Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Chirurgische Letsel aan de muis alvleesklier door middel Ligatie van de alvleesklierbuis als een model voor Endocriene en Exocrine herprogrammeren en proliferatie

doi: 10.3791/52765 Published: August 7, 2015

Abstract

Uitbreiding van pancreatische beta-cellen in vivo of ex vivo, of vorming van beta-cellen door differentiatie van een embryonale of volwassen stamcellen kunnen nieuwe expandeerbare bron van beta-cellen de donor schaarste op menselijke eilandjestransplantatie als therapie voor diabetes te verzachten. Hoewel de recente vooruitgang is geboekt op weg naar dit doel mechanismen die beta-cel expansie en differentiatie van een stam / voorlopercellen cel reguleren nog worden gekarakteriseerd. We beschrijven hier een protocol van verwondingen model in de volwassen muis alvleesklier die kan dienen als middel om mechanismen van remodellering van het weefsel en beta-celproliferatie en differentiatie te bestuderen. Gedeeltelijke ligatie duct (PDL) is een experimenteel toegebrachte aandoening van het knaagdier pancreas waarbij chirurgische ligatie van de alvleesklier kanaal resulteert in een obstructie van de afvoer van exocriene producten uit het staartgebied van de pancreas. De toegebrachte schade veroorzaakt acinaire atrofie, immuun cel infiltrantsoen en ernstige weefsel remodeling. We hebben eerder gemeld activering van Neurogenine (NGN) 3 tot expressie endogene progenitor-achtige cellen en een toename in beta-celproliferatie na PDL. Daarom PDL een uitgangspunt voor de betrokken signalen in beta celdynamiek en de eigenschappen van een endocriene voorlopercellen bij volwassen pancreas bestuderen. Aangezien het nog grotendeels onduidelijk welke factoren en trajecten bijdragen aan beta-cel neogenese en proliferatie in de PDL, zal een gestandaardiseerd protocol voor PDL zorgen voor vergelijking tussen laboratoria.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De toenemende prevalentie van diabetes, die meer dan 300 miljoen mensen wereldwijd 1,2 stimuleerden de zoektocht naar nieuwe bronnen van insuline producerende beta-cellen, zowel in vitro als in vivo, om de deficiënte beta-celmassa vullen. 3 identificeren key mechanismen en factoren die betaceldeling en beta-cel neogenese, dwz de differentiatie van beta-cellen van een niet-beta cel of progenitor cel reguleren, kunnen nieuwe doelen voor de ontwikkeling van regeneratieve therapieën diabetes.

In ontwikkelingslanden knaagdier pancreas, alle endocriene celtypen te onderscheiden van een transiënte populatie van endocrine voorlopercellen expressie de transcriptiefactor Neurogenin3 (Ngn3). 4,5 In de volwassen knaagdier pancreas, onder normale fysiologische omstandigheden, de beta celmassa is gehandhaafd op een optimaal aantal metabolische eisen te voldoen. Mutaties in beta celgrootte,apoptose en replicatie vormen de belangrijkste mechanismen voor de beta-cel uitbreiding en draai-over. 6-8 Hoewel het potentieel van de beta-cellen te laten groeien onder normale fysiologische omstandigheden homogeen is in de hele bevolking, 9 hun verspreiding is laag en re-replicatie wordt beperkt door Een dynamische rust periode of refractaire periode 6,7 invloed van leeftijd en glucosemetabolisme. 10 Aangezien endocrine voorlopercellen tot nu toe niet geïdentificeerd in de normale volwassen pancreas wordt neogenese vermoedelijk niet bij aan normale volwassen beta celgroei. 8

Daarom is de identificatie van een facultatieve endocrine voorlopercellen in de volwassen pancreas die uitzetbaar en kunnen opleveren nieuwe beta-cellen zou een nieuwe, eventueel onbeperkte bron van beta-cellen.

Gedeeltelijke duct ligatie (PDL) is een dier letsel model dat is beschreven om beta-cel neogenesi inducerens in de volwassen pancreas. 11,12 In dit model wordt de belangrijkste ductus pancreaticus aftappen van de pancreas staart chirurgisch geligeerd. De resulterende verstopping van exocriene drainage induceert belangrijke weefselremodellering, vergezeld door een ontsteking en acinaire atrofie distale aan de ligatie. 12-14 Binnen deze inflammatoire milieu, re-expressie van de endocriene voorlopercellen marker Ngn3 wordt opgewekt en de hoeveelheid beta-cellen verhoogt tweeledig . Deze verdubbeling in beta cel volume resultaten van het genereren van nieuwe beta-cellen uit een Ngn3 uitdrukken embryonale-type endocrine voorlopercellen cel en van de proliferatie van reeds bestaande en de nieuw gevormde beta-cellen die gevoelig zijn zonder "rust periode"-duplicatie opnieuw zijn. 11,15

Bètacellen neogenese en toepassing op schade modellen, zoals pancreatectomy 6,7,16-19 en selectieve ablatie van betacellen 20 zijn uitgebreid beschreven. De regeneratieve uitkomst these modellen wordt beïnvloed door de omvang van de toegebrachte schade en is geassocieerd met een verlaagde initiële beta-celmassa 21. PDL is een chirurgische model waarbij de eerste beta celmassa niet wordt aangetast en beta-cel neogenese en proliferatie strikt worden geactiveerd. Inderdaad, in de pancreas van muizen die PDL ondergaan, Ngn3 expressie geïdentificeerd zijn bij de epitheliale bekleding van het kanaal. Deze cellen kunnen worden geïsoleerd uit de pancreas van geligeerde neurogenine-3 GFP transgene muizen via fluorescentie geactiveerde celsortering (FACS) en kunnen differentiëren tot functionele beta-cellen na enting in en ex vivo kweken van de pancreas van E12.5 Ngn3 - / - . muizen 11 Ook in Ngn3 CreERT;. R26 YFP muizen die in cellen die de Ngn3 gen geactiveerde permanent worden gelabeld na tamoxifen injectie, zijn label-positieve neurogenine-3 cell afgeleide beta-cellen waargenomen na PDL 15 Bovendien nieuw gevormde beta-cellen te verdunnen pre -existing beta-cellen en bij voorkeur vinden in kleine eilandjes binnen die beta-cellen vertonen hoge proliferatie potentieel. 15 Ngn3 is belangrijk voor de beta-cel expansie na PDL sinds gedaald Ngn3 expressie met behulp van target-specifieke korte-hairpin RNA aanzienlijk vermindert betacelmassa en betaceldeling na PDL. 11 Met name de fractie van neurogenine-3 cel afgeleide beta-cellen en de betacelmassa na PDL kritisch afhankelijk van het niveau van de Ngn3 inductie 15. Dit komt overeen met de waarneming dat hoge Ngn3 expressie is een kritieke stap voor endocriene commitment van multipotente progenitorcellen alvleesklier tijdens ontwikkeling van de alvleesklier 22 Bovendien selectieve ablatie van Ngn3 expressie brengende cellen door difterie-toxine toediening aan Ngn3 CreERT,. R26 iDTR muizen leidt tot verlaagde insulinegehalte en verminderde proliferatie beta cellen, vooral in kleine eilandjes. 15

Ngn3 duct cellen na PDL is bevestigd door vele 11,15,16,23,24, Ngn3 expressie in eilandjes cellen 24,25 en verschillen in resultaat van PDL uitgedaagd onze aanvankelijke waarnemingen van de toegenomen betacelmassa 26,27, het uiterlijk van de Ngn3 uitdrukken-duct afkomstig endocriene voorlopers 24,26,28,29, en verhoogde betaceldeling 27 na PDL. 30

Deze tegenstrijdige resultaten kunnen, tenminste gedeeltelijk, worden vooral toegeschreven aan een combinatie van factoren, waaronder variaties in de post-operatieve tijdspunten analyse, lichaamsgewicht, geslacht en leeftijd van de muizen, postoperatieve fysiologische en milieuomstandigheden en, verschillen in operatietechniek. 30 In onze handen, betaceldeling, insulinegehalte, beta celvolume en het aantal kleine eilandjes consistent verhoogd na PDL. OokNgn3 mRNA constant toeneemt, maar er zijn grote verschillen in de Ngn3 mRNA expressie tussen PDL staart pancreases, waarvoor we hebben geen directe verklaring. Onze hypothese was dat het niveau van Ngn3 mRNA kunnen correleren met de mate van beta cel neogenese van niet-bètacellen 15, maar dat moet nadere onderbouwing. Hoewel niet alle experimentele variaties te verwijderen, een gestandaardiseerde werkwijze voor het uitvoeren PDL chirurgie zorgt voor een betere uniformiteit van de resultaten en opent nieuwe wegen in studying betaceldeling en neogenese.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle manipulaties volgen de door het Europees Verdrag voor de bescherming van gewervelde dieren die voor experimentele en andere wetenschappelijke doeleinden richtlijnen (ETS 123 en en 2010/63 / EU).

1. Voorbereiding van de Work Area

  1. Zorg voor een speciale voorbereiding, een chirurgische en een herstel gebied.
  2. Het gedrag van de gehele chirurgische procedure in een laminaire stroming kabinet om milieuverontreinigende stoffen te minimaliseren.
  3. Monteer de leveringen (zoals vermeld in Materialen en Methoden) nodig over de voorbereiding, chirurgische en recovery gebied, met behulp van de juiste aseptische techniek.
  4. Zorg ervoor dat de chirurgische instrumenten voorafgaand aan de operatie worden geautoclaveerd.
  5. Zorg voor een recirculerende water verwarming pad bij een temperatuur van 38 ° C voor de temperatuur stabilisatie tijdens de operatie. Bedek de verwarming pad met een steriele waterdichte pad.
  6. Geef een werkende microscoop met een vergroting van ten minste 6.3X.
  7. Gebruik een instrument sterilizer, zoals een hete kraal sterilisator, om instrumenten te steriliseren tussen chirurgische procedures.
  8. Bereid een herstel gebied dat bestaat uit een grote kooi, omzoomd door vlakke papier beddengoed

2. Voorbereiding van de dieren voor Heelkunde

  1. Voor PDL en sham operatie, gebruik 8 weken oude mannelijke muizen, ondergebracht in standaard kooien en onderhouden op een 12 uur licht / 12 uur donker cyclus en gevoed met een standaard dieet knaagdieren ad libitum.
    Let op: Hier gebruiken we BALB / cJrJ muizen, maar we hebben ook met succes andere stammen en diverse transgene stammen gebruikt.
  2. Gebruik Buprenophine als preëmptieve analgetica (0,05-0,1 mg / kg) 30 min voorafgaand aan de operatie.
  3. Verdoven de muizen door intraperitoneale injectie van 100 mg / kg ketamine en 5-10 mg / kg xylazine.
  4. Beoordelen juiste verdoving door het observeren van een geleidelijke verlies van vrijwillige beweging en ontspanning van de spieren. Test het verlies van reflexen door teen knijpen.
  5. Breng oogzalf te prevent droogheid van de ogen terwijl onder verdoving.

3. Chirurgische Site Voorbereiding

  1. Ontsmet thorax en buik met een antiseptische chloorhexidine oplossing.
  2. Scheer een gebied van 2,5 cm x 1,5 cm van het abdomen.
  3. Ontsmet het geschoren gebied met behulp van gaas doordrenkt met chloorhexidine oplossing, dan alcohol oplossing en een uiteindelijke toepassing van chloorhexidine oplossing.
  4. Plaats het dier in het chirurgische gebied, zodat de bereide operatieplaats opwaarts is gericht de chirurg.
  5. Drapeer de muis met behulp van een waterdichte chirurgische doek met een opening dat de ontsmette buikstreek blootgesteld, terwijl die van de rest van het lichaam naar een steriele werkveld creëren verlaat. Controleer de muis vóór de procedure diepte van de anesthesie.

4. alvleesklierbuis Ligatie

  1. Laparotomie
    1. Een bovenste middellijn incisie in de huid zich vanaf de processus xiphoideus de umbilicus met een sterielechirurgisch mes. Scheid de onderliggende linea alba en peritoneum met steriele scharen om de bovenbuik kwadrant bloot.
    2. Voorkom uitdroging van de inwendige organen door regelmatige besprenkelen met een steriele 0,9% natriumchloride.
    3. Het gebruik van steriel pincet of wattenstaafje, trekken de maag superieur, het blootstellen van de milt en de milt kwab (de staart regio) van de alvleesklier.
    4. Voorzichtig schuif de duodenum en een deel van het proximale jejunum rechts bovenbuik kwadrant hoofd, hals en lichaamsgebied van de pancreas waarop de viscerale peritoneum bloot.
  2. Ligatie
    1. Zoek de anatomische positie van de pancreas hoofdkanaal in het halsgebied van de pancreas.
    2. Incise de viscerale peritoneum en de gastrocolic ligament, het verlenen van toegang tot de retroperitoneum, het blootstellen van het lichaam en de staart regio van de alvleesklier. Om het halsgebied bloot voeren een Kocher manoeuvre. Til de twaalfvingerige darm en het hoofd van dede pancreas van de retroperitoneum te verheffen van de inferior vena cava en aorta hieronder.
    3. Plaats de spatel onder de nek voorzichtig. Afbinden de alvleesklierbuis met 6-0 Prolene draad aan de linkerkant van de poortader dat de gastro-duodenale en milt lobben scheidt.
    4. Voer een tweede ligatie in de nabijheid van de eerste ligatie zodat de lobben adequaat gescheiden.
    5. Ligeren voorzichtig om de onderliggende bloedvaten, namelijk de superieure pancreaticoduodenalis slagader, de onderste pancreaticoduodenalis slagader en de pancreas deel van de milt ader niet te beschadigen.
    6. Plaats de organen weer in de buikholte.
    7. Sluit de incisie met behulp 4-0 polyglycol filamenteuze garen in een continue hechting patroon voor de spier / peritoneale laag en discontinu hechtdraad patroon voor de huid.

5. Sham Surgery

  1. Voer alle stappen als debeschreven in de stappen 1 tot en met 4.1.4. Terwijl de pancreas wordt belicht, niet ligatie van de ductus pancreaticus voeren.
  2. Aan het einde van stap 4.1.4, van interne organen weer in de buikholte.
  3. Sluit de incisie zoals beschreven in 4.2.7.

6. Post-operationele Zorg en Monitoring

  1. Na de chirurgische procedure voltooid is, plaatst de muis in het herstelgebied. Deze bestaat uit een kooi geplaatst op een verwarmingselement en bekleed met platte papieren beddengoed om de normale lichaamstemperatuur te handhaven.
  2. Zorg voedingsondersteuning postoperatieve hypoglycemie vermijden door bevochtigd voer die op de kooibodem. Voor dit doel, gebruiken standaard knaagdieren dieet pellets geweekt in water tot ze zacht worden.
  3. Zorg vloeistof steun van de bevochtigde voedsel en zorgen voor water ad libitum.
  4. Gebruik Buprenophine zoals analgesie (0,05-0,1 mg / kg) tweemaal per dag gedurende 2 dagen na de operatie. Gedurende de gehele experimentele, follow-up, OBSERVe de muizen voor het optreden van de mogelijke tekenen van infectie, waaronder afscheiding van vloeistof of pus uit de wond, of voor de fysieke achteruitgang gekenmerkt door een vermindering van de verzorging gedrag en activiteitenniveau, lagere eetlust en gewichtsverlies.

7. Evaluatie van succesvolle PDL en de Oogst van PDL Tail en Sham Tail alvleesklier

  1. Euthanaseren muizen door cervicale dislocatie.
  2. Re-shave de buikstreek om carry-over van bont te voorkomen.
  3. Open de buikhuid en de spierlaag en verwijderen van een groot deel van de huid en spieren goede toegang tot de pancreas verkrijgen.
  4. Steriele pincet of wattenstaafje wordt de maag craniaal teruggetrokken, waardoor de milt en milt kwab (het staartgebied) van de pancreas.
  5. Trek de twaalfvingerige darm en een deel van de bovenste jejunum aan de gastro-duodenale kwab (hoofd regio) van de alvleesklier bloot.
    Opmerking: De afgebonden gedeelte van de PDL pancreas is nu verkleind en is bijna gewordendoorzichtig zodat eilandjes zijn zichtbaar als kleine witte stippen. Het hoofd gedeelte van de alvleesklier is ondoorzichtig roze en verschillende exocriene lobuli kan worden waargenomen.
  6. Met een steriele schaar, scheid de geligeerde staartgedeelte van de pancreas van de milt, door snijden langs de milt. Losgesneden het bindweefsel verbindt het staartgebied van de alvleesklier om de interne organen.
  7. Snijd de PDL staartgebied vlak voor de ligatie, exclusief de ligatuur en het weefsel onmiddellijk naast deze uit het geoogste weefsel.
  8. Om schijnvertoning staart weefsel te isoleren, volgt u de stappen 7.1 tot 7.5. Met behulp van een steriele schaar scheiden de staart regio van de schijnvertoning alvleesklier uit de milt door te snijden langs de milt. Isoleer de staart regio door te snijden in de hals gebied van de alvleesklier en het lossnijden van het bindweefsel het aansluiten van de staart van de alvleesklier om de interne organen
    Opmerking: Zowel de staart en het hoofd regio van de sham alvleesklier zijn ondoorzichtig roze, om beide delen afzonderlijk te isoleren,snijd de alvleesklier in de nek regio.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PDL induceert acinaire atrofie en ontsteking, maar heeft geen invloed op het lichaamsgewicht en de glycemie

In 8 weken oude mannelijke BALB / c-muizen, wordt de buis afvoeren van het exocriene enzymen uit de staart van de pancreas geligeerde terwijl het orgel hoofd gelegen naast de maag en twaalfvingerige darm, blijft onaangetast. Leeftijd, geslacht en gewicht aangepaste mannelijke BALB / c muizen vertonen sham operatie indient alle fasen van gedeeltelijke duct ligatie operatie, behalve de ligatie van de ductus pancreaticus. Pancreas weefsel werd geoogst 3, 7, 14, 30 dagen na de ingreep.

Wanneer PDL juist wordt uitgevoerd, muizen gezond lijken en geen significant verschil in lichaamsgewicht (figuur 1A) of glycemie niet vertonen (Figuur 1B) vergeleken met schijn-geopereerde muizen. Exocriene acinaire weefsel geleidelijk verloren na PDL operatie (Figuur 2A-E), resulterend in een vermindering in grootte en gewicht van de geligeerde gedeelte van het P DL alvleesklier (figuur 3), vanaf hier zogenaamde PDL staart. Drie dagen na PDL, acinair weefselmorfologie raakt verstoord en acinaire cellen ondergaan apoptose (figuur 4) en zijn waarschijnlijk opgeslokt door CD45 + infiltrerende immuuncellen (Figuur 5). Op dag 7 na PDL zijn veel acinaire melkklieren vervangen door fibrose (figuur 6) en vetweefsel (Figuur 2C-E), terwijl de resterende acinaire cellen ondergaan acinaire naar ductale metaplasie. Tegen dag 14 na PDL, bijna alle acinaire lobuli ontberen acinaire cellen (Figuur 2A-E) waardoor de PDL staart pancreas doorschijnend zodat eilandjes zichtbaar voor het blote oog (figuur 3). Samenvalt met de initiatie van acinaire apoptose, is een toename van celcyclusactiviteit van het ductale epitheel waargenomen (Figuur 7).

PDL induceert een toename van de insuline + beta celvolume

nhoud "> Twee weken na PDL het totale volume beta cel PDL tail verdubbeld in vergelijking met niet-geligeerde Sham tail. Beta celvolume wordt gekwantificeerd door de INS + gebied 4 pm secties 36 urn uit elkaar verspreid over de gehele weefsel goed voor 10% van het totale volume pancreas. PDL induceert een toename insulinegehalte twee weken na operatie in vergelijking met niet geligeerde pancreas zoals kan worden aangetoond door geautomatiseerde gehele -Tissue optische tomografie (OPT). 15 Omdat beta celgrootte wordt niet gewijzigd na PDL de toename in beta celvolume is het gevolg van een toename van het aantal bèta-cellen.

PDL induceert een toename in beta-cel proliferatie en activatie van expressie Ngn3

Betaceldeling wordt geanalyseerd door immunohistochemie (IHC) kleuring in pancreata geoogst 7 dagen en 14 dagen na Sham of PDL operatie. Het percentage van de beta-cellen positief voor proliferatie marker Ki-67 wordt gekwantificeerd door inspectie van afzonderlijke cellen in een niet-geautomatiseerde wijze. Bij 7 en 14 dagen na operatie PDL wordt betaceldeling in PDL tail significant verhoogd vergeleken met niet geligeerde pancreas.

Binnen 3 dagen na PDL de expressie van de embryonale eilandje progenitor marker Ngn3 significant verhoogd in PDL tail vergeleken met niet- geligeerde pancreas. Maximale niveaus van Ngn3 transcript werden bereikt binnen 1 week en vervolgens langzaam afgenomen. We routinematig meten Ngn3 genactivering met het uitspreken van het niveau van de neurogenine-3 coderend mRNA in PDL alvleesklier ten opzichte van de stabiele Ngn3 niveau in de twaalfvingerige darm. We hebben onlangs voorgesteld dat de mate van neogenese in PDL zou kunnen afhangen van het niveau van Ngn3 genactivering. 15,30

Figuur 1
Figuur 1. PDL geen invloed lichaamsgewicht of glycemie. Lichaamsgewicht (g) (A) en glycemie (mg/ DL) (B) van schijn-geopereerde (witte balken) en PDL muizen (zwarte staven) werd gemeten op verschillende tijdstippen (dag 0, 7, 14 en 30) na de operatie en geen significant verschil tussen schijn en PDL tonen bediend muizen op elk tijdstip. Afbeelding oorspronkelijk gepubliceerd door Xu et al., 2008. 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2. PDL leidt tot een geleidelijk verlies van acinaire cellen. Morfologische veranderingen van PDL tail pancreas geopenbaard door hematoxyline-eosine kleuring op dag 3 (B), 7 (C), 14 (D) en 30 (E) na de operatie, vergeleken met schijn-geopereerde tail pancreas (A). Op 3 dagen na ligatie, kan alleen een subtiel verstoring van de acinaire weefsel te oBServed (B). Op 7 dagen na ligatie wordt acinair weefsel ernstig verstoord en ductale complexen gevormd (C). Op 14 dagen na ligatie, enkele acinuscellen blijven en acinar lobuli worden vervangen door ductal structuren, een vezelig netwerk en adipocyten (aangegeven met een sterretje (*) in paneel C en E). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .

Figuur 3
Figuur 3. PDL staart bij de oogst. Sham staart (A) en PDL staart (B) geoogst op dag 14 na de operatie. PDL staart wordt drastisch verminderd in omvang ten opzichte van Sham staart. Foto (C) toont PDL staart op dag 14 na de operatie in situ. Door het verlies van acinaire cellen, de PDL staartverschijnt doorschijnend, de belangrijkste alvleesklierbuis is duidelijk zichtbaar (aangegeven met zwarte pijl) en eilandjes zijn zichtbaar als kleine witte stippen (aangegeven met witte pijl). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 4
Figuur 4. PDL induceert acinar apoptose. Immunokleuring voor gesplitste-caspase 3 in PDL staart op 3, 7 en 14 dagen na de ingreep laat apoptotische lichamen in de acinar compartiment op dag 3 en dag 7 na de operatie, terwijl de acinaire cellen zijn vrijwel afwezig PDL staart op dag 14. Vergroting bars zijn 25 pm. Afbeelding oorspronkelijk gepubliceerd door Xu et al., 2008. 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

= "Figuur 5" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig5.jpg" />
Figuur 5. PDL induceert immune infiltratie. Immunokleuring voor de leukocyten marker CD45, die de aanwezigheid van een groot aantal immuuncellen in PDL tail 7 dagen na operatie in vergelijking met placebo pancreas. Vergroting bars zijn 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 6
Figuur 6. PDL fibrose induceert. Immunokleuring voor alfa gladde spieractine toont de aanwezigheid van een vezelig netwerk PDL staart 14 dagen na operatie in vergelijking met placebo pancreas. Vergroting bars zijn 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

</ Html"Figuur 7" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg" />
Figuur 7. PDL induceert een toename kanaal celproliferatie. Dubbele immunokleuring kanaalsysteem cel cytokeratine 19 (CK19) en de proliferatie merker BrdU toont een toename celcyclusactiviteit van ductale cellen. Vergroting bars zijn 25 pm. Afbeelding oorspronkelijk gepubliceerd door Xu et al., 2008. 11. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0.9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki-67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaw, J. E., Sicree, R. A. Global estimates of the prevalence of diabetes for. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants. Lancet. 378, 31-40 (2011).
  3. Borowiak, M., Melton, D. A. How to make beta cells. Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).
  4. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, 41-46 (2004).
  7. Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, 817-826 (2007).
  8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth. Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).
  9. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance. PLoS Biol. 5, e163 (2007).
  10. Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development. 137, 3205-3213 (2010).
  11. Xu, X., et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132, 197-207 (2008).
  12. Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats. Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).
  13. Yasuda, H., et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice. Journal of interferon, & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).
  14. Van Gassen, N., et al. Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas. European journal of immunology. (2015).
  15. Van de Casteele, M., et al. Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas. Cell Death Dis. 4, e523 (2013).
  16. Xiao, X., et al. No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas. The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).
  17. Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1. Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).
  18. Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes. 55, 269-272 (2006).
  19. Bonner-Weir, S., Sharma, A. Pancreatic stem cells. The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).
  20. Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).
  21. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).
  22. Wang, S., et al. Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas. Developmental biology. 339, 26-37 (2010).
  23. Pan, F. C., et al. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140, 751-764 (2013).
  24. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  25. Wang, S., et al. Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).
  26. Kopinke, D., et al. Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas. Development. 138, 431-441 (2011).
  27. Rankin, M. M., et al. beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice. Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).
  28. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  29. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  30. Van de Casteele, M., et al. Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond. Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).
  31. Zhang, J., Rouse, R. L. Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice. Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).
  32. Martinez-Romero, C., et al. The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).
  33. Prevot, P. P., et al. Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia. Gut. 61, 1723-1732 (2012).
Chirurgische Letsel aan de muis alvleesklier door middel Ligatie van de alvleesklierbuis als een model voor Endocriene en Exocrine herprogrammeren en proliferatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).More

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter