Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Kirurgisk Skade til Mouse Pancreas gennem Ligation af Pancreas Duct som en model for Endokrine og eksokrine omprogrammering og spredning

Published: August 7, 2015 doi: 10.3791/52765
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Diabetes Research Center, Vrije Universiteit Brussel

Abstract

Udvidelse af pancreas-beta-celler in vivo eller ex vivo, eller generering af beta-celler ved differentiering fra et embryonisk eller voksne stamceller, kan tilvejebringe nye ekspanderbare kilder til betaceller at afhjælpe donor knaphed i human islet transplantation som terapi for diabetes. Selv om de seneste fremskridt er blevet gjort i retning af dette mål, mekanismer, der regulerer beta celle ekspansion og differentiering fra en stilk / progenitorcelle mangler at blive karakteriseret. Her beskriver vi en protokol for en skade model i den voksne mus bugspytkirtlen, der kan fungere som et redskab til at studere mekanismer væv remodellering og beta-celle proliferation og differentiering. Partiel kanal ligering (PDL) er en eksperimentelt induceret beskadigelse af gnaver pancreas involverer kirurgisk ligering af de vigtigste bugspytkirtelkanalen resulterer i en obstruktion af dræning af eksokrine produkter ud af halen region i bugspytkirtlen. Den påførte skade inducerer acinære atrofi, immun celle infiltration og svær vævsremodellering. Vi har tidligere rapporteret aktiveringen af ​​Neurogenin (NGN) 3 udtrykker endogene progenitor-lignende celler og en stigning i beta-celleproliferation efter PDL. Derfor PDL giver grundlag for at studere signaler involveret i beta celle dynamik og egenskaberne for en endokrin stamfader i voksen bugspytkirtlen. Da det stadig stort set uklart, hvilke faktorer og veje bidrager til beta-celle neogenese og proliferation i PDL, vil en standardiseret protokol for PDL mulighed for sammenligning på tværs af laboratorier.

Introduction

Den stigende forekomst af diabetes, der påvirker mere end 300 millioner mennesker verden over 1,2 har øget søgningen efter nye kilder til insulinproducerende betaceller, både in vitro og in vivo, at genopbygge den mangelfulde betacellemasse. 3 Identifikation nøgle mekanismer og faktorer, der regulerer beta celleproliferation og beta celle neogenese, dvs. differentieringen af beta-celler fra en ikke-beta celle eller progenitorcelle, kan tilvejebringe nye mål for udvikling af regenerative terapier i diabetes.

I udviklingslandene gnaver pancreas, alle de endokrine celletyper skelne fra en transient population af endokrine progenitorceller, der udtrykker transkriptionsfaktoren Neurogenin3 (Ngn3). 4,5 i den voksne gnaver pancreas, under normale fysiologiske betingelser, beta cellemasse holdt ved et optimalt antal at opfylde metaboliske krav. Ændringer i beta cellestørrelse,apoptose og replikation udgør de væsentligste mekanismer for beta-celle ekspansion og vende-over. 6-8 Mens potentialet af beta-celler til at proliferere under normale fysiologiske betingelser er homogen i hele befolkningen, 9 deres proliferation er lav og re-replikation er begrænset af en dynamisk ubevægelighed periode eller refraktær periode 6,7, påvirket af alder og glukosemetabolismen. 10 Da endokrine progenitorceller har hidtil ikke blevet identificeret i den normale voksne pancreas, er neogenese menes at ikke bidrager til normal vækst voksen beta celle. 8

Derfor er identifikation af en fakultativ endokrine progenitorcelle i den voksne pancreas, der kan udvides og i stand til at give nye betaceller ville tilvejebringe en hidtil ukendt, muligvis ubegrænset kilde til beta-celler.

Partiel kanal ligering (PDL) er et dyr skade model, der er beskrevet at inducere beta celle neogenesis i den voksne pancreas. 11,12 I denne model er den vigtigste bugspytkirtelkanalen dræne pancreas hale kirurgisk ligeret. Den resulterende obstruktion af eksokrine dræning inducerer stor vævsremodellering ledsaget af inflammation og acinar atrofi distalt for ligering. 12-14 Inden for denne inflammatoriske miljø, re-ekspressionen af det endokrine stamfader markør Ngn3 induceres og volumen beta celle stiger dobbelt . Denne fordobling i beta celle volumen resultater fra generation af nye betaceller fra en Ngn3 udtrykker embryonale type endokrine progenitorcelle og fra spredning af allerede eksisterende og nydannede betaceller, der er tilbøjelige til at re-duplikering uden "hvile periode". 11,15

Beta celle neogenese og replikation i skade modeller, såsom pankreatektomi 6,7,16-19 og selektiv ablation af betaceller 20 er blevet grundigt beskrevet. Men den regenerative resultat i these modeller er påvirket af omfanget af den påførte skade og er forbundet med en nedsat initial betacellemasse 21. PDL er en kirurgisk model, hvor den oprindelige betacellemasse ikke påvirkes og beta-celle neogenese og proliferation er håndfast aktiveret. Faktisk, i bugspytkirtlen af ​​mus, der undergik PDL, er Ngn3 udtrykkende celler identificeret nær epitelforingen af ​​kanalen. Disse celler kan isoleres fra de ligerede pancreas af Ngn3-GFP transgene mus under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) og er i stand til at differentiere hen imod funktionelle betaceller efter indpodning ind i og ex vivo kultur af pancreas fra E12.5 Ngn3 - / - . mus 11 Tilsvarende i Ngn3 CreERT;. R26 YFP mus, hvor celler, der aktiverede den Ngn3 genet er permanent mærket efter tamoxifen injektion, er label-positive Ngn3 celleafledte betaceller påvist efter PDL 15 Desuden nydannede betaceller fortynde præ -existing betaceller og fortrinsvis finde i små holme, inden for hvilke betaceller udviser stort potentiale spredning. 15 Ngn3 er vigtig for beta celleekspansion efter PDL siden faldt Ngn3 udtryk ved hjælp målspecifik korte hårnål RNA signifikant nedsætter betacellemasse og beta celleproliferation efter PDL. 11. Især den del af Ngn3 celleafledte betaceller og betacellemasse efter PDL kritisk afhænger af niveauet af Ngn3 induktion 15. Dette er i overensstemmelse med den observation, at høje Ngn3 udtryk er et afgørende skridt for endokrine engagement fra multipotente bugspytkirtlen forfædre under pancreasudviklingen 22 Desuden, selektiv ablation af Ngn3 udtrykkende celler ved difteri-toksin administration til Ngn3 CreERT;. R26 iDTR mus resulterer i nedsat insulinindholdet og reduceret beta-celleproliferation, især i de små øer. 15

Ngn3 udtryk i ventilationskanal celler efter PDL er blevet bekræftet af mange 11,15,16,23,24, Ngn3 udtryk i holme celler 24,25 og uoverensstemmelser i udfaldet af PDL udfordrede vores indledende observationer af forøget betacellemasse 26,27, udseende Ngn3 udtrykkende kanalsystemer-afledte endokrine progenitorer 24,26,28,29 og øget beta celleproliferation 27 efter PDL. 30

Disse modstridende resultater kan, i det mindste delvist, tilskrives en kombination af faktorer, herunder variationer i post-kirurgiske tidspunkter for analyse, kropsvægt, køn og alder mus, postoperative fysiologiske og miljømæssige betingelser, og vigtigst af alt, forskelle i kirurgisk teknik. 30 i vores hænder, beta celleproliferation, insulin indhold, beta-celle volumen og antallet af små holme er konsekvent steget efter PDL. OgsåNgn3 mRNA konsekvent stiger, men der er store forskelle i Ngn3 mRNA-ekspression mellem PDL hale pancreases, som vi ikke har nogen direkte forklaring. Vores hypotese, at niveauet for Ngn3 mRNA kunne korrelere med graden af beta-celle neogenese fra ikke-betaceller 15, men det kræver yderligere dokumentation. Selv om det ikke fjerne alle eksperimentelle variationer, en standardiseret metode til at udføre PDL kirurgi giver mulighed for bedre ensartethed i resultaterne og åbner nye muligheder i at studere beta celledeling og neogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle manipulationer følger retningslinjerne udstedt af den europæiske konvention om beskyttelse af hvirveldyr, der anvendes til forsøg og andre videnskabelige formål (ETS 123 og og 2010/63 / EU).

1. Fremstilling af arbejdsområdet

  1. Giv en dedikeret forberedelse område, en kirurgisk og et opsving område.
  2. Gennemføre hele kirurgiske procedure i en laminar strømning kabinet for at minimere miljøbelastende stoffer.
  3. Saml leverancerne (som anført i materialer og metoder), der er nødvendige på forberedelse, kirurgiske og nyttiggørelse område, ved hjælp af ordentlig aseptisk teknik.
  4. Sikre, at kirurgiske værktøjer autoklaveres før kirurgi.
  5. Tilvejebringe en recirkulerende vand varmepude ved en temperatur på 38 ° C til stabilisering temperatur under kirurgi. Dæk varmepude med en steril vandtæt pad.
  6. Give et operativsystem mikroskop med en forstørrelse på mindst 6.3X.
  7. Anvende et instrument SteriLizer, såsom en varm perle sterilisator, at sterilisere instrumenter mellem kirurgiske procedurer.
  8. Forbered et opsving område bestående af et stort bur, foret med fladt papir strøelse

2. Forberedelse af Dyr til Kirurgi

  1. For PDL og humbug kirurgi, anvende 8 uger gamle hanmus, opstaldet i standard bure og vedligeholdes på en 12 timers lys / 12 timer mørke cyklus og fodret en standard gnaver kost ad libitum.
    Bemærk: Her bruger vi BALB / cJrJ mus, men vi har også med succes brugt andre stammer og forskellige transgene stammer.
  2. Bruge Buprenophine som forebyggende analgesi (0,05-0,1 mg / kg) 30 min før operation.
  3. Anesthetize mus ved intraperitoneal injektion af 100 mg / kg af ketamin og 5 - 10 mg / kg xylazin.
  4. Vurdere ordentlig bedøvelse ved at observere gradvise tab af frivillige bevægelser og muskel afslapning. Test tabet af reflekser ved tå klemme.
  5. Anvend oftalmologiske salve til prevent tørhed af øjnene, mens under anæstesi.

3. Kirurgisk site Forberedelse

  1. Desinficer brystkasse og mave med antiseptisk klorhexidin løsning.
  2. Barbere et område på 2,5 cm x 1,5 cm i maven.
  3. Desinficere barberet område ved hjælp gaze vædet med klorhexidin løsning, så alkohol-opløsning og en endelig anvendelse af klorhexidin løsning.
  4. Placere dyret i det kirurgiske område, at den forbehandlede kirurgiske sted er opadvendende kirurgen.
  5. Drapere mus under anvendelse af et vandtæt kirurgisk afdækningsstykke med en åbning, der forlader den desinficerede maveregionen eksponeret selv om det omfatter resten af ​​kroppen for at skabe et sterilt arbejdsområde. Overvåg musen forud for proceduren for dybden af ​​bedøvelse.

4. bugspytkirtlen Duct Ligation

  1. Laparotomi
    1. Foretag en øvre midtlinie incision i huden strækker sig fra formet som et sværd proces til navlen anvendelse af en sterilkirurgisk kniv. Adskil underliggende linea alba og peritoneum med sterile sakse for at blotlægge den øvre abdomen kvadrant.
    2. Forhindre udtørring af de indre organer ved regelmæssig overbrusning med steril 0,9% natriumchlorid.
    3. Anvendelse af steril pincet eller podning, trække maven overlegent, udsætter milt og milt lap (haleregionen) i bugspytkirtlen.
    4. Forsigtigt trække duodenum og en del af den øvre jejunum til højre øvre abdominal kvadrant for at blotlægge hoved, hals og krop region i bugspytkirtlen er omfattet af visceral peritoneum.
  2. Ligation
    1. Lokalisere den anatomiske position af pancreas hovedkanal i halsregionen i bugspytkirtlen.
    2. Incise den antiamerikanisme bughinden og gastrocolic ledbånd, give adgang til retroperitoneum, udsætter kroppen og halen region i bugspytkirtlen. For at blotlægge halsregionen, udføre en Kocher manøvre. Løft duodenum og leder afbugspytkirtlen off retroperitoneum løfter dem fra den nedre vena cava og aorta nedenfor.
    3. Placer forsigtigt spatel under halsregionen. Ligere pankreasgangen med 6-0 prolene gevind ved den venstre side af den portale vene, der adskiller de gastro-duodenale og milt lapper.
    4. Udføre en anden ligering i umiddelbar nærhed af den første ligering for at sikre, at lapperne er tilstrækkeligt adskilt.
    5. Ligere meget forsigtigt for ikke at beskadige de underliggende blodkar, nemlig den overlegne pancreaticoduodenal arterie, inferior pancreaticoduodenal arterie og pancreas del af milt arterie.
    6. Placere organerne tilbage i bughulen.
    7. Lukke snittet under anvendelse 4-0 polyglycol filamentøs tråd i en kontinuerlig sutur mønster for musklen / peritoneal lag og i et diskontinuerligt mønster sutur for huden.

5. Sham Surgery

  1. Udfør alle trin som debeskrevet i trin 1 til 4.1.4. Mens bugspytkirtlen er udsat for, ikke udfører ligering af pancreas-kanalen.
  2. Ved afslutningen af ​​trin 4.1.4, placere indre organer tilbage i bughulen.
  3. Lukke snittet som beskrevet i 4.2.7.

6. Post-operative pleje og overvågning

  1. Efter den kirurgiske procedure er afsluttet, skal du placere musen i aflåst område. Denne består af et bur anbragt på en varmepude og foret med flad papir strøelse for at opretholde normal kropstemperatur.
  2. Tilvejebringe ernæringsmæssig støtte at undgå postoperativ hypoglykæmi ved fugtet fødevarer anbragt på buret bund. Til dette formål bruge standard gnaver kost piller lægges i blød i vand, indtil de blødgøre.
  3. Tilvejebringe fluid støtte fra den fugtede fødevarer og levere vand ad libitum.
  4. Bruge Buprenophine som analgesi (0,05-0,1 mg / kg) to gange dagligt i 2 dage efter kirurgi. Under hele eksperimenterende, opfølgning, observe musene for forekomsten af ​​eventuelle tegn på infektion, herunder sekretion af væske eller pus fra såret, eller til fysisk forringelse karakteriseret ved reduktion i grooming adfærd og aktivitetsniveau, lavere appetit og legemsvægt tab.

7. Evaluering af Vellykket PDL og Høst af PDL Tail og Sham Tail Pancreas

  1. Aflive mus ved cervical dislokation.
  2. Re-barbering maveregionen at undgå overførsel af pels.
  3. Åbne abdominale hud og muskel lag og fjerne et stort område af hud og muskel at opnå god adgang til pancreas.
  4. Anvendelse af steril pincet eller svaber, er maven tilbagetrukket overlegent, udsætter milt og milt lap (haleregionen) i bugspytkirtlen.
  5. Træk forsigtigt duodenum og en del af den øvre jejunum at blotlægge gastro-duodenale lap (hoved-regionen) i bugspytkirtlen.
    Bemærk: Det ligerede del af PDL bugspytkirtlen er nu reduceret i størrelse og er blevet næstengennemskinnelig, således at øer er synlige som små hvide prikker. Hoveddelen i bugspytkirtlen er uigennemsigtigt pink og distinkt eksokrine lobuli kan iagttages.
  6. Anvendelse af steril saks, adskille ligeret hale del af pancreas fra milten, ved at skære langs milten. Skåret fri bindevævet forbinder haleregionen i bugspytkirtlen til de indre organer.
  7. Skær PDL haleregionen lige foran ligeringen, eksklusive ligatur og vævet umiddelbart op til det fra den høstede væv.
  8. For at isolere sham hale væv Følg trin 7.1 til 7.5. Ved hjælp steril saks adskille hale regionen af ​​fingeret pancreas fra milten ved at skære langs milten. Isoler haleregionen ved at skære ind i halsregionen i bugspytkirtlen og skære løs bindevæv forbinder halen bugspytkirtlen til de indre organer
    Bemærk: Både halen og hoved region falske bugspytkirtlen er uigennemsigtige lyserøde, at isolere de to dele hver for sig,skære bugspytkirtlen i halsregionen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

PDL inducerer acinar atrofi og inflammation, men påvirker ikke kropsvægt og glycemia

I 8 uger gamle BALB / c-mus er kanalen dræne de eksokrine enzymer fra halen i bugspytkirtlen ligeret mens orgel hoved, ligger ved siden af ​​maven og duodenum, forbliver upåvirket. Alder, køn og vægt-matchede BALB / c mus undergår skinkirurgi den gentog alle trin af delvis kanal ligering kirurgi, undtagen ligering af pancreas-kanalen. Pancreas væv blev høstet 3, 7, 14, 30 dage efter kirurgi.

Når PDL udføres korrekt, mus forekommer sunde og ikke udviser en væsentlig forskel i kropsvægt (figur 1A) eller glycemia (figur 1B) sammenlignet med sham-opererede mus. Exokrine acinære væv mistes gradvist efter PDL kirurgi (Figur 2A-E), hvilket resulterer i en reduktion i størrelsen og vægten af den ligerede del af P DL pancreas (figur 3), fra herom kaldet PDL hale. Tre dage efter PDL, acinære væv morfologi bliver forstyrret og acinære celler undergår apoptose (figur 4) og er sandsynligvis opslugt af infiltrerende CD45 + immunceller (figur 5). På dag 7 efter PDL, er mange acinære lobules erstattet af fibrotisk (figur 6) og fedtvæv (figur 2C-E), mens de resterende acinære celler undergår acinære-til-duktalt metaplasi. Ved dag 14 efter PDL, næsten alle acinære lobuli er blottet for acinære celler (figur 2A-E) Selve PDL hale bugspytkirtlen synes gennemskinnelig, således at øer bliver synlige for det blotte øje (figur 3). Sammenfaldende med indledningen af acinære apoptose, observeres en stigning i cellecyklus aktivitet af duktale epitel (figur 7).

PDL inducerer en stigning i insulin + beta cellevolumen

Indholdsproduktion "> To uger efter PDL den samlede beta- cellevolumen i PDL hale er fordoblet sammenlignet med ikke-ligeret Sham hale. Beta cellevolumen kvantificeres ved måling af INS + -området i 4 um sektioner, 36 um bortset spænder over hele væv tegner sig for 10% af den samlede bugspytkirtlen volumen. PDL inducerer en stigning i insulin indhold to uger efter, kirurgi sammenlignet med ikke-ligeret pancreas som kan påvises ved automatiseret hele -tissue optisk tomografi (OPT). 15 Da beta cellestørrelse ændres ikke efter PDL stigningen i beta cellevolumen er resultatet af en stigning i beta celleantal.

PDL inducerer en stigning i beta-celleproliferation og aktiveringen af Ngn3 ekspression

Beta celleproliferation analyseres ved immunhistokemisk (IHC) farvning i pancreas høstede 7 dage og 14 dage efter Sham eller PDL kirurgi. Procentdelen af ​​betaceller positive for proliferation markør Ki-67 kvantificeres ved ieftersyn af individuelle celler i en ikke-automatiseret måde. 7 og 14 dage efter PDL kirurgi, er beta celleproliferation i PDL hale signifikant forøget sammenlignet med ikke-ligeret pancreas.

Inden for 3 dage efter PDL ekspressionen af ​​det embryoniske ø-progenitor-markør Ngn3 signifikant forøget i PDL hale sammenlignet med ikke-ligeret bugspytkirtlen. Maksimale niveauer af Ngn3 udskrift blev nået inden for 1 uge og faldt derefter langsomt. Vi måler rutinemæssigt Ngn3 genaktivering ved at udtrykke graden af Ngn3-koder mRNA i PDL bugspytkirtlen i forhold til den stabile Ngn3 niveau tolvfingertarmen. Vi foreslog for nylig, at omfanget af neogenese i PDL kan afhænge af niveauet af Ngn3 genaktivering. 15,30

Figur 1
Figur 1. PDL påvirker ikke legemsvægt eller glykæmi. Legemsvægt (g) (A) og glykæmi (mg/ Dl) (B) fra skinopererede (hvide søjler) og PDL mus (sorte søjler) blev målt på forskellige tidspunkter (dag 0, 7, 14 og 30) efter operation, og viste ingen signifikant forskel mellem humbug og PDL drives mus på noget tidspunkt. Figur oprindeligt udgivet af Xu et al., 2008. 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2. PDL fører til et gradvist tab af acinære celler. Morfologisk ændring af PDL hale pancreas afsløret af hæmatoxylin-eosinfarvning på dag 3 (B), 7 (C), 14 (D) og 30 (E) postoperativt sammenlignet med sham-opererede hale bugspytkirtlen (A). Ved 3 dage efter ligeringsprodukter, kan kun en subtil forstyrrelse af acinære væv være observed (B). 7 dage efter ligering, er acinært væv alvorlige forstyrrelser og duktale komplekser har dannet (C). På 14 dage efter ligation, forbliver nogle acinarceller og acinar lobuli erstattes af duktale strukturer, et fibrøst netværk og adipocytter (angivet med en stjerne (*) i panel C og E). Klik her for at se en større version af dette tal .

Figur 3
Figur 3. PDL hale ved høst. Sham hale (A) og PDL hale (B) høstet på dag 14 efter kirurgi. PDL hale er drastisk reduceret i størrelse i forhold til Sham hale. Billede (C) viser PDL hale på dag 14 efter kirurgi in situ. Grund af tab af acinære celler, PDL halesynes gennemsigtig, den vigtigste pancreas kanalen er klart synlig (angivet med sort pil) og holme er synlige som små hvide prikker (angivet med hvid pil). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4. PDL inducerer acinære apoptose. Immunfarvning for spaltet-caspase 3 i PDL hale på 3, 7 og 14 dage efter kirurgi afslører apoptotiske legemer i acinære rum på dag 3 og dag 7 efter kirurgi, mens acinære celler er næsten fraværende fra PDL hale på dag 14. Forstørrelse barer er 25 um. Figur oprindeligt udgivet af Xu et al., 2008. 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

= "Figur 5" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig5.jpg" />
Figur 5. PDL inducerer immune celleinfiltration. Immunfarvning for leukocyt markør CD45, der viser tilstedeværelsen af et højt antal af immunceller i PDL hale 7 dage efter kirurgi sammenlignet med sham pancreas. Forstørrelse barer er 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6
Figur 6. PDL inducerer fibrose. Immunfarvning for alpha glatmuskelactin viser tilstedeværelse af et fibrøst netværk i PDL hale 14 dage efter operationen sammenlignet med sham pancreas. Forstørrelse barer er 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

</ Html"Figur 7" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg" />
Figur 7. PDL inducerer en stigning i kanalen celleproliferation. Dobbelt immunfarvning for kanalen cellemarkøren Cytokeratin 19 (CK19) og for proliferationsmarkør BrdU viser en stigning i cellecyklus aktivitet af ventilationskanal celler. Forstørrelse barer er 25 um. Figur oprindeligt udgivet af Xu et al., 2008. 11. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0.9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki-67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaw, J. E., Sicree, R. A. Global estimates of the prevalence of diabetes for. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants. Lancet. 378, 31-40 (2011).
  3. Borowiak, M., Melton, D. A. How to make beta cells. Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).
  4. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, 41-46 (2004).
  7. Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, 817-826 (2007).
  8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth. Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).
  9. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance. PLoS Biol. 5, e163 (2007).
  10. Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development. 137, 3205-3213 (2010).
  11. Xu, X., et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132, 197-207 (2008).
  12. Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats. Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).
  13. Yasuda, H., et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice. Journal of interferon, & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).
  14. Van Gassen, N., et al. Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas. European journal of immunology. , (2015).
  15. Van de Casteele, M., et al. Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas. Cell Death Dis. 4, e523 (2013).
  16. Xiao, X., et al. No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas. The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).
  17. Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1. Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).
  18. Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes. 55, 269-272 (2006).
  19. Bonner-Weir, S., Sharma, A. Pancreatic stem cells. The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).
  20. Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).
  21. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).
  22. Wang, S., et al. Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas. Developmental biology. 339, 26-37 (2010).
  23. Pan, F. C., et al. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140, 751-764 (2013).
  24. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  25. Wang, S., et al. Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).
  26. Kopinke, D., et al. Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas. Development. 138, 431-441 (2011).
  27. Rankin, M. M., et al. beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice. Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).
  28. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  29. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  30. Van de Casteele, M., et al. Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond. Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).
  31. Zhang, J., Rouse, R. L. Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice. Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).
  32. Martinez-Romero, C., et al. The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).
  33. Prevot, P. P., et al. Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia. Gut. 61, 1723-1732 (2012).

Tags

Medicin Pancreas Delvis kanal ligering (PDL) skade kirurgi musemodel celledifferentiering Neurogenin (NGN) 3 celle omprogrammering celleproliferation.
Kirurgisk Skade til Mouse Pancreas gennem Ligation af Pancreas Duct som en model for Endokrine og eksokrine omprogrammering og spredning
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Groef, S., Leuckx, G., Van… More

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter