Introduction
Zebra balığı geliştirme, fizyoloji, hastalık ve yenilenme birçok yönlerini incelemek için iyi kurulmuş bir omurgalı model organizmadır. Gen ekspresyonu ya da sinyalleme yollarının indüklenebilir, dokuya özgü manipülasyon için post-embriyonik biyolojik süreçler, deney aletleri için bir model olarak zebrabalıkları artan kabulü ile giderek daha önemli hale gelmektedir. Özellikle yetişkin Zebra balığı organ ve apendiks rejenerasyon içine çalışmalar bu rejeneratif sürecinde sinyal yolları uzay-zamansal gereksinimleri diseksiyon için bir araç eksikliğinden muzdarip.
Şu anda, üç farklı sistem koşullu, dokuya özgü, yetişkin zebrabalıkları organlarını rejenere içinde gen ekspresyonunu elde etmek için kullanılmıştır: Cre-lox sistemi, transpozon-aracılı somatik transgenesis kullanılarak ısı-şoku uyarılabilir transgenlerin mozaik ifadesi ve teton sistemi 1 -3. Teton bir tetrasiklin-CONT bir türevi anlamına gelirsentezleme antibiyotik tetrasiklin veya bunun bir türevini, örneğin doksisiklin mevcudiyetinde aktive haddelenmiş transkripsiyonel aktivasyon sistemi. Şimdiye kadar yetişkin balıklarda kullanıldıktan Cre-lox sistemi, ekspresyonu uzamsal dokuya özel düzenleyici elementler tarafından kısıtlanan bir Tamoksifen kontrollü Cre rekombinazın (CreERT2) dayanır. DUR kasetinin Cre güdümlü çıkarılması tüm hücre tipleri 1 aktif olması gereken bir promoter tarafından tahrik edilen ilgili gen ekspresyonunu kolaylaştırır. Mosaically ifade somatik transgenlerin transpozon aracılı oluşturma tek tek hücre soyları indüklenebilir transgen ifadesi için bir sistem sağlamaktadır. Tipik olarak sadece bir yenileyici organın 2 ayrı hücre soyları içinde transgeni taşıyan kimerik bireyde bir ısı şoku promotör sonuçları transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni taşıyan bir Tol2 transpozonu sahip zebra balığı embriyoların enjeksiyonu. Her iki sistem şartlı doku SPE için izin ikenreli gen ifadesi, Cre-lox sistemi geri dönüşümlü değildir ve transpozon tabanlı klonal etiketleme kullanarak stratejisi stokastik doğası muzdarip. Böylece, ve diğerleri en son zamansal ve ilave ayarlanabilir ve geri 3-5 olan uzamsal olarak kontrollü gen ekspresyonu kolaylaştırmak zebrabalıkları kullanım için transgenik teton sistemleri, adapte edilmiştir.
Burada kullanılan teton sistemi Doksisiklin (DOX) -inducible transkripsiyonel aktivatör (ters tetrasiklin transaktivatör, irtTA kısa Tet geliştirilmiş) dokuya-özgü genom düzenleyici dizilerin kontrolü altında olduğu bir transgenik sürücü hattı (TetActivator) içerir. (; TetRE Tet yanıt elemanı) (Şekil 1A) İkinci olarak, bir transgenik cevap hattı tetrasiklin operatör transkripsiyonel kontrolü altında ilgi konusu bir geni barındıran (TetResponder) gerektirir. Bu nedenle, TetActivator ve TetResponder hatları özel kombinasyonlarının kullanımı koşullu doku speci sağlargen ifadesinin fic manipülasyon.
Biz son zamanlarda Zebra balığı kuyruk yüzgeci 3 yenileyici yetişkin Wnt / beta-katenin sinyalizasyon doku-spesifik fonksiyonlar için prob teton sistemini kullanmışlardır. Burada özetlenen protokolde yüzgeç yenilenme çalışmaları için özellikle zebrafish Teton sisteminin set-up ve kullanım için bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu detaylı istikrarlı transgenik TetActivator ve TetResponder hatlarını oluşturmak için nasıl talimatlar ve embriyo ve yetişkin zebrabalıkları transgen indüksiyon için bir protokol içerir. Ayrıca, yetişkin zebrabalıkları kanatların cryosections hazırlanması için bir protokol içeren kanatçık yenilenme bölgesindeki dokuya özel gen ekspresyonunun doğrulanması için teknikler tarif eder. Ayrıca, TetResponder ifade TetActivator transgen tasarımı, bir transgenesis yönteminin seçimi ve tespiti için tartışılacaktır. Bu nedenle, bu protokolün genel amacı, bir plan olarak hizmet etmektirkurulma fonksiyonel teton sistemi zebrabalıkları daki herhangi bir dokuya uygulanabilir koşullu dokuya-özgü gen ekspresyonunu elde etmek için.
Biz I-SceI veya kısa genomik düzenleyici diziler kullanılarak stabil TetActivator hatlarının Tol2 aracılı üretimi için izin veren bir TetActivator vektör oluşturduk (güçlendirici fragmanları; Weidinger laboratuar plazmid veritabanı henüz 1247;. Şekil 1B). Bu yapı, Herpes simpleks virüsü VP16 transaktivasyon alanı türev 3F [irtTAM2 (3F)] ile kaynaşmış ters Tet bastırıcı etki M2 mutant varyantı aşağıdakilerden oluşan bir TetActivator kaseti içerir. Bu ko-eksprese aynı açık okuma çerçevesi arasında fluorofor AmCyan sahip olduğu TetActivator (TETA) sentezlenmesi, kolayca izlenebilir; 1 oranında 5,6: a P2A peptit 1 ayrı proteinler olarak teta ve AmCyan üretimi ile sonuçlanmalıdır ribozomal atlama, aracılık eder. Bu yapı, T ', bir poylinker 5 içeriretActivator kaseti, klasik klonlama yöntemleri kullanılarak ilgili genomik düzenleyici diziler sokulmasını kolaylaştırmak için.
(Büyük bir genomik bölgeyi ihtiva eden bir bakteriyel yapay kromozom içine yeniden birleştirilebilir, (BAC), Buna ek olarak, yukarıda tarif edilen TetActivator kaset ve bir kanamisin seçme kaseti (Şekil 1C. Weidinger laboratuar plazmid veri tabanında bir 1180) 'den oluşan bir yapı oluşturduk Genellikle ekspresyon paterni olan transgen tarafından taklit edilecek) bir genin başlangıç kodonunun halinde. Her iki yapılar istek üzerine Weidinger laboratuarında temin edebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Transgenik TetActivator Balık Hatları 1. Nesil
- TetActivator yapısının oluşturulması
- Vektör # da TetActivator kasetinin faiz membaında Clone düzenleyici dizileri 1247 standart teknikler kullanılarak. Seçenek olarak ise, TetActivator kaseti (vektör # 1180), hedef genin, birinci ekson sokulduğu bir BAC, oluşturmak için rekombinasyon teknikleri kullanmak ve Tol2 tekrarlar bkz detaylı Recombineering protokolü (BAC omurgasına sokulur ters burada 7,8).
- Toksin serbest plazmid DNA veya ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak BAC DNA preparatları.
- Transgenik TetActivator balık hatlarının üretimi
- Standart prosedürlere 9'a göre TetActivator yapısının mikroenjeksiyon gerçekleştirin.
- Tol2 tra için kapaklı sens RNA kodlama ile birlikte tek bir hücre aşamasında embriyoların içine 250 ug BAC DNA 25-50 plazmid DNA PG ya da enjektetranspozon aracılı transgenesis için, ya da I-SceI aracılı transgenesis için I-SceI proteininin ile nsposase.
NOT: transgenesis yönteminin seçiminde Hususlar tartışma bölümünde bulunabilir.
NOT: DNA sitoplazma içine teslim edildiğinde transgenesis verimliliği düşürebilir çünkü, sitoplazma değil sarısı içine tercihen enjekte edilir.
- Tol2 tra için kapaklı sens RNA kodlama ile birlikte tek bir hücre aşamasında embriyoların içine 250 ug BAC DNA 25-50 plazmid DNA PG ya da enjektetranspozon aracılı transgenesis için, ya da I-SceI aracılı transgenesis için I-SceI proteininin ile nsposase.
- Yetişkinliğe enjekte G0 embriyolar kaldırın. İsteğe bağlı olarak, ekran G0 AmCyan floresan embriyo ve tercihen istenen sentezleme modelini gösteren embriyolar büyür. Bu Tol2 aracılı transgenesis özellikle de tohum-hattı geçişini hızını artırabilir.
- (Örneğin, Şekil 1D 'de gösterilmiştir), flöresanlı bir stereomikroskop kullanılarak F1 embriyolar veya larva Tahmini ifade düzenine yabani tip balık ve AmCyan, fluoresans görünme bireysel G0 balık döllenmedir başarılı germ-line entegrasyonu değerlendirin.
- Floresan pozitif kaldırınF1 embriyolar yetişkinliğe ve istikrarlı F2 transgenik balık elde etmek için vahşi tip balık onları çiftleşmek için.
- Bireysel hat ekspresyon düzeyleri, ifade deseninde, TetResponder hatları, leakiness neden yeteneği, ve susturmak için onların duyarlılıkta farklılık beri kaldırın ve farklı G0 kurucu balık türetilen en az 3 farklı alt hatları karakterize.
NOT: sağlam embriyolar ifade Birçok transgenler kısmen ya da tamamen geç evre larvaları veya yetişkin balık susturuldu vardır. Çizgiler erişkin balık kullanılmak içindir Dolayısıyla, eğer yetişkinlik döneminde onların TetActivator ifade ve işlevi için birçok bağımsız çizgiler karakterize.
NOT: Tablo 1'de her iki embriyo ve yetişkin balık, içinde TetActivator doku spesifik ifade TetActivator hatları bir panel yarattı Bu satırlar istek üzerine Weidinger laboratuarından temin edebilirsiniz..
- Standart prosedürlere 9'a göre TetActivator yapısının mikroenjeksiyon gerçekleştirin.
Transjenik T 2. ÜretimetResponder Balık Hatları
NOT: istek üzerine Weidinger laboratuarında edinilebilir I-SceI veya stabil TetResponder hatlarının Tol2 aracılı nesil için izin veren bir TetResponder yapısını (. Şekil 1E Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı no 1444) yarattı. Bu yapı, ilgi konusu bir gen ve YFP türevi YPet kodlama dizisinin kodlama dizilerinin (CDS) sokulmasını kolaylaştıran bir poli-bağlayıcı bölge ve ardından, bir tetrasiklin işlemcisi ihtiva etmektedir. Böylece, yapı, YPet ile ilgili proteinin bir C-terminal füzyon Tet aracılı ifadesi için tasarlanmıştır. Etiketli bir füzyon proteinin ekspresyonu, kaçınılması gereken ise bir P2A ya T2a peptit ayrı polipeptidlerin 6,10 gibi ilgi ve YPet proteinin ko-ifadesini kolaylaştıran İlgi CDS gen ile birlikte dahil edilebilir.
- TetResponder yapısının oluşturulması
- Tetrasiklin operatörünün 'ilgi 3 genin Klon CDSve 5 YPet CDS ', standart yöntemlere uygun olarak. Durdurma kodonu faiz CDS geninden çıkarıldığından emin olun.
- Ticari olarak temin edilebilen kitler kullanılarak toksin serbest plazmid DNA preparatları.
- Transgenik TetResponder balık hatlarının üretimi
- TetResponder mikroenjeksiyonu, standart prosedürlere 9'a göre inşa gerçekleştirin.
- Transpozon aracılı transgenesis ya meganuclease destekli transgenesis için I-SceI enzimi ile tol2 transpozazın için kapaklı sens RNA kodlama ile birlikte tek bir hücre aşamasında embriyoların sitoplazmasına plazmid DNA'nın 25-50 pg enjekte edilir.
NOT: transgenesis yönteminin seçiminde Hususlar tartışma bölümünde bulunabilir.
NOT: DNA sitoplazma içine teslim edildiğinde transgenesis verimliliği düşürebilir çünkü, sitoplazma değil sarısı içine tercihen enjekte edilir.
- Transpozon aracılı transgenesis ya meganuclease destekli transgenesis için I-SceI enzimi ile tol2 transpozazın için kapaklı sens RNA kodlama ile birlikte tek bir hücre aşamasında embriyoların sitoplazmasına plazmid DNA'nın 25-50 pg enjekte edilir.
- Bir enjekte G0 embriyoların kaldırındulthood.
- F1 embriyolar veya F1 larvalarının Doksisiklin tedavisi ardından daha önce kurulmuş TetActivator hattı ile bireysel G0 balık çiftleşme yoluyla transgen başarılı germ-line entegrasyon ve indüklenebilirliğini değerlendirin.
NOT: Genellikle bir ubikitin promotör odaklı TetActivator satırını kullanın (ubikuitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2, kısa ubikuitin: Tet AmCyan 3) Bu hat embriyo ve yetişkin oldukça her yerde ifadesini sürücüler gibi, fonksiyonel TetResponder taşıyıcılar için ekrana Bu şekilde balık ve de ilgi tüm dokularda TetResponder indüklenebilirliğine değerlendirmek için uygundur. Bu hat, istek üzerine Weidinger laboratuarında edinilebilir. - E3 embriyo ortamı içeren ayrı bir 10 cm Petri kabındaki her kavrama embriyolar toplayın (Malzeme tabloya bakınız) ve 28.5 ° C'de yemekleri inkübe.
- Bireysel numaralı tanklara embriyolar verdi Yeri G0 balık (üreme kutuları, Malzeme tabloya bakınız) embriyolar ekranı olmuştur kadared. Bu transgen germline iletimini göstermektedir G0 balık geri kazanımını sağlar.
- Embriyoların sadece yarısı TetActivator transgen (durumda heterozigot TetActivator taşıyıcı TetResponder kurucu balık geçti edildi) taşıması bekleniyor, uygun gelişim aşamasında AmCyan floresan görünümünü tarafından TetActivator transgenini içeren embriyolar için seçin.
- Bölüm 2.3 de açıklandığı gibi Doksisiklin (DOK) ile embriyolar muamele edilmesiyle TetActivator transkripsiyonel aktivitesini neden olur.
- YPet floresan ortaya çıkması için ekran F1 embriyolar. Bu kavrama embriyolar beklenen anlatım etki ve bireysel embriyolar arasında küçük değişim içinde küçük mozaisizim göstermesi gerekir ise, homojen YPet ifadesini üreten satırları (G0 balık) tercih edin. Örnek örnekler için Şekil 1F ve Şekil 1G 'de ok ucu bakınız.
- Tanımlanan bir uyarılabilir TetResponder transgeni iletilmesi Mate G0 balıkvahşi tip balık 2.2.8 adıma ve yetişkinliğe tüm F1 embriyolar yükseltmek.
- Yetişkin F1 transgenik balık ya PCR tabanlı genotipleme tarafından belirlenmesi (bkz veya F2 embriyolar ve YPet floresan (bakınız bölüm 2.5) ortaya çıkması DOX tedavisi ardından TetActivator hattına bireysel F1 balık geçerek.
- Endüklenebilirlik bireysel hatlarda farklı olabilir, çünkü oluşturulması ve farklı G0 kurucu balık türetilen en az 3 farklı TetResponder alt hatları karakterize. Özellikle elde sentezleme seviyeleri ve olup cevap değişebilir tüm hücre tiplerinde aktif hale getirilebilir. Buna ek olarak, susturulması için duyarlılık hatları arasında farklılık gösterecektir. Son olarak, bazı durumlarda, doksisiklin yokluğunda bir TetActivator hattı ile kombinasyon halinde imal sızıntılı sentezleme gelişim bozuklukları ya toksisiteye neden olduğu beklenen ise, özellikle ilgi konusu proteinin sadece orta ekspresyon seviyelerini aracılık hatları seçilmesi tercih olabilir.
NOT: TetEmbriyolarda sağlam uyarılabilir olan Cevapçi hatları kısmen veya tamamen geç evre larvaları veya yetişkin balık susturuldu olabilir. Çizgiler yetişkin balıklarda kullanılması içindir Dolayısıyla, eğer birçok bağımsız çizgiler yetişkinlerde uyarılabilirliği için karakterize edilmelidir. Ilgilenilen genin indüksiyonu daha da geliştirilmesi ile uyumlu ise, embriyolar GOI ifadesini uyarmak için seçin ve en sağlam ve en az mozaik gösteren sadece bireyler yetiştirmek için, çift transgenik embriyolar (TetActivator x TetResponder) oluşturmak için yararlı olduğu kanıtlanmıştır indüksiyon. - ) Korumak ve bölüm 2.5 de açıklandığı gibi kurulmuş TetResponder hatları, genotip yetişkin balık yaymak için.
- TetResponder mikroenjeksiyonu, standart prosedürlere 9'a göre inşa gerçekleştirin.
- Embriyoların doksisiklin tedavisi
- 2,000x Doksisiklin (DOK) stokları hazırlayın. 50 mg / ml (97 mM) bir konsantrasyon elde etmek için% 50 EtOH içinde DOX çözün. Mağaza DOX stokları -20 ° C'de ışıktan korunmuş olarak.
- Embriyolardan E3 orta çoğunluğu boşaltacaktır ve yerine25 | ig / ml DOX bir son konsantrasyonda DOX ihtiva eden E3 embriyo ortamı (50 mi E3 başına 2,000x DOX stokunun 2.5 ul). Dechorionation gerekli değildir.
- YPet floresans görünümüne göre ilgi işaretli genin ifadesi değerlendirmeden önce 6 saat en az 28.5 ° C embriyolar dönün.
- Sadece EtOH çözücü madde ile muamele etmek suretiyle embriyolar TetActivator / TetResponder kombinasyonunun leakiness değerlendirmek.
Not: TetResponder mRNA tespit etmek için in situ hibridizasyon (ISH) ya da RT-PCR, ilgi konusu işaretli genin floresandan daha sızdırma daha hassas ölçümleri olarak kullanılabilir. sızdırma ölçüde, özellikle TetActivator / TetResponder hattı kombinasyonuna bağlı olacaktır ve doku ve gelişim aşamaları arasında da değişebilir.
- Yetişkin zebrafish Anestezi
- 10 cm çapında bir Petri kabı ya içeren balık sistemi su, 1 mg / ml Tricaine (Etil 3-aminobenzoat metansülfbnil ile doldurulmuş küçük bir beher hazırlayınlfonate, MS-222).
- Konteyner içeren anestezi balık aktarın ve tam denge kaybı (balık yan yatıyor), hiçbir hareketler ve 11 dokunmadan hiçbir yanıt belirtildiği gibi anestezi seviyesini 4 ulaşana kadar bekleyin.
- Dikkatle cımbız veya cam slayt üzerine bir kaşık, plastik petri kapağını veya agaroz kaplı petri kullanarak balık transferi ve yüzgeç amputasyon veya görüntüleme gerçekleştirmek (bakınız bölüm 3.2).
- Taze balık sistem büyük bir su hacmi içeren bir kap balık dönün ve onu izleriz. Solungaç hareketleri 3 dakika içinde devam etmezseniz, plastik bir transfer pipeti kullanarak solungaçları üzerinde su püskürterek yardımcı olur.
- TetResponder balık PCR bazlı genotipleme
- 12 fin kuyruk kısmi amputasyonu gerçekleştirin. Bireysel, numaralandırılmış tankların içine balık yerleştirin (üreme kutuları, Malzeme tabloya bakınız). Bu başarılı genotiplemeye aşağıdaki transgenik balık kurtarma sağlar.
- TraBir 96-yuvalı PCR levhası genomik DNA 13 izolasyonu için 20 ul DNase içermeyen su ile önceden doldurulmuş tek tek oyuklara nsfer fin dokular.
- Her 120 ul 1 M NaOH de ekleyin ve bir PCR kullanılarak 95 ° C'de 20 dakika boyunca numune inkübe edin.
- 4 ° C Chill örnekleri, her bir göze, 1 M Tris-HCI (pH 8.0) 14 ul ve kısaca vorteks örnekleri. 16.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüje örnek hücre yıkıntıları pelet haline getirildi. Gerekli olana kadar, 4 ° C 'de genomik DNA saklayın.
- Tasarım primerler özel TetResponder transgenin bir fragmanını amplifiye etmek için. Standart bir PCR reaksiyonunda izole edilen DNA, 2 ul kullanımı ve bir agaroz jeli üzerinde PCR ürünü analiz eder.
Yetişkin Yenileyici balığı kuyruk transgen ekspresyonunun 3. Dokuya özel indüksiyon
- TetActivator kurulması; Çift transgenik balık TetResponder
- TetResponder Carri ile TetActivator taşıyıcıları Mateers.
- TetActivator kaseti tahrik düzenleyici elementler, aktif olduğu bir gelişme aşamasında TetActivator transgeni taşıyan seç embriyolar. Transgenik embriyolar kolay stereo floresan mikroskop kullanılarak AmCyan floresans görünüşü ile tespit edilebilir.
NOT: TetActivator transgen pozitif balık alternatif örneğin anestezi balık görüntüleme ile yetişkinlik sırasında tespit edilebilir. kuyruk yüzgecinin ampütasyon ve Yenilenme içinde AmCyan floresan çıkması takip. - Yetişkinliğe seçilen embriyolar kaldırın.
- Ilgi doku TetResponder ekspresyonunu indükleme kabiliyetleri (tercihen), PCR-tabanlı genotipleme ya göre (TetActivator ilave olarak TetResponder taşıyan balık) iki transjenik erişkin balık belirlenmesi. Yenileyici kuyruk yüzgecinin içinde TetResponder indüksiyon ve tespiti için bir protokol bölüm 2.3 ve 4. bölümde açıklanmıştır.
NOT: geçici TetResponder sentezleme uyumlu iseDaha fazla embriyonik veya larva gelişimi ile, yukarıda açıklandığı gibi embriyonik gelişim sırasında DOX tedavisi sonrasında TetActivator ve TetResponder transgenlerin taşıyan çift transgenik embriyolar tespit etmek yararlıdır (bölüm 2.3, Şekil 1H). Çift pozitif embriyolar AmCyan ve YPet floresan gösterecektir. Yetişkinliğe olumlu embriyolar kaldırın.
- Yenileyici fin Zebra balığı kuyruk yüzgeçleri amputasyon ve transgen ifade indüksiyon
- Anestezi balık kuyruk yüzgecinin kısmi amputasyonu gerçekleştirin 12 (Bölüm 2.4'e bakınız). Dox ile ya da hemen balık tedavi etmek veya balık konut sistemine iade.
- Islah kutu hazırlayın (Şekil 2A; malzemeler tabloya bakınız) (balık sistemi 1 L su için 2,000x 50 mg / ml stok, 500 ul) 25 ug / ml DOX ihtiva eden balık sistemi 1 L su ile doldurulur.
Not: transgen ekspresyonunun indüksiyonu amputasyonu olarak sağlar hemen sonrapost-amputasyon (3 dpa) 3 gün indüksiyon rejeneratif büyüme sırasında transgen ekspresyonunu veya fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılması gereken ise rejenerasyon sırasında erken olaylara etkileri değerlendirmeyi,. - Balık kaçamıyorum şekilde bir kapak (Şekil 2A) ile üreme kutusu ve yakın kutusuna 10 önceden kesilmiş, çift transgenik balık kadar aktarın.
- Stresi azaltmak için karanlıkta içine üreme kutuları yerleştirin. Biz genellikle sabit karanlık ve sıcaklığını sağlamak için bir 28.5 ° C hava inkübatör içine kutuları yerleştirin.
- EtOH sadece (1L balık sistem su başına 250 ul) ile negatif kontrol çift transgenik balık davranın.
Not: fin rejenerasyona Burada kullanılan DOX dozlarının olumsuz etkileri gözlemlenen hiçbir zaman ne kadar tek transgenik ya DOX ile tedavi edilen vahşi tip balık, ek bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. - Bir ıslatılmış agaroz kaplı petrinin üzerine bölüm 2.4 ve cımbız veya bir kaşık kullanarak aktarma balık açıklandığı gibi balık uyutmak çanak. Dikkatle cımbız kullanarak kuyruk yüzgeci yayıldı.
- Floresan bir stereo-mikroskop (Şekil 2B) kullanılarak, yenilenen olan YPet görünümünü için ekran balık.
NOT: Genellikle, TetResponder odaklı floresan sağlam DOX tedavi 6 saat takip görülebilir. Ancak, biz üretilen her bir hat için TetResponder ifade dinamiklerini karakterize öneririz. - TetResponder transgen indüksiyon sona erdirme veya tedaviler devam balık konut sistemine balık dönün.
NOT: tedavileri için> 24 saat (uzun süreli tedaviler) suyu değişimi ve günlük iyice üreme kutuları temizlemek için esastır. - Uzun vadeli tedaviler, yem balığı beslendikten sonra üreme kutuları onları dönmeden önce taze balık sistemi su ile temiz bir kap içine balık aktararak her 2-3 günde sırasında.
Fin rejenere içinde TetResponder İfade 4. Karakterizasyonu
t "> Not:. Genellikle 3 DPA 'cryosections floresan görüntüleme kullanılarak rejenere kuyruk fin dokuya spesifik gen ekspresyonunu doğrulamak için, bir yenilenme etkinliğini farklı doku bölmeleri oluşturulmuştur ve açık bir şekilde doku kesitlerinde tespit edilebilir, bu zaman noktasında, ve krio-bölümleme rejenerasyon ileriki aşamalarında daha basittir. Şekil 2C Yenilenme ayırt edilebilir doku etki göstermektedir ve bu alanlar için birkaç moleküler belirteçlerin listeler. Aşağıdaki protokol doğrudan görüntüleme veya immün için boyuna veya enine cryosections hazırlanmasını tarif .- Yetişkin kuyruk yüzgeçleri Cryosectioning
- Kimin kuyruk yüzgeçleri bölüm 3.2'de anlatıldığı gibi dox ile 3 dpa kadar 2 dpa den ampute edildi balık davranın
- Bölüm 2.4 de açıklandığı gibi balık uyutmak
- Nazikçe plastik Petri kabı bir kapak üzerine balık aktarmak için bir kaşık ya da cımbız kullanın.
- Yaklaşık 4-5 kemikli segmentte fin regenerate yeniden amputateİlk amputasyon düzlemine s yakın bir neşter kullanılarak ve taze balık sistemi su balık dönün.
- Ince cımbız kullanılarak (Malzemeler tabloya bakınız PBS) dikkatli bir şekilde transferi 1x Fosfat tamponlu tuzlu su içinde paraformaldehid (PFA) (ağ / hac)% 4 ihtiva eden küçük bir petri (örneğin, 35 mm) oluşturur. Regenerate ama doku sadece güdük kısmını dokunmayın.
- Petri alt üzerine düz doku yerleştirin ve 4 ° C'de O / N düzeltmek.
- Yıkama kemik matrisini kirecini O / N 4 ° C'de 0.5 M EDTA, PBS (pH 7.5) içinde yeniden oluşturur 1x PBS% 0.1 Tween (PBT) PFA çıkarın ve inkübasyona ihtiva eden iki kat yeniden oluşturur.
- % 10 sukroz-PBS,% 20 sukroz-PBS,% 30 sukroz-PBS ve% 30 oda sıcaklığında yeniden oluşturur inkübe sükroz-PBS: 1 doku dondurma ortamı: 1 oranında, 30 dakika her biri için (TFM malzemeler tabloya bakınız). Daha sonra, doku dondurma ortamı içinde> 2 saat süre ile 4 ° C'de yüzgeçleri inkübe edin.
- Bir mikroskop lamı üzerine cryomolds yerleştirin ve dolgudoku dondurma ortamı ile m. Hava kabarcıkları tanıtan kaçının.
- Aktarım fin yeniden üretilen (Şekil 2B) uzunlamasına veya enine bölümleri elde etmek için uygun cryomolds ve şark dokusu içine yeniler. O regenerate olun kesit kolaylaştırır, hangi düzdür.
- Aktarım dondurma işlemi (Şekil 2D) başlatmak için bir kuru buz yatak üzerine yerleştirilmiş bir metal raf üzerine mikroskop lamı ile birlikte cryomolds.
- Doku dondurma orta katı hale gelmiştir sonra, tezgah üzerine cryomold koyduğunuzda ve orta donma doku plastik orta arayüzünde thaws şekilde birkaç dakika boyunca oda sıcaklığında oturup izin.
- Cryomold dışında dondurulmuş bloğu itmek için bir kalem ya da benzeri kullanın. Doku kesit kadar -80 ° C 'de bir kutuda saklayın cryoblocks.
- Bir Cryo-mikrotom kullanılarak 10-14 mikron kalınlığında cryosections hazırlayın ve yapışma mikroskop slaytlar üzerinde bölümler (Malzeme tabloya bakınız) toplamak. NE kadar -20 ° C'de saklayın slaytlareded.
- YPet floresan göre fin bölümleri üzerinde TetResponder ifade Karakterizasyonu
- PBT, oda sıcaklığında iki yıkama ve PBS içinde 1 yıkama, her biri 5 dakika, ardından mikroskop lamı yapışmasını geliştirmek için -20 ° C'ye soğutulmuş,% 100 MeOH ile 30 dakika boyunca fin bölümleri tedavi edin.
- Iki yıkama 10 dakika PBS içinde, her ardından: PBS içinde 4 10 dakika ', 6-diamidino-2-phenylinodole (DAPI) (5.000 1) inkübe bölümleri tarafından çekirdekleri görselleştirmek.
- % 75 Gliserol-PBS içinde Dağı bölümleri veya ticari olarak temin edilebilen antifade bağlar, ve bir kapak sürgü ile kaplayın.
- Görüntü YPet ve konfokal veya geniş alan fluoresan mikroskop altında AmCyan floresan (Şekil 1E).
NOT: yapılabilir net (YPet ile tepkimeye girer, ancak AmCyan), anti-GFP antikorları ile birlikte hücre türü spesifik antijenlere karşı antikorlar ile YPet, immünofloresan veya immünohistokimya ifade eden hücre tipleri belirlenmesini kolaylaştırmak için,. Seçenek olarak ise, zayıf YPet ifade saptanmasını kolaylaştırmak için, YPet RNA karşı in situ hibridizasyon, RNA ya da gerçekleştirilebilir yüzgeç benzeri kanatçıkların parafin kesitleri tüm montaj.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Dokuya özel olarak uyanlabilir bir gen ekspresyonu, transgenik TetActivator ve TetResponder hatları için işlevsel teton sistemi kurmak için, üretilen (Şekil 1A) olması gerekir. Erken zebra balığı embriyolar ve daha sonra mikrop hattı entegrasyon inşa ya TetResponder (Şekil 1E) - Bu TetActivator (Cı Şekil 1B) microinjecting ile gerçekleştirilir. Fonksiyonel TetActivator konstruktları, ya ilgili gen (Şekil 1C) düzenleyici elemanları ihtiva eden bir BAC içerisine TetActivator kaseti tekrar birleştirilmesi ile TetActivator kaseti (Şekil 1B) yukarı akış yönünde, kısa düzenleyici diziler (güçlendirici elemanlar) arasında klonlama ile elde edilebilir. TetActivator yapısının Germlin birleşmesi münferit Tahmini ifade düzenine (Şekil 1D) G0 balık ve F1 embriyolarda AmCyan floresan görünümünü enjekte döllenmedir ile değerlendirilebilir. Germline INTEG, DOX ve YFP / YPet floresan (Şekil 1F) ortaya çıkması ile muamele edilir: rasyon ve TetResponder transgenin işlevselliği (Tet AmCyan ubikitin Burada) kurulan TetActivator balık bireysel G0 enjekte balık geçiş ile değerlendirilebilir. Güçlü ve homojen YFP / YPet ifadesini gösteren Balık istikrarlı TetResponder hattı (Şekil 1G) kurmak için tercih edilmelidir. Kurulan stabil TetActivator ve TetResponder balık hatları özel TetActivator / TetResponder kombinasyonlarına sahip çaprazlanmasıyla yaratılabilir. TetActiator ve TetResponder transjenlerin Taşıyıcılar TetActivator aktif gelişim aşamasında (Şekil 1H) de YFP / Ypet of DOX tedavi sonu çıkması aşağıdaki embriyogenez sırasında tespit edilebilir. Alternatif olarak, çift transgenik balık DOX tedavi ve yenileyici kuyruk yüzgecinin içinde TetResponder transgen indüksiyon (- B Şekil 2A) Aşağıdaki tespit edilebilir.
< p class = "jove_content"> Biz rutin yenileyici Zebra balığı kuyruk yüzgecinin indüklenebilir, doku spesifik gen ifadesi elde etmek için bu sistemi kullanabilirsiniz. Bir yenilenme etkinliğini farklı doku bölmeleri açıkça bu zaman noktası (Şekil 2C) doku-kesitlerinde tespit edilebilir beri, 3 dpa fin yeniden üretilen cryosections floresans görüntüleme dokuya özgü TetResponder transgen ekspresyonunu kontrol edin. Boyuna ve enine yüzgeç yeniden bölümleri doku soğukta koruyucu ve yüzgeç uygun (Şekil 2D) yeniden yerleştirme sonrası cryosectioning ile elde edilir. Kesit ardından TetResponder transgen ifadesi (Ypet / YFP floresan) floresan veya konfokal mikroskobu (Şekil 2E) kullanılarak görüntülenebilir. Distal blastema (ok başı) ve epidermisin (ok) ifade yoksun ise her4.3 promotör-tahrikli TetActivator, proksimal medyal blastem içinde TetResponder ekspresyonunu indükler unutmayın. > "ove_content
Şekil 1: Transgenik TetActivator ve TetResponder hatlarının üretimi. (A) Çizgi teton sistemi kullanılarak dokuya özel olarak uyanlabilir bir gen ifadesi için stratejiyi gösteren. (B) transgenik TetActivator (Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı hayır. 1247) yaparız. 5 'TetActivator irtTAM2 (3F) ihtiva eden bir poli-C kolaylaştırırilgi düzenleyici sekansların Cloning. AmCyan kodlama sekansı, bir P2A öz-yarma 'peptid ile TetActivator ayrılır. kaseti, Tol2 transpozon ters çevrilmiş tekrarlar ile çevrili bir SV40 poliadenilasyon sinyali içerir ve tek bir I-SceI meganuclease tanıma sitesini içermektedir. BAC recombineering için (C) TetActivator kaset (Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı hayır. 1180). Kaset, GB 3 prokaryotik promotör ile tahrik edilir seçimi için Kanamisin genini içerir. Kanamisin'e direnç geni komşu FRT siteleri BAC içine başarılı bir şekilde entegre Aşağıdaki ifade Flp rekombinaz aracılı çıkarılması için izin verir. (D) her4.3 verici G0 kurucu balık Kimlik: Tet AmCyan onların germ-line üzerinden yaparız. Taşıyıcılar bazı F1 embriyoların (ok başları) AmCyan floresan çıkması yoluyla tespit edilir. (E) transgenik TetResponder (Weidinger laboratuvar plazmid veritabanı hayır. 1444) yaparız.Bu inşa optimize Tet tepki elemanlarının kontrolü altında, bir poli-ve YPet CDS oluşur (TetRE geçirmez Clontech) ve SV40 poliadenilasyon sinyali ile sona erdirildi. Bu Tol2 transpozon ters tekrarlar tarafından çevrili ve tek bir I-SceI meganuclease tanıma sitesini içerir. Fonksiyonel TetResponder TetRE ileten G0 kurucu balık (F) Kimlik: Axin1-YFP kendi germline ile yaparız. 6 saat (ok başları) için DOX tedavisi sonrasında YFP floresans ve indüksiyonu: Taşıyıcı kurulu bir TetActivator (Tet AmCyan burada ubikuitin) çizgi ile melezlenerek tanımlanır. (G) DOX tedavi 12 saatlik bir toplam sonra (F) 'de gösterilen ofembryos kadar kapatın. YFP floresans oldukça yerde indüksiyon edin. Ve TetResponder (TetRE: Axin1-YFP) transgenleri (ok başları): TetActivator (Tet AmCyan her4.3) taşıyan iki transgenik embriyo (lH) tanımlanması. Biz Embriyolar6 saat DOX ile muamele yeniden. (A - H) Ölçek çubuğu: 500 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: rejenere zebra balığı kuyruk fin dokuya özel gen ekspresyonu için teton sisteminin kullanımı. Yetişkin zebrafish DOX tedavisinde kullanılan (A) Damızlık kutuları. TetRE (B) indüksiyonu: her4.3 göre Axin1-YFP TetResponder transgen: Tet AmCyan TetActivatoryenileyici kuyruk yüzgecinin içinde DOX tedavisinin 12 saat takip. EtOH ile muamele edilmiş kontrol balık YFP floresans olmadığına dikkat edin. (C) Çizgi, uzunlamasına bir kesit görünümü 3 dpa bir kanatçık yenilenme içinde bulunan doku bölmelerin bir görünümüdür. Cryosectioning (D) örnek hazırlama. Fin yeniler doku dondurma ortamı (TFM) yerleştirilmiştir, yenilenen uzunlamasına veya enine ya da bölümleri elde etmek için uygun bir şekilde yönlendirilmiş cryomolds, dolgulu ve TFM katılaşana kadar kuru buz üstünde oturan bir metal raf aktarılır. Kesit düzlemi kırmızı belirtilir. Kısaltmalar: dist .: uzak, prox .: proksimal, havalandırma .: ventral, .: dorsal Dors'a. (B) 'de gösterilen kanatlar türetilmiş bir kanatçık ışını yenilenme bir uzunlamasına kesitini YFP floresans (E) Konfokal görüntüsü. Tet AmCyan TetActivator hat proksimal-medial blastem özel olarak YFP indüksiyon sürücüler: her4.3 unutmayın. YFPfloresan yara epidermis (ok) ve mezenşimin (ok başı) (BC) Ölçek çubuğu distal-en etki de dahil olmak üzere, bölmelerin çeşitli tespit edilmediğinde: 500 mikron; (E) Ölçek çubuğu:. 100 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| TetActivator hattı | Referans | Düzenleyici elemanlar kullanılan | Öncelikle ifade |
| 7xTCF-Xla.Siam: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan | Yayınlanmamış Wehner & Weidinger, | 7xTCF-Xla.Siam Wnt muhabiri 1 | Wnt-duyarlı dokularda |
| myl7: irtTAM2 (3F) -p2a mCherry | Yayınlanmamış Haase & Weidinger, | myl7 (cmlc2) 2 | olgun Kardiyomiyositlerde |
| her4.3: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm6 | 3 | her4.3 4 | Merkezi sinir sistemi |
| keratin4: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm5 | 3 | keratin4 5 | epidermis, yetişkin fin bazal tabaka hariç |
| keratin18: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm4 | 3 | keratin18 6 | epidermis bazal tabakasında sadece yetişkin fin |
| SP7: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm3 | 3 | SP7 / osx 7 | (Taahhüt) osteoblastlar |
| ubikitin: irtTAM2 (3F) -p2a-AmCyan ulm2 | 3 | übikitin 8 | (Oldukça) her yerde |
Tablo 1:. Mevcut transgenik TetActivator hatları Bu tablo transgenik TetActiva listeleristeğe bağlı olarak Weidinger laboratuar edin Hem embriyonik ve yetişkin balık TetActivator dokuya özel ekspresyon için tor hatları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
yetişkin zebrabalıkları başarıyla birçok iç organları ve ekleri yenilemek için inanılmaz bir kapasiteye sahiptir. Katılan moleküler ve hücresel mekanizmaların bir anlayışa gen fonksiyonları ve sinyal yollarının doku spesifik analiz gerektirir. Bu doğru, Teton sistemi embriyonik ve yetişkin zebrafish spatiotemporally kontrollü gen ifadesi için etkin bir araç sağlar. Bu yazıda anlatılan Teton sistem yapıları ve metodoloji başarıyla laboratuvar 3 son bir çalışmada kullanılmıştır. teton sistemini kurarken aşağıdaki ek hususlar dikkate alınmalıdır:
TetActivator transgen tasarım konuları
Daha önce göstermiştir ki, herpes simpleks virüsü VP16 transaktivasyon ile kaynaşmış ters Tet bastırıcı etki M2 mutant varyantı aşağıdakilerden oluşan tek bir indüklenebilir TetActivator alanı türev 3F [irtTAM2 (3F), in kısa Tet-M2] verimli indüksiyon bahşeder, ancak düşük gösterebilir, ölçülebilir leakiness olsa, o Doksisiklin (DOX) yokluğunda aktivitesini uyaran arka 5'tir. Bu nedenle, bir sızıntının 5 ortadan kaldırmak, bir glukokortikoid reseptörüne (Tet-KHY) ya da ekdison reseptörü (Tet-ECR) içindeki bir etki ile füzyonları kullanılarak uyarılabilir sistemler ikili olarak tanımlamışlardır. Sistem, bir ikili olarak uyanlabilir varyantının kullanımı, toksik ya da çok güçlü bir protein (örneğin, onkogenler) ifade etmek için kullanılır Böylece, dikkate alınmalıdır. Alternatif olarak, TetActivator ve TetResponder hatlarının kurulması sırasında farklı ifade seviyelerini üretim hatları bir dizi seçilebilir ve vaka leakiness seçilen zayıf indükleyicilerinin şiddetle uyaran hatları ile bir konudur. Tet-GBD veya Tet-ECR varyantını içeren TetActivator yapıları istek üzerine Weidinger laboratuarında temin edebilirsiniz.
Transgenik zebrafish hatları üretimi için Transgenesis yöntemleri
TetResponder transgen ifade analizi
Yetişkin kanatçıklarda dokuya özel TetResponder transgen ekspresyonunu tespit etmek için genellikle cryosections floresan görüntüleme kullanımı. Bizim tecrübelerimize göre, transgen tarafından ifade floresan proteinleri floresan fixatio boyunca korunurn ve böylece prosedürü cryosectioning ve doğrudan görüntülenebilir. Başka bir yerde tarif edilmiştir TetResponder ekspresyonu, tespiti için ilave yöntemler şunlardır: bölümlerinde, ii), flüoresan veya kromojenik ISH bir anti-GFP antikor kullanılarak, tercihen burada floresan protein etiketi YPet karşı bölümleri üzerinde immün I) veya iii ) tüm montaj ISH kesit izledi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Yazarlar teknik yardım için Christa Haase, Doris Weber ve Brigitte Korte teşekkür ederiz. Weidinger laboratuarında çalışmak Deutsche Forschungsgemeinschaft BİZ 4223 / 3-1 hibe tarafından desteklenen, 4223 / 4-1 ve Deutsche Gesellschaft für Kardiologie bir Oskar-Lapp-Stipendium aracılığıyla ve Klaus-Georg-und-Sigrid- tarafından BİZ Hengstberger-Forschungsstipendium.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Breeding boxes | Aqua Schwarz | AquaBox 1 | |
| Compound fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Confocal microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | to image fluorescent tissue sections |
| Cryostat | e.g., Leica, Thermo-Scientific | varies with the manufacturer | for cryosectioning |
| 4’, 6- diamidino-2-phenylinodole (Dapi) | Sigma-Aldrich | D9542 | use 1/5,000 in PBS for visualization of nuclei |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891 | prepare stocks in 50% EtOH at 50 mg/ml (97 mM) for TetResponder induction |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich | P6148 | 4% (w/v) paraformaldehyde in PBS, pH 7.5 for fixation |
| 1x Phosphat-buffer saline (PBS) | 1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5 | ||
| 1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT) | 1x PBS with 0.1% Tween 20 | ||
| Superfrost Ultra Plus adhesion microscope slides | Thermo Scientific | 1014356190 | for collection of tissue sections |
| Stereo fluorescent microscope | e.g., Leica, Zeiss | varies with the manufacturer | for fluorescence-based genotyping |
| Thermocycler | e.g., Biorad, Applied Biosystems | varies with the manufacturer | for PCR-based genotyping |
| Tissue freezing medium (TFM) | Triangel Biomedical Sciences | TFM-C | for embedding of tissue samples |
| Tricaine (L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | for anesthesia use at 1 mg/ml in E3 embryo medium |
References
- Fang, Y., et al. Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).
- Tryon, R. C., Johnson, S. L. Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin. PloS one. 9 (7), e102317 (2014).
- Wehner, D., et al. Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin. Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).
- Huang, C. J., et al. Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines. Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos. Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).
- Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish. Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).
- Bussmann, J., Schulte-Merker, S. Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish. Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Matthews, M., Varga, Z. M. Anesthesia and euthanasia in zebrafish. ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin. J Vis Exp. (61), (2012).
- Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. Biotechniques. 43 (5), 610 (2007).
- Thermes, V., et al. I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish. Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).
- Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).
- Grabher, C., Wittbrodt, J. Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka. Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).
