍光に基づいて、フィン切片上TetResponder発現の特徴
- PBTで室温で2回洗浄し、PBSで1回洗浄、それぞれ5分間、続いて顕微鏡スライドへの付着を改善するために、-20℃に冷却し、100％のMeOHで30分間フィンのセクションを扱います。
- 2回の洗浄を10分間PBS中でそれぞれが続く：PBS中の4で10分 '、6-ジアミジノ-2- phenylinodole（DAPI）（5000 1）インキュベートするセクションによって核を可視化。
- 75％のグリセロール、PBSまたは市販の抗退色マウントでマウントセクション、カバースライドでカバーしています。
- 画像YPetおよび共焦点または広視野蛍光顕微鏡下でAmCyan蛍光（ 図1E）。
注：一緒に、抗GFP（YPetと反応するが、AmCyanない）抗体を用いて、細胞型特異的抗原に対する抗体でYPet、免疫蛍光法または免疫組織化学を発現する細胞タイプの明確な同定を容易にするために行うことができます。代替的に、弱いYPet発現の検出を容易にするために、YPet RNAに対するin situハイブリダイゼーション RNAのいずれかの全体マウントフィン又はフィンのパラフィン切片上で行うことができます。
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Representative Results
組織特異的な誘導性遺伝子発現、トランスジェニックTetActivatorとTetResponderラインのための機能テトンシステムを確立するために生成された（ 図1A）する必要があります。初期のゼブラフィッシュ胚およびその後の生殖系列の統合に構築またはTetResponder（ 図1E） -これはTetActivator（C図1B）を微量注入することによって達成されます。機能TetActivator構築物のいずれか、または目的の遺伝子（ 図1C）の調節エレメントを含むBACにTetActivatorカセットを再結合することによってTetActivatorカセット（ 図1B）の上流の短い調節配列（エンハンサーエレメント）をクローニングすることによって生成することができます。 TetActivator構築物の生殖細胞系列の統合は、個人が予想される発現パターン（ 図1D）にG0魚とF1胚におけるAmCyan蛍光の出現を注入異系交雑することによって評価することができます。生殖系列INTEGTetResponder導入遺伝子の比率と機能は、個々のG0を交配することによって評価することができる（ ユビキチンここ：たTetA AmCyan）を設立TetActivator魚に魚を注入し、YFP / YPet蛍光（ 図1F）のDOXと外観で処理しました。強力かつ均質なYFP / YPetの発現を示す魚が安定TetResponderライン（ 図1G）を確立することが好ましいする必要があります。安定TetActivatorとTetResponder魚のラインを確立した、特定のTetActivator / TetResponderの組み合わせは、交配によって生成することができます。 TetActiatorとTetResponder導入遺伝子のキャリアはTetActivatorがアクティブである発達段階（ 図1H）にYFP / YpetのDOX治療終了出現次胚形成の間に識別することができます。あるいは、二重トランスジェニック魚はDOX処理と再生テールフィン（ - B図2A）でTetResponder導入遺伝子の誘導後に識別することができます。
< Pクラス= "jove_contentは">私たちは日常的に再生ゼブラフィッシュテールフィンで誘導性、組織特異的な遺伝子発現を達成するためにこのシステムを使用しています。再生成の異なる組織区画は明らかにこの時点（ 図2C）で、組織切片上で識別することができるので、我々は、3 DPAフィン再生物の凍結切片の蛍光イメージングによって組織特異的TetResponderの導入遺伝子の発現を確認します。縦または横フィン再生セクションは、組織を凍結保護し、フィンを適切に（ 図2D）を再生成埋め込 んだ後凍結切片により得られます。切片化後、TetResponder導入遺伝子発現（Ypet / YFP蛍光）は、蛍光または共焦点顕微鏡（ 図2E）を使用して画像化することができます。遠位芽（矢じり）および表皮（矢印）の発現を欠いている間her4.3プロモーター駆動TetActivatorは、近位内側芽でTetResponder発現を誘導することに注意してください。 ove_content ">
図1：トランスジェニックTetActivatorとTetResponder株の生成。 （A）は、漫画ティシステムを用いて、組織特異的誘導性遺伝子発現のためのストラテジーを示します。 （B）トランスジェニックTetActivatorは（ワイディンガーラボのプラスミドデータベースがない。1247）を構築します。 5 'TetActivator irtTAM2（3F）のポリリンカーは、cを容易に興味のある調節配列のloning。 AmCyanコード配列は、P2Aの自己切断」ペプチドを介してTetActivatorから分離されます。カセットはまた、Tol2のトランスポゾン逆方向反復に隣接しているSV40ポリアデニル化シグナルを含み、単一のI-SceI制限酵素メガヌクレアーゼ認識部位が含まれています。 BACのコンビニアリングのための（C）TetActivatorカセット（ワイディンガーラボのプラスミドデータベースがない。1180）。カセットは、GB3原核生物プロモーターによって駆動される選択のためのカナマイシン遺伝子を含みます。カナマイシン耐性遺伝子に隣接するFRT部位は、BACへの統合を成功次ののFlpリコンビナーゼ媒介除去することを可能にします。 （D）her4.3を送信G0の創始魚の同定：たTetA AmCyanは彼らの生殖系列を介して構築します。キャリアは、いくつかのF1胚（矢頭）でAmCyan蛍光の出現を介して識別されます。 （E）トランスジェニックTetResponderは（ワイディンガーラボのプラスミドデータベースがない。1444）を構築します。これは、（TetREタイト、クロンテック）最適化のTet応答エレメントの制御下で、ポリリンカーとYPetのCDSで構成されて構築し、SV40ポリアデニル化シグナルによって終了します。それはTol2のトランスポゾン逆方向反復によって隣接し、単一のI-SceIでメガヌクレアーゼ認識部位を含んでいます。機能TetResponder TetREを送信G0の創始魚の（F）の同定：AXIN1-YFPは、その生殖系列を介して構築します。と6時間（矢印）のためのDOX処理後のYFP蛍光の誘導：キャリアが確立TetActivatorラインミン（TETA AmCyanここユビキチン ）と交配することによって識別されます。 （G）DOX処理の12時間の合計の後に（F）に示すofembryosをクローズアップ。 YFP蛍光のかなりユビキタス誘導に注意してください。とTetResponder（TetRE：AXIN1-YFP）導入遺伝子（矢印）：TetActivatorエチレンテトラミン（TETA AmCyan her4.3）を有する二重トランスジェニック胚の（H）の同定。私たち胚6時間DOXで処理した再。 （A - H）スケールバー：500μmで、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
図2：再生ゼブラフィッシュテールフィンにおける組織特異的遺伝子発現のためのティ系の使用。 大人のゼブラフィッシュのDOXの治療に使用される（A）繁殖ボックス。 her4.3によるAXIN1-YFP TetResponder導入遺伝子：TetREの（B）の誘導たTetA AmCyan TetActivatorDOX処理の12時間後の再生尾びれで。エタノール処置対照魚におけるYFP蛍光が存在しないことを注意してください。 （C）漫画は縦断面図で3 DPAでフィン再生成内に見られる組織区画の一部を描きました。 （D）凍結切片のためのサンプル調製。フィン再生成は、組織凍結培地（TFM）に配置された再生成の縦または横のいずれかのセクションを得るために適切に指向cryomoldsを、-filled、およびTFMが凝固するまでドライアイスの上に座って、金属ラックに転送されます。セクショニング面が赤で表示されます。略語：DIST：先端、PROX：近位、ベント：腹、.:背をドース。 （B）に示すフィンから誘導されたフィン線再生成の縦断面におけるYFP蛍光の（E）の共焦点画像。たTetA AmCyan TetActivatorラインは近位内側芽に特異的にYFP誘導を駆動：her4.3ことに注意してください。 YFP蛍光は、創傷表皮（矢印）、および間葉（矢じり）（BC）スケールバーの最遠位領域を含む、区画の様々な検出されなかった：500ミクロン。 （E）スケールバー：100ミクロン、この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。
| TetActivatorライン | リファレンス | 調節エレメントが使用され | 主に発現し |
| 7xTCF-Xla.Siam：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan | 未発表ウェーナー＆ワイディンガー、 | 7xTCF-Xla.SiamのWntレポーター1 | Wntシグナル応答性組織 |
| myl7：irtTAM2（3F）-p2a-mCherryを | 未発表ハーゼ＆ワイディンガー、 | myl7（cmlc2）2 | 成熟心筋細胞 |
| her4.3：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | 中枢神経系 |
| keratin4：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | 表皮は、大人のフィンに基底層を除きます |
| keratin18：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | 表皮、基底層でもっぱら大人のフィンで |
| SP7：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / OSX 7 | （コミット）骨芽細胞 |
| ユビキチン：irtTAM2（3F）-p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ユビキチン8 | （かなり）ユビキタス |
表1：使用可能なトランスジェニックTetActivatorラインこの表は、トランスジェニックTetActivaを示していますリクエストに応じてワイディンガーラボから入手可能であり、胚および成体の両方の魚でTetActivatorの組織特異的発現のためのTORライン。
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Discussion
大人のゼブラフィッシュは、正常に多くの内臓や付属を再生する驚くべき能力を持っています。関与する分子·細胞メカニズムの完全な理解は、遺伝子の機能とシグナル伝達経路の組織特異的な分析が必要です。この方に、ティトンシステムは、胚および成体ゼブラフィッシュにおける時空間的制御遺伝子発現のための効率的なツールを提供します。この原稿に記載されテトン·システムの構成および方法論は成功し、我々の研究室3の最近の研究で使用されてきました。テトンシステムを確立するときに、次の追加の問題を考慮する必要があります。
TetActivator導入遺伝子の設計上の考慮事項
我々は以前、私は、単純ヘルペスウイルスのVP16トランス活性化ドメイン誘導体3F [irtTAM2（3F）と融合させ、逆TetリプレッサードメインのM2突然変異体からなるその単一の誘導性TetActivatorを示していますnは短いたTetA-M2]効率的な誘導を付与するが、低表示することができ、測定可能な漏出はいえ、それがドキシサイクリン（DOX）5の非存在下で活性を誘導する背景です。したがって、我々は漏出5を排除グルココルチコイド受容体エチレンテトラミン（TETA-GBD）またはエクジソン受容体エチレンテトラミン（TETA-ECR）のドメインとの融合を使用して、二重誘導系を記載しています。システムは、毒性または非常に強力なタンパク質（ 例えば、癌遺伝子）を発現するために使用される場合はこのように、二重変異体誘導の使用が考慮されるべきです。あるいは、TetActivatorとTetResponderラインの確立中に異なる発現レベルを生成する行の範囲を選択することができ、ケースの漏出に選択された弱い誘導物質を強く誘導線の問題です。たTetA-GBDまたはたTetA-ECR変異体を含むTetActivator構築物は、要求に応じてワイディンガーラボから入手可能です。
トランスジェニックゼブラフィッシュラインの生成のための遺伝子導入法
TetResponder導入遺伝子の発現解析
大人のフィンに組織特異的TetResponder導入遺伝子の発現を検出するために、我々は通常、凍結切片の蛍光イメージングを使用しています。我々の経験では、導入遺伝子によって発現される蛍光タンパク質の蛍光はfixatio全体に保存されています手順ので、直接画像化することができるが、nおよび凍結切片。他の場所に記載されているTetResponder発現、を検出するためのさらなる方法は、以下のとおりです。セクションで、II）は、蛍光または発色ISHは、抗GFP抗体を用いて、好ましくは、ここで蛍光タンパク質タグ、YPetに対して、切片上で免疫染色I）、またはIII ）ホールマウントISHは、切片が続きます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
著者は、技術支援のためのクリスタハーゼ、ドリス·ウェーバーとブリジットKorteの感謝します。ワイディンガーラボでの仕事はドイツ学術協会WE 4223 / 3-1の補助金によってサポートされ、4223 / 4-1とドイツゲゼルシャフトエリーゼKardiologieオスカー·ラップ·Stipendiumを経由し、クラウス·ゲオルクウント·Sigrid-によりWE Hengstberger-Forschungsstipendium。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
