Introduction
El pez cebra es un organismo vertebrado modelo bien establecido para estudiar muchos aspectos del desarrollo, fisiología, la enfermedad, y la regeneración. Con la creciente adopción de pez cebra como modelo para los procesos biológicos post-embrionarias, herramientas experimentales para la manipulación inducible, específico de tejido de la expresión génica o vías de señalización se han convertido cada vez más importante. En particular, los estudios sobre la regeneración de órganos y apéndice en el pez cebra adultos han sufrido de una falta de herramientas para la disección de los requisitos de espacio-temporales de las vías de señalización durante estos procesos regenerativos.
Actualmente, tres sistemas diferentes se han utilizado para lograr condicional, expresión específica de tejido del gen en la regeneración de órganos del pez cebra adultos: el sistema Cre-lox, la expresión mosaico de choque térmico transgenes inducibles utilizando transgénesis somática mediada por transposón, y el sistema de téton 1 -3. Téton refiere a una variante de una tetraciclina-contsistema de activación transcripcional laminado, donde se activa la expresión en presencia del antibiótico tetraciclina o un derivado, por ejemplo, doxiciclina. El sistema Cre-lox, ya que hasta ahora se ha utilizado en peces adultos, se basa en una recombinasa Cre controlada por tamoxifeno (CreERT2), cuya expresión está restringida espacialmente por elementos reguladores específicos de tejido. Eliminación impulsado por Cre de un casete de STOP facilita la expresión del gen de interés dirigido por un promotor que debe ser activo en todos los tipos celulares 1. Creación transposón mediada de transgenes somáticas mosaically expresadas proporciona un sistema para la expresión del transgén inducible en linajes de células individuales. La inyección de embriones de pez cebra con un transposón Tol2 que lleva un gen de interés bajo el control transcripcional de un promotor de choque térmico resultados en individuos quiméricos típicamente llevan el transgén sólo en linajes de células discretas de un órgano de regeneración 2. Mientras que ambos sistemas permiten condicional tejido-spela expresión génica especí-, el sistema Cre-lox no es reversible, y la estrategia de etiquetado usando clonal basado en transposón sufre de su naturaleza estocástica. Por lo tanto, nosotros y otros han adaptado recientemente sistemas Teton transgénicas para su uso en el pez cebra, que facilitan temporal y la expresión génica controlada espacialmente que está en sintonizable Además y reversible 3-5.
El sistema de Teton utilizado aquí comprende una línea piloto transgénico (TetActivator) en el que un doxiciclina (DOX) activador transcripcional inducible (mejoró transactivador de tetraciclina inversa, irtTA, corta TETA) está bajo el control de secuencias reguladoras genómicas específicas de tejido. En segundo lugar, se requiere una línea transgénica respondedor (TetResponder) que alberga un gen de interés bajo el control transcripcional del operador de tetraciclina (Tet elemento de respuesta; Tetre) (Figura 1A). Por lo tanto, el uso de combinaciones específicas de TetActivator y TetResponder líneas permite condicional tejido-específicaFIC manipulación de la expresión génica.
Hemos utilizado recientemente el sistema téton para sondar para las funciones específicas de tejido de señalización Wnt / beta-catenina en el adulto regeneración de cola de pez cebra de la aleta 3. En el protocolo descrito aquí se describe un flujo de trabajo para la puesta a punto y la utilización del sistema de Teton en el pez cebra, en particular, para el estudio de la regeneración de la aleta. Esto incluye instrucciones detalladas sobre cómo generar líneas TetActivator y TetResponder transgénicas estables y un protocolo para la inducción del transgen en embriones de pez cebra y adulto. Además, se describen técnicas para la verificación de la expresión génica específica de tejido en los regenerados aleta, incluyendo un protocolo para la preparación de criosecciones de aletas de pez cebra adultos. Adicionalmente, se discuten consideraciones para el diseño del transgén TetActivator, la elección de un método de transgénesis, y detección de la expresión TetResponder. Por lo tanto, el objetivo general de este protocolo es la de servir como modelopara el establecimiento de un sistema de seguimiento téton funcional en el pez cebra para lograr la expresión de genes condicional específica de tejido, que se puede aplicar a cualquier tejido de interés.
Hemos creado un vector TetActivator permitiendo I-SCE o la generación mediada Tol2 de líneas TetActivator estables utilizando secuencias reguladoras genómicas cortas (fragmentos potenciador; Weidinger base de datos plásmido laboratorio no 1247;. Figura 1B). Este constructo contiene un casete TetActivator que consiste en la variante mutante M2 del dominio inverso represor Tet fusionado con el virus Herpes simplex VP16 transactivación-dominio derivado 3F [irtTAM2 (3F)]. Expresión de la TetActivator (TETA) se puede monitorizar fácilmente ya que es co-expresada con la AmCyan fluoróforo desde el mismo marco de lectura abierto; un péptido p2a media saltar ribosomal, que debería dar lugar a la producción de la Teta y AmCyan como proteínas separadas en una relación 1: 5,6 1. El constructo también contiene un poylinker 5 'de la TetActivator casete para facilitar la inserción de secuencias reguladoras genómicas de interés usando métodos de clonación convencionales.
Además, hemos creado un constructo que consiste en el casete descrito anteriormente TetActivator además de un casete de selección de kanamicina (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no 1180;. Figura 1C), que puede ser recombinado en un cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene una gran región genómica ( por lo general en el codón de inicio de un gen cuya expresión patrón es para ser imitado por el transgén). Ambas construcciones están disponibles en el laboratorio de Weidinger bajo petición.
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Protocol
1. Generación de transgénicos TetActivator Líneas de pescado
- Generación de construcción TetActivator
- Secuencias reguladoras Clon de interés aguas arriba de la casete TetActivator en el vector # 1247 utilizando técnicas estándar. Alternativamente, utilizar técnicas de recombinación para generar un BAC, en la que el casete TetActivator (vector # 1180) se inserta en el primer exón del gen diana, y donde la Tol2 repeticiones invertidas se introducen en la columna vertebral BAC (para un protocolo detallado recombinería ver 7,8).
- Preparar ADN plásmido libre de toxinas o preparaciones de ADN BAC utilizando kits disponibles comercialmente.
- Generación de líneas de pescado TetActivator transgénico
- Realizar la microinyección de la construcción TetActivator acuerdo con procedimientos estándar 9.
- Inyectar 25-50 pg del ADN plasmídico o hasta 250 pg de ADN BAC en embriones de etapa de una célula junto con cubiertas de codificación de ARN sentido para tra Tol2nsposase de transgénesis mediada por transposón, o con la proteína I-SCE para la transgénesis mediada por I-SCE.
NOTA: Consideraciones sobre la elección del método de transgénesis se pueden encontrar en la sección de discusión.
NOTA: Inyectar preferentemente en el citoplasma, no la yema, ya que la eficiencia de la transgénesis podría disminuir cuando el ADN no se entrega en el citoplasma.
- Inyectar 25-50 pg del ADN plasmídico o hasta 250 pg de ADN BAC en embriones de etapa de una célula junto con cubiertas de codificación de ARN sentido para tra Tol2nsposase de transgénesis mediada por transposón, o con la proteína I-SCE para la transgénesis mediada por I-SCE.
- Levante embriones G0 inyectados a la edad adulta. Opcionalmente, los embriones G0 pantalla para AmCyan fluorescencia y preferentemente crecer embriones que muestran el patrón de expresión deseado. Esto podría aumentar la tasa de transmisión de la línea germinal, en particular para la transgénesis mediada por Tol2.
- Evaluar la integración exitosa de la línea germinal por cruzamiento de pescado G0 individuo con el de tipo salvaje de pescado y la apariencia de fluorescencia AmCyan en el patrón de expresión esperado en embriones o larvas F1 usando un estereomicroscopio fluorescente (ejemplo se muestra en la Figura 1D).
- Levante fluorescencia positivaEmbriones F1 a la edad adulta y se aparean con de tipo salvaje de pescado para obtener estable peces transgénicos F2.
- Levante y caracterizar al menos 3 sublíneas diferentes derivados de peces diferentes fundador G0, ya que las líneas individuales pueden diferir en los niveles de expresión, patrón de expresión, capacidad de inducir líneas TetResponder, permeabilidad, y su susceptibilidad a silenciar.
NOTA: Muchos transgenes que se expresan con firmeza en los embriones son parcial o totalmente silenciados en las larvas en etapa tardía o peces adultos. Por lo tanto, si las líneas están destinados a ser utilizados en peces adultos, caracterizar varias líneas independientes para su expresión TetActivator y la función durante la edad adulta.
NOTA: Hemos generado un panel de líneas TetActivator para la expresión específica de tejido de la TetActivator tanto en los embriones y los peces adultos, que se enumeran en la Tabla 1 Estas líneas están disponibles en el laboratorio Weidinger bajo petición..
- Realizar la microinyección de la construcción TetActivator acuerdo con procedimientos estándar 9.
2. Generación de transgénicos TetResponder Líneas de pescado
NOTA: Hemos generado un constructo TetResponder permitiendo I-SCE o la generación mediada Tol2 de líneas TetResponder estables, que está disponible en el laboratorio Weidinger a petición (Weidinger base de datos de laboratorio de plásmido no 1444; Figura 1E.). Este constructo contiene un operador de tetraciclina, seguido por una región de poliengarce facilitar la inserción de secuencias codificantes (CDS) de un gen de interés y la secuencia de codificación de YFP-derivado YPet. Por lo tanto, el constructo está diseñado para la expresión mediada por TETA de una fusión C-terminal de la proteína de interés con YPet. Si tiene que ser evitado expresión de una proteína de fusión etiquetada, un péptido p2a o T2a puede ser introducido con el gen de CDS de interés, lo que facilita la co-expresión de la proteína de interés y YPet como polipéptidos separados 6,10.
- Generación de construcción TetResponder
- CDS Clon del gen de interés 3 'del operador de tetraciclinay 5 'de los CDS YPet acuerdo con procedimientos estándar. Asegúrese de que el codón de parada se ha eliminado a partir del gen de interés CDS.
- Preparar preparaciones de ADN plásmido libres de toxinas utilizando kits disponibles comercialmente.
- Generación de líneas de pescado TetResponder transgénico
- Efectuar la microinyección de TetResponder construir de acuerdo con procedimientos estándar 9.
- Inyectar 25-50 pg del ADN plásmido en el citoplasma de embriones de una célula de una etapa junto con cubiertas de ARN que codifica para la transposasa sentido Tol2 para la transgénesis mediada por transposón o con la enzima de I-SceI para la transgénesis meganucleasa asistido.
NOTA: Consideraciones sobre la elección del método de transgénesis se pueden encontrar en la sección de discusión.
NOTA: Inyectar preferentemente en el citoplasma, no la yema, ya que la eficiencia de la transgénesis podría disminuir cuando el ADN no se entrega en el citoplasma.
- Inyectar 25-50 pg del ADN plásmido en el citoplasma de embriones de una célula de una etapa junto con cubiertas de ARN que codifica para la transposasa sentido Tol2 para la transgénesis mediada por transposón o con la enzima de I-SceI para la transgénesis meganucleasa asistido.
- Levante inyectados embriones G0 a undulthood.
- Evaluar la integración de la línea germinal de éxito y capacidad de inducción del transgén en el apareamiento de peces G0 individuo con una línea TetActivator previamente establecido, seguido de tratamiento doxiciclina de los embriones o larvas F1 F1.
NOTA: Por lo general, usamos una línea TetActivator promotor impulsado ubiquitina (ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, corta ubiquitina: Teta AmCyan 3) para la detección de portadores TetResponder funcionales, ya que esta línea conduce la expresión bastante ubicuo en los embriones y de adultos pescado y por lo tanto es muy adecuado para evaluar TetResponder inducibilidad en todos los tejidos de interés. Esta línea se encuentra disponible en el laboratorio Weidinger bajo petición. - Recoger los embriones de cada embrague en una placa de Petri de 10 cm separada que contiene medio embrión E3 (ver tabla Materiales) e incubar platos a 28,5 ° C.
- Peces Place G0 que dio embriones en tanques individuales numeradas (cajas de cría; ver tabla Materiales) hasta que los embriones han sido pantallaed. Esto permite la recuperación de los peces G0 que muestran germen de la línea de transmisión del transgén.
- Si se espera que sólo la mitad de los embriones para llevar el transgén TetActivator (en caso de un portador TetActivator heterocigóticos se acercó a un pez fundador TetResponder), seleccionar los embriones que contienen el transgén TetActivator por la aparición de AmCyan fluorescencia a la etapa de desarrollo apropiado.
- Inducir la actividad transcripcional TetActivator tratando embriones con doxiciclina (DOX) como se describe en la sección 2.3.
- Embriones F1 Pantalla de emergencia de YPet fluorescencia. Prefiero líneas (peces G0) que producen la expresión YPet homogénea, es decir embriones en el embrague deben mostrar poco mosaicismo en el dominio de la expresión esperada y poca variación entre los embriones individuales. Ver puntas de flecha en la figura 1F y 1G figura de ejemplos representativos.
- Mate G0 pescado transmitir un transgén TetResponder inducible identificado enpaso 2.2.8 con el tipo salvaje pescado y recaudar todos los embriones F1 hasta la edad adulta.
- Identificar adultos peces transgénicos F1, ya sea por el genotipado basado en la PCR (véase la sección o cruzando peces F1 individuo a una línea TetActivator seguido de tratamiento DOX de embriones F2 y aparición de YPet fluorescencia (ver sección 2.5).
- Establecer y caracterizar al menos 3 sublíneas TetResponder diferentes derivados de peces diferentes fundador G0, ya inducibilidad podría diferir en líneas individuales. En particular, los niveles de expresión alcanzables y si el respondedor puede ser activado en todos los tipos celulares puede variar. Además, la susceptibilidad a silenciamiento diferirá entre las líneas. Por último, en algunos casos puede ser preferible seleccionar líneas que median sólo los niveles de expresión moderadas de la proteína de interés, en particular, si se espera que la expresión agujereada producido en combinación con una línea TetActivator en ausencia de doxiciclina para causar defectos de desarrollo o toxicidad.
NOTA: TetLíneas de respuesta en que se encuentran sólidamente inducible en los embriones pueden ser silenciados, ya sea parcial o totalmente en las larvas en etapa tardía o peces adultos. Por lo tanto, si las líneas están destinados a ser utilizados en peces adultos, varias líneas independientes deben caracterizarse por la inducibilidad en adultos. Si la inducción del gen de interés es compatible con un mayor desarrollo, se ha demostrado ser útil para crear embriones transgénicos dobles (TetActivator x TetResponder), para inducir la expresión GOI en embriones y para seleccionar y elevar sólo los individuos que muestran el más robusto y menos mosaico inducción. - Para mantener y propagar líneas TetResponder establecidos, el genotipo de peces adultos, como se describe en la sección 2.5).
- Efectuar la microinyección de TetResponder construir de acuerdo con procedimientos estándar 9.
- La doxiciclina tratamiento de embriones
- Preparar 2,000x doxiciclina (DOX) las existencias. Resolver DOX en 50% EtOH para conseguir una concentración de 50 mg / ml (97 mM). Tienda existencias DOX protegidos de la luz a -20 ° C.
- Se decanta la mayoría de medio E3 de embriones y reemplazarlo conMedio E3 embrión que contiene DOX a una concentración final de 25 mg / ml DOX (2,5 l de 2,000x DOX de stock por 50 ml E3). Dechorionation no es necesario.
- Embriones Volver a 28,5 ° C durante un mínimo de 6 horas antes de evaluar la expresión del gen etiquetado de interés por la aparición de YPet fluorescencia.
- Evaluar leakiness del TetResponder / combinación TetActivator tratando embriones con EtOH único disolvente.
NOTA: La hibridación in situ (ISH) o RT-PCR para detectar el ARNm TetResponder se puede utilizar como medidas más sensibles de la permeabilidad de la fluorescencia del gen etiquetado de interés. El grado de permeabilidad dependerá de la combinación línea TetActivator / TetResponder particular, y también puede variar entre los tejidos y etapas de desarrollo.
- Anestesia de adultos de pez cebra
- Preparar 10 cm de diámetro placa de Petri o pequeño vaso de precipitados lleno de agua del sistema de pescado que contiene 1 mg / ml tricaína (3-aminobenzoato de etilo methanesulfonate, MS-222).
- Traslado de pescado al recipiente que contiene anestésico y esperar hasta que se alcanza el nivel 4 de la anestesia según lo indicado por la pérdida completa de equilibrio (el pescado se encuentra en su lado), sin movimientos y sin respuesta a tocar 11.
- Transferir cuidadosamente los peces con unas pinzas o una cuchara en un portaobjetos de vidrio, tapa de una placa de Petri de plástico, o un plato de Petri de agarosa recubiertos y realizar la amputación de aletas o de imagen (ver sección 3.2).
- Peces Regreso a un recipiente que contiene un gran volumen de agua del sistema de pescado fresco y monitorearlo. Si los movimientos de enmalle no se reanudan a menos de 3 min, ayudar soplando agua sobre las branquias utilizando una pipeta de transferencia de plástico.
- Genotipado basado en la PCR de peces TetResponder
- Realizar la amputación parcial de la aleta de cola 12. Coloque el pescado en, tanques individuales numeradas (cajas de cría; ver tabla Materiales). Esto permite la recuperación de los peces transgénicos siguiente genotipado éxito.
- Tratejidos de aleta nsfer a pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de PCR pre-llenado con 20 l de agua libre de DNasa para el aislamiento de ADN genómico 13.
- Añadir 120 l 1 M NaOH a cada pocillo e incubar las muestras durante 20 min a 95 ° C utilizando un termociclador.
- Chill muestras a 4 ° C, añadir 14 l de 1 M Tris-HCl (pH 8,0) a cada pocillo, y las muestras de vórtice brevemente. Centrifugar las muestras durante 5 minutos a 16.000 xg para sedimentar los restos celulares. Almacenar ADN genómico a 4 ° C hasta que se necesite.
- Diseño cebadores para amplificar específicamente un fragmento del transgén TetResponder. Utilice 2 l de ADN aislado en una reacción de PCR estándar y analizar producto de PCR en un gel de agarosa.
La inducción específica de tejido 3. de expresión transgénica en la cola de pez cebra adulto Regeneradora Fin
- Establecimiento de TetActivator; TetResponder peces doble transgénico
- Mate portadores TetActivator con TetResponder carrires.
- Seleccionar embriones que portan el transgén TetActivator en una etapa de desarrollo en que los elementos reguladores que impulsan el casete TetActivator están activos. Embriones transgénicos pueden ser fácilmente identificados por la aparición de AmCyan de fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia estéreo.
NOTA: los peces transgénicos positivos TetActivator podrá elegir también identificaron durante la edad adulta por imágenes de peces anestesiado, por ejemplo. después de la amputación de la aleta caudal y la aparición de fluorescencia AmCyan en los regenerados. - Levante embriones seleccionados a la edad adulta.
- Identificar doble peces adultos transgénicos (peces que llevan el TetResponder además de la TetActivator) por el genotipado basado en PCR o (preferiblemente) por su capacidad para inducir la expresión de la TetResponder en el tejido de interés. Un protocolo para TetResponder inducción y de detección en la aleta de la cola de regeneración se describe en la sección 2.3 y la sección 4.
NOTA: Si la expresión TetResponder transitoria es compatiblecon un mayor desarrollo embrionario o larval, es útil para identificar embriones transgénicos dobles que llevan TetActivator y TetResponder transgenes después del tratamiento DOX durante el desarrollo embrionario como se describe anteriormente (sección 2.3, la Figura 1H). Embriones dobles positivas mostrarán AmCyan y YPet fluorescencia. Levante embriones positivos a la edad adulta.
- La amputación de aletas de cola de pez cebra y la inducción de la expresión del transgen en la aleta regeneración
- Realizar la amputación parcial de la aleta de la cola de pescado anestesiado (ver sección 2.4) 12. Tratar a los peces ya sea inmediatamente con DOX o devolverlos al sistema de vivienda de pescado.
- Preparar cuadro de cría (Figura 2A; ver tabla Materiales) lleno con 1 L de agua del sistema de pescado que contiene 25 mg / ml DOX (añadir 500 l de 2,000x 50 mg / ml a 1 L de agua del sistema de pescado).
NOTA: La inducción de la expresión del transgén inmediatamente después de la amputación permite comoeva- de los efectos sobre los primeros eventos durante la regeneración, mientras que la inducción a los 3 días después de la amputación (3 dpa) se debe utilizar para evaluar la expresión o la función del transgén durante el crecimiento regenerativo. - Traslado hasta el 10 previamente amputada, pescado doble transgénico a la caja de la cría y cerca de la caja con una tapa de tal manera que los peces no pueden escapar (Figura 2).
- Coloque las cajas de cría en la oscuridad para reducir el estrés. Por lo general, colocamos las cajas en una incubadora de aire 28.5 ° para asegurar la oscuridad y temperatura constante.
- Tratar de control doble peces transgénicos negativa con EtOH solamente (250 l por agua del sistema de pescado 1 l).
NOTA: transgénica individual o de tipo salvaje peces tratados con DOX pueden ser utilizados como control negativo adicional, aunque nunca hemos observado efectos adversos de las dosis utilizadas aquí DOX en la regeneración de la aleta. - Anestesiar el pescado tal como se describe en la sección 2.4 y el pescado transferencia utilizando pinzas o una cuchara en un petri agarosa recubiertos humedecida plato. Extendido con cuidado la aleta de la cola con unas pinzas.
- Peces de pantalla para aparición de YPet dentro de los regenerados mediante un fluorescente estereomicroscopio (Figura 2B).
NOTA: Por lo general, la fluorescencia TetResponder impulsado puede ser observada con firmeza después de 6 h de tratamiento DOX. Sin embargo, se recomienda para caracterizar la dinámica de expresión TetResponder para cada línea generada. - Peces volver al sistema de vivienda de pescado para terminar TetResponder inducción transgén o continuar tratamientos.
NOTA: Para los tratamientos> 24 h (tratamientos a largo plazo) es esencial para el intercambio de agua y limpiar a fondo las cajas de cría diaria. - Durante los tratamientos a largo plazo, los peces de alimentación cada 2-3 días mediante la transferencia de peces en un recipiente limpio con agua sistema de pescado fresco antes de devolverlos a las cajas de cría después de la alimentación.
4. Caracterización de TetResponder Expresión en Fin Regenera
t "> NOTA:. Por lo general, verificamos la expresión génica específica de tejido en la aleta caudal regenerar utilizando imágenes fluorescentes de cryosections en 3 dpa En este punto el tiempo los diferentes compartimentos de tejido de un regenerado han formado y pueden ser claramente identificados en secciones de tejido, y cryosectioning es más sencillo que en etapas posteriores de la regeneración. Figura 2C representa los dominios de tejidos que se pueden distinguir en los regenerados y enumera unos marcadores moleculares para estos dominios. El siguiente protocolo describe la preparación de criosecciones longitudinales o transversales para obtener imágenes directas o inmunotinción .- Cryosectioning de aletas de la cola adultos
- Tratar de pescado cuya aletas de la cola fueron amputadas desde 2 hasta 3 dpa dpa con DOX como se describe en la sección 3.2
- Anestesiar el pescado tal como se describe en la sección 2.4
- Utilice una cuchara o pinzas para transferir suavemente el pescado sobre una tapa de una placa Petri de plástico.
- Vuelva a amputarle los regenerados aleta aproximadamente a 4-5 segmento óseos proximal al plano inicial amputación utilizando un bisturí y devolver el pez al agua sistema de pescado fresco.
- Transferencia con cuidado regenera a una pequeña placa de Petri (por ejemplo, 35 mm) que contiene 4% (w / v) paraformaldehído (PFA) en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS; ver tabla Materiales) con unas pinzas finas. No toque los regenerados, pero sólo la parte del tocón del tejido.
- Coloque el tejido plano en la parte inferior placa de Petri y fijar O / N a 4 ° C.
- Wash regenera dos veces en 1X PBS que contenía 0,1% de Tween (PBT) para eliminar PFA e incubar regenera o / n a 4 ° C en 0,5 M EDTA-PBS (pH 7,5) para descalcificar matriz ósea.
- Incubar regenera a RT en 10% de sacarosa-PBS, 20% de sacarosa-PBS, 30% de sacarosa-PBS y 30% de sacarosa-PBS: medio de congelación de tejido en una relación 1: 1 (TFM; ver tabla Materiales) durante 30 min cada uno. Posteriormente, incubar aletas a 4 ° C durante> 2 horas en el tejido medio de congelación.
- Coloque criomoldes en un portaobjetos de microscopio y llenar elm con medio de congelación de tejido. Evitar la introducción de burbujas de aire.
- Transferencia regenera en criomoldes y tejido orientar adecuadamente para obtener secciones longitudinales o transversales del regenera aleta (Figura 2D). Asegúrese de que regenerado es recta, lo que facilita el corte.
- Transferencia criomoldes junto con portaobjetos de microscopio sobre una rejilla de metal colocada sobre un lecho de hielo seco para iniciar el proceso de congelación (Figura 2D).
- Una vez que el medio de congelación de tejido se ha convertido en sólido, en lugar criomolde banco y dejar reposar a temperatura ambiente durante unos pocos minutos de tal manera que el tejido se descongela medio de congelación en la interfaz de plástico-medio.
- Utilice un bolígrafo o similar para empujar el bloque congelado fuera de la criomolde. Cryoblocks tiendas en una caja a -80 ° C hasta seccionar los tejidos.
- Preparar 10-14 micras de espesor cryosections utilizando un Cryo-microtomo y recoger secciones sobre portaobjetos de adhesión (véase el cuadro Materiales). Diapositivas almacenar a -20 ° C hasta neEDED.
- Caracterización de la expresión TetResponder en secciones de aletas basados en fluorescencia YPet
- Tratar secciones de aleta durante 30 minutos con 100% de MeOH enfriado a -20 ° C para mejorar la adherencia a la portaobjetos de microscopio seguido de dos lavados a RT en PBT y 1 lavado en PBS, 5 min cada uno.
- Visualizar los núcleos por secciones incubando durante 10 min en 4 ', 6- diamidino-2-phenylinodole (DAPI) en PBS (1: 5000) seguido de dos lavados de 10 min cada uno en PBS.
- Secciones de montaje en 75% de glicerol-PBS o monturas Antifade disponibles en el mercado, y cubrir con una tapa deslizante.
- Imagen YPet y fluorescencia AmCyan bajo un confocal o de campo amplio microscopio de fluorescencia (Figura 1E).
NOTA: Para facilitar la identificación inequívoca de tipos de células que expresan YPet, inmunofluorescencia o inmunohistoquímica con anticuerpos contra antígenos específicos de tipo celular junto con anticuerpos anti-GFP (que reaccionan con YPet, pero no AmCyan) se puede realizar. Alternativamente, para facilitar la detección de la expresión débil YPet, ARN hibridación in situ contra YPet ARN se puede realizar ya sea en todo el montaje aletas o secciones de parafina de aletas.
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Representative Results
Establecer un sistema de Teton funcional para la expresión génica inducible específico de tejido, TetActivator transgénicos y líneas TetResponder necesitar ser generado (Figura 1A). Esto se logra mediante la microinyección de TetActivator (Figura 1B - C) o TetResponder (Figura 1E) constructos en embriones de pez cebra temprana y posterior integración de la línea germinal. Construcciones TetActivator funcionales pueden ser generados ya sea por clonación de secuencias reguladoras cortos (elementos potenciadores) aguas arriba de la casete de TetActivator (Figura 1B), o por recombinación de la casete TetActivator en un BAC que contiene elementos reguladores del gen de interés (Figura 1C). La integración de la línea germinal del constructo TetActivator puede ser evaluada por cruzamiento individuo inyecta pescado G0 y la apariencia de AmCyan fluorescencia en embriones F1 en el patrón de expresión esperado (Figura 1D). Integ línea germinalración y la funcionalidad del transgén TetResponder pueden ser evaluados por el cruce de G0 peces individuales inyectado para los peces TetActivator establecido (aquí ubiquitina: TETA AmCyan), seguido de tratamiento con DOX y la apariencia de YFP / YPet de fluorescencia (Figura 1F). Se debe preferir pescado mostrando fuerte y homogénea expresión YFP / YPet para establecer una línea TetResponder estable (Figura 1G). Tener TetActivator estable establecido y líneas de pescado TetResponder, combinaciones específicas TetActivator / TetResponder puede ser generado por el cruce. Los portadores de TetActiator y TetResponder transgenes pueden ser identificados durante la embriogénesis después de finalizado el tratamiento DOX surgimiento de YFP / Ypet en la etapa de desarrollo del TetActivator está activo (Figura 1H). Alternativamente, los peces transgénicos dobles pueden ser identificados después del tratamiento DOX y TetResponder inducción transgén en la aleta caudal regeneración (Figura 2 A - B).
< p class = "jove_content"> Utilizamos rutinariamente este sistema para lograr inducible, la expresión de genes específicos de tejido en la regeneración de aleta de la cola de pez cebra. Verificamos los tejidos específicos de expresión del transgen TetResponder por imágenes de fluorescencia de cryosections de 3 dpa regenera aletas, ya que los diferentes compartimentos de tejido de un regenerado pueden identificarse claramente en secciones de tejido en este punto de tiempo (Figura 2C). Aleta longitudinal o transversal regenerar secciones se obtienen por cryosectioning después de crioprotector tejido y la incrustación de aleta regenerar adecuadamente (Figura 2D). Después de seccionamiento, la expresión del transgen TetResponder (Ypet / YFP fluorescencia) se pueden obtener imágenes mediante fluorescencia o microscopía confocal (Figura 2E). Tenga en cuenta que la TetActivator promotor impulsado her4.3 induce la expresión TetResponder en el blastema proximal medial, mientras que el blastema distal (punta de flecha) y la epidermis (flecha) están desprovistos de expresión. ove_content ">
Figura 1: Generación de líneas TetActivator y TetResponder transgénicos. (A) de dibujos animados que muestra la estrategia para la expresión génica inducible específico de tejido utilizando el sistema de Teton. (B) Transgénicos TetActivator construir (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no. 1247). Un polienlazador 5 'del TetActivator irtTAM2 (3F) facilita cLoning de secuencias reguladoras de interés. La secuencia codificante de AmCyan se separa de la TetActivator través de un péptido p2a 'auto-escisión'. El cassette también contiene una señal de poliadenilación de SV40, está flanqueada por Tol2 transposón invertida repite y contiene un único sitio de reconocimiento de meganucleasa I-SCE. (C) casete TetActivator para recombinería BAC (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no. 1180). El casete incluye el gen de la kanamicina para la selección, que es impulsado por un promotor procariota gb3. Sitios FRT que flanquean el gen de resistencia a kanamicina permiten su eliminación mediada Flp recombinasa siguiente integración exitosa en la CAPV. (D) Identificación de G0 fundador peces transmitir la her4.3: Teta AmCyan construir a través de su línea germinal. Carriers se identifican a través de aparición de fluorescencia AmCyan en algunos embriones F1 (puntas de flecha). (E) Transgénicos TetResponder construir (Weidinger base de datos plásmido laboratorio no. 1444).Esto construye consta de un polienlazador y YPet CDS bajo el control de los elementos de respuesta Tet optimizados (Tetre estanco, Clontech) y terminado por la señal de poliadenilación de SV40. Está flanqueada por Tol2 transposón invertida repite y contiene un único sitio de reconocimiento de meganucleasa I-SCE. (F) La identificación de G0 peces fundador transmitir un funcional TetResponder Tetre: Axin1-YFP construir a través de su línea germinal. Los transportistas se identifican mediante el cruce con una línea establecida TetActivator (aquí ubiquitina: Teta AmCyan) y la inducción de YFP fluorescencia después del tratamiento DOX durante 6 horas (puntas de flecha). (G) Cierre de ofembryos mostrados en (F) después de un total de 12 horas de tratamiento DOX. Nota inducción bastante ubicua de YFP fluorescencia. (H) La identificación de embriones transgénicos dobles que llevan TetActivator (her4.3: Teta AmCyan) y TetResponder (Tetre: Axin1-YFP) transgenes (puntas de flecha). Los embriones nosotrosestás tratados con DOX durante 6 horas. (A - H) Barra de escala: 500 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: El uso del sistema téton para la expresión génica específica de tejido en la regeneración de aleta de cola de pez cebra. (A) cajas de cría utilizados para el tratamiento DOX de adultos de pez cebra. (B) La inducción de Tetre: Axin1-YFP TetResponder transgén por el her4.3: Teta AmCyan TetActivatoren la aleta caudal regeneración tras 12 horas de tratamiento DOX. Nótese la ausencia de YFP fluorescencia en los peces de control tratados con EtOH. (C) la historieta que representa algunos de los compartimentos de tejido que se encuentra dentro de un regenerado aleta en 3 dpa en una vista en sección longitudinal. (D) Preparación de muestras para cryosectioning. Regenera Fin se colocan en un medio de congelación de tejido (TFM), repleto criomoldes, orientados adecuadamente para obtener secciones ya sea longitudinal o transversal de los regenerados, y se transfieren a un estante de metal se sienta encima de hielo seco hasta TFM ha solidificado. Plano de sección se indica en rojo. Abreviaturas: dist .: distal, prox .: proximales, ventilación .: ventral, Dors .: dorsal. (E) Confocal imagen de YFP fluorescencia en una sección longitudinal de un regenerado ray aleta derivado de aletas mostradas en (B). Tenga en cuenta que la her4.3: Línea Teta AmCyan TetActivator impulsa YFP inducción específicamente en el blastema proximal medial. YFPfluorescencia no se detecta en una variedad de compartimientos, incluyendo la epidermis herida (flecha), y el más distal de dominio del mesénquima (punta de flecha) (BC) Barra de escala: 500 micras; (E) Barra de escala:. 100 m Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Línea TetActivator | Referencia | Los elementos reguladores utilizados | Principalmente expresado en |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Wehner y Weidinger, inédito | 7xTCF-Xla.Siam Wnt reportero 1 | Wnt-tejidos sensibles |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a-mCherry | Haase y Weidinger, inédito | myl7 (cmlc2) 2 | cardiomiocitos maduros |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | sistema nervioso central |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermis, en la aleta de adultos con exclusión de la capa basal |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermis, en la aleta adulto exclusivamente en la capa basal |
| sp7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | sp7 / OSX 7 | (Comprometido) osteoblastos |
| ubiquitina: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | ubiquitina 8 | (Bastante) ubicua |
Tabla 1:. TetActivator líneas transgénicas disponibles Esta tabla muestra TetActiva transgénicolíneas tor para la expresión específica de tejido de la TetActivator tanto en peces embrionarias y adultas, que están disponibles desde el laboratorio Weidinger bajo petición.
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Discussion
El pez cebra adulto tiene una asombrosa capacidad para regenerar con éxito a muchos órganos y apéndices internos. Un conocimiento profundo de los mecanismos moleculares y celulares implicados requiere un análisis específico de tejido de las funciones de genes y vías de señalización. Hacia esto, el sistema de Teton ofrece una herramienta eficaz para la expresión génica espaciotemporalmente controlada en el pez cebra embrionarias y adultas. Las construcciones del sistema de Teton y la metodología descritos en este manuscrito se han utilizado con éxito en un estudio reciente de nuestro laboratorio 3. Las siguientes cuestiones adicionales deben ser considerados cuando se establece el sistema de Teton:
TetActivator consideraciones de diseño transgén
Hemos demostrado previamente que un TetActivator de un solo inducible que consiste en la variante mutante M2 del dominio inverso represor Tet fusionado con el virus Herpes simplex VP16 transactivación-dominio derivado 3F [irtTAM2 (3F), in corto TETA-M2] confiere inducción eficiente, pero puede mostrar bajo, aunque leakiness medible, es decir fondo inducir la actividad en ausencia de doxiciclina (DOX) 5. Por lo tanto, hemos descrito dualmente sistemas inducibles utilizando fusiones con un receptor de glucocorticoides (TETA-GBD) o un dominio del receptor de ecdisona (EcR-TETA), que eliminan leakiness 5. Por lo tanto, si el sistema se utiliza para expresar proteínas tóxicas o muy potentes (por ejemplo, oncogenes) el uso de una variante doblemente inducible debe ser considerado. Alternativamente, durante el establecimiento de TetActivator y TetResponder líneas de una gama de líneas de producción diferentes niveles de expresión se puede seleccionar y inductores más débiles elegidos en caso de falta de estanqueidad es un problema con las líneas que inducen fuertemente. Construcciones TetActivator que contienen la variante Teta-GBD o Teta-EcR están disponibles en el laboratorio Weidinger bajo petición.
Métodos de transgénesis para la generación de líneas transgénicas de pez cebra
Análisis de la expresión del transgen TetResponder
Para detectar la expresión del transgen TetResponder específica de tejido en aletas adultos solemos utilizar imágenes fluorescentes de cryosections. En nuestra experiencia, la fluorescencia de las proteínas fluorescentes expresadas por el transgén se conserva en todo el FIXATIOn y cryosectioning procedimiento y por lo tanto se pueden obtener imágenes directamente. Los métodos adicionales para la detección de la expresión TetResponder, que se han descrito en otra parte, son: i) la inmunotinción de las secciones, preferiblemente en contra de la etiqueta de la proteína fluorescente, aquí YPet, utilizando un anticuerpo anti-GFP, ii) fluorescente o cromogénico ISH en secciones, o iii ) todo el montaje ISH seguido por el corte.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores agradecen a Christa Haase, Doris Weber y Brigitte Korte para la asistencia técnica. El trabajo en el laboratorio Weidinger el apoyo de subvenciones de la Deutsche Forschungsgemeinschaft WE 4223 / 3-1, WE 4223 / 4-1 y por la Deutsche Gesellschaft für Kardiologie través de un Oskar-Lapp-Stipendium y Klaus-Georg-und-Sigrid- Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
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