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Medicine

Chirurgische Verletzung des Maus-Pankreas durch Ligatur des Pankreasganges als Modell für endokrine und exokrine Reprogrammierung und Proliferation

doi: 10.3791/52765 Published: August 7, 2015

Abstract

Ausbau der pankreatischen Betazellen in vivo oder ex vivo, oder die Erzeugung von Beta-Zellen durch die Differenzierung von embryonalen oder adulten Stammzellen können neue erweiterbare Quellen von Beta-Zellen, um die Spenderknappheit in der menschlichen Inseltransplantation als Therapie für Diabetes zu lindern. Obwohl die jüngsten Fortschritte auf dieses Ziel gemacht, Mechanismen, die Beta-Zell-Expansion und Differenzierung von einer Stamm- / Vorläuferzellen regulieren bleiben zu charakterisieren. Hier beschreiben wir ein Protokoll für einen Verletzungsmodell in der erwachsenen Maus Bauchspeicheldrüse, die als Werkzeug zum Mechanismen Geweberemodellierung und Beta-Zellproliferation und Differenzierung zu studieren funktionieren kann. Teilkanal Ligatur (PDL) ist eine experimentell induzierte Schädigung des Nagetier Pankreaszystadenom chirurgische Ligation des Bauchspeicheldrüsenhauptgang, was zu einer Verstopfung der Drainage exokriner Produkte aus dem Heckbereich des Pankreas. Der zugefügte Schaden induziert acinar Atrophie, Immunzelle infiltration und schwere Gewebeumbau. Wir haben bereits berichtet, die Aktivierung von Neurogenin (NGN) 3 exprimierenden endogenen Vorläufer-ähnlichen Zellen und eine Erhöhung der beta-Zellproliferation nach der PDL. Daher stellt PDL eine Grundlage, um Signale in der Betazelldynamik involviert und die Eigenschaften eines Hormonvorläufer in adulten Pankreas studieren. Da bleibt es weitgehend unklar, welche Faktoren und Signalwege tragen zur Beta-Zell-Neubildung und Proliferation in PDL wird ein standardisiertes Protokoll für PDL zum Vergleich in Labors zu ermöglichen.

Introduction

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Die zunehmende Prävalenz von Diabetes, die mehr als 300 Millionen Menschen weltweit 1,2 hat die Suche nach neuen Quellen der Insulin-produzierenden Beta-Zellen verstärkt, sowohl in vitro als auch in vivo, um die mangelhafte Betazellmasse wieder aufzufüllen. 3 bezeichnet die Schlüsselfiguren Mechanismen und Faktoren, die Beta-Zellproliferation und der Betazellneubildung, dh, die Differenzierung von B-Zellen vor einer Nicht-Beta-Zellen oder Vorläuferzellen regulieren können neue Ziele für die Entwicklung von Diabetes in regenerativer Therapien bereitzustellen.

In den Entwicklungs Nagetier Pankreas, alle der endokrinen Zelltypen aus einer Population von transienten endokrine Vorläuferzellen, den Transkriptionsfaktor Neurogenin3 (Ngn3) exprimieren. 4,5 Im erwachsenen Nager Pankreas, unter normalen physiologischen Bedingungen ist die Betazellmasse bei einer optimalen Zahl gehalten, um Stoffwechselanforderungen zu erfüllen. Änderungen in der Beta-Zellgröße,Apoptose und Replikation sind die Hauptmechanismen für beta-Zellexpansion und turn-over. 6-8 wenn das Potenzial der Beta-Zellen, die unter normalen physiologischen Bedingungen vermehren sich im gesamten Population homogen, 9 ihre Proliferationsrate niedrig und Wieder Replikation durch eingeschränkt ein dynamischer Ruhe Zeitraum oder Refraktärzeit 6,7, nach Alter und Glukosestoffwechsel beeinflusst. 10 Da endokrine Vorläuferzellen wurden bisher nicht in der normalen erwachsenen Bauchspeicheldrüse identifiziert wird Neogenese gedacht, um nicht in den normalen Erwachsenen Beta-Zell-Wachstum beitragen. 8

Daher ist die Identifizierung eines fakultativen endokrine Vorläuferzellen im erwachsenen Bauchspeicheldrüse, ausbaubar und erbringt die neuen beta-Zellen würde eine neue, möglicherweise unbegrenzte Quelle von Beta-Zellen zu liefern.

Teilkanal-Ligation (PDL) ist ein Tiermodell, das Verletzung beschrieben worden ist, um Beta-Zellen zu induzieren neogenesis im erwachsenen Bauchspeicheldrüse. 11,12 In diesem Modell wird die Hauptpankreasgang Ablassen des Pankreasschwanz operativ verknüpft. Die resultierende Behinderung der exokrinen Drainage induziert große Gewebeumbau, begleitet von Entzündung und Azinuszellen Atrophie distal zur Ligation. 12-14 In dieser entzündlichen Umgebung Reexpression des endokrinen Vorläufermarker Ngn3 induziert und die Beta-Zellvolumen erhöht zweifache . Diese Verdopplung in Betazellvolumen ergibt sich aus der Generation der neuen Beta-Zellen aus einer embryonalen Ngn3-type endokrine Vorläuferzellen und Proliferation von bereits bestehenden und neu gebildeten Beta-Zellen, die anfällig für ohne "Ruheperiode"-Duplizierung wieder sind Ausdruck zu bringen. 11,15

Beta-Zell-Neubildung und Replikation in Verletzung Modellen wie Pankreatektomie 6,7,16-19 und selektiver Ablation der Betazellen 20 sind ausführlich beschrieben. Allerdings ist die regenerative Ergebnis in these-Modellen wird durch das Ausmaß der Schäden beeinflusst und ist mit einer verringerten Ausgangsbetazellmasse 21 verbunden. PDL ist ein chirurgischer Modell, in dem die ersten Beta-Zellmasse ist nicht betroffen und Beta-Zell-Neubildung und Proliferation sind robust aktiviert. Tatsächlich im Pankreas von Mäusen, die PDL unterzog, Ngn3-exprimierenden Zellen in der Nähe der Epithelauskleidung des Kanals identifiziert. Diese Zellen können aus den ligierten Pankreas Ngn3-GFP-transgenen Mäusen unter Verwendung von Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS) isoliert werden und können gegenüber funktionellen beta-Zellen differenzieren folgenden Transplantation in und ex vivo Kultur der Bauchspeicheldrüse von E12.5 Ngn3 - / - . Mäuse 11 Ähnlich in Ngn3 CreERT;. R26 YFP Mäuse, bei denen Zellen, die Ngn3-Gen aktiviert werden permanent nach einer Tamoxifen-Injektion werden Label-positive Ngn3-Zellen abgeleiteten Beta-Zellen nach der PDL erfasst markierten 15 Außerdem neu gebildete Beta-Zellen zu verdünnen pre -existing Beta-Zellen und bevorzugt in kleinen Inseln, in dem Beta-Zellen zeigen eine hohe Proliferationspotential zu lokalisieren. 15 Ngn3 ist wichtig für die Beta-Zell-Expansion nach PDL seit verringert Ngn3-Expression unter Verwendung zielspezifische Kurzhaarnadel-RNA Betazellmasse und Beta-Zell-Proliferation nach deutlich verringert PDL. 11 Bemerkenswert ist, der Anteil an Ngn3 Zellen abgeleitete beta-Zellen und die Betazellmasse nach PDL hängt entscheidend von der Höhe der Induktions Ngn3 15. Dies ist im Einklang mit der Beobachtung, dass hohe Ngn3-Expression ist ein entscheidender Schritt für die endokrine Engagement von multipotenten Vorläuferzellen der Bauchspeicheldrüse bei Bauchspeicheldrüsenentwicklung 22 Darüber hinaus selektive Ablation von Ngn3-exprimierenden Zellen von Diphtherie-Toxin Verabreichung an Ngn3 CreERT;. R26 IDTR Mäuse führt zu einer verringerten Insulingehalt und verminderte beta-Zellproliferation, insbesondere bei kleinen Inseln. 15

Ngn3-Expression in Gangzellen nach der PDL ist von vielen 11,15,16,23,24 bestätigt, Ngn3-Expression in Inselzellen 24,25 und Diskrepanzen im Ergebnis der PDL in Frage gestellt unseren ersten Beobachtungen erhöhter Betazellmasse 26,27, Aussehen Ngn3 ausdrücken Kanal stamm endokrine Vorläuferzellen 24,26,28,29 und erhöhte Beta-Zell-Proliferation 27 nach PDL. 30

Diese widersprüchlichen Ergebnisse könnten, zumindest teilweise, auf eine Kombination von Faktoren, einschließlich Variationen in den postoperativen Zeitpunkten der Analyse, Körpergewicht, Geschlecht und Alter der Mäuse, postoperative physiologischen und Umweltbedingungen und vor allem zurückzuführen, Unterschiede in der chirurgischen Technik. 30. In unseren Händen, beta-Zell-Proliferation, Insulingehalt, Betazellvolumen und die Anzahl der Inselchen konsequent nach PDL erhöht. AuchNgn3 mRNA konsequent erhöht, aber es gibt große Unterschiede in der Ngn3-mRNA-Expression zwischen PDL Schwanz Bauchspeicheldrüsen, für die wir keine direkte Erklärung. Wir nahmen an, dass die Höhe der Ngn3 mRNA könnte mit dem Grad der Beta-Zell-Neubildung aus Nicht-Beta-Zellen 15 zu korrelieren, aber das muss weitere Begründung. Obwohl es alle experimentellen Variationen nicht zu entfernen, ein standardisiertes Verfahren zur Durchführung PDL Operation ermöglicht eine bessere Einheitlichkeit Ergebnisse und eröffnet neue Wege bei der Untersuchung Beta-Zell-Proliferation und Neubildung.

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Protocol

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Alle Manipulationen folgen Sie den von der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren für Versuche und andere wissenschaftliche Zwecke verwendeten erlassenen Richtlinien (ETS 123 und und 2010/63 / EU).

1. Vorbereitung der Arbeitsbereich

  1. Verwenden Sie geeignete Vorbereitungsbereich, eine OP-Bereich und einen Wiederherstellungsbereich.
  2. Führen das gesamte chirurgische Verfahren in einer Sterilbank, um Umweltverunreinigungen zu minimieren.
  3. Montieren Sie die Lieferungen über die Vorbereitung, OP-und Recovery-Umgebung benötigt (wie in Materialien und Methoden aufgeführt), die über geeignete aseptische Technik.
  4. Sicherzustellen, dass das chirurgische Werkzeug vor dem Eingriff autoklaviert.
  5. Geben Sie eine Wasserkreislauf Heizkissen bei einer Temperatur von 38 ° C für die Temperaturstabilisierung während der Operation. Decken Sie das Heizkissen mit einer sterilen wasserdichte Unterlage.
  6. Stellen ein Operationsmikroskop mit einer Vergrößerung von wenigstens 6.3x.
  7. Verwenden Sie ein Instrument steriLizer, wie ein Heiß Wulst Sterilisator Instrumente zwischen chirurgischen Prozeduren zu sterilisieren.
  8. Bereiten Sie einen Wiederherstellungsbereich, bestehend aus einem großen Käfig, durch flache Papier Betten gesäumt

2. Vorbereitung der Tiere für Chirurgie

  1. Für PDL und Scheinoperation, verwenden Sie 8 Wochen alten männlichen Mäusen, in Standardkäfigen untergebracht und auf einem 12 Stunden Licht / 12 h Dunkel-Zyklus gehalten und ein Standard-Nagerfutter ad libitum gefüttert.
    Hinweis: Wir nutzen hier BALB / cJrJ Mäusen aber wir haben auch erfolgreich andere Stämme und verschiedene transgene Stämme verwendet.
  2. Verwenden Buprenophine als preemptive Analgesie (0,05 bis 0,1 mg / kg) 30 min vor der Operation.
  3. Betäuben die Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg / kg Ketamin und 5 bis 10 mg / kg Xylazin.
  4. Beurteilen Sie die richtige Betäubung durch Beobachtung allmählichen Verlust der willkürlichen Bewegungen und Muskelentspannung. Testen Sie den Verlust von Reflexen durch toe Kneifen.
  5. Bewerben Augensalbe zu prevent Trockenheit der Augen während der Narkose.

3. Chirurgische Standortvorbereitung

  1. Desinfizieren Sie Thorax und Abdomen mit antiseptischen Lösung Chlorhexidin.
  2. Rasieren Sie sich über eine Fläche von 2,5 cm x 1,5 cm des Bauches.
  3. Desinfizieren Sie die rasierte Fläche mit Gaze mit Chlorhexidin-Lösung, dann Alkohollösung und einer abschließenden Anwendung von Chlorhexidin-Lösung getränkt.
  4. Positionieren Sie das Tier in den OP-Bereich, so dass die vorbereitete Operationsstelle nach oben mit Blick auf den Chirurgen.
  5. Hängen Sie die Maus mit einem wasserfesten chirurgischen Abdeckung mit einer Öffnung, die das desinfizierte Bauchregion ausgesetzt, während für den Rest des Körpers, um ein steriles Arbeitsfeld zu erzeugen lässt. Überwachen der Maus vor dem Verfahren zur Tiefe der Anästhesie.

4. Pankreasgangligation

  1. Laparotomie
    1. Bilden eine obere Mittellinieneinschnitt in der Haut, die sich von dem Schwertfortsatz zu dem Hauptstrang mit einer sterilenSkalpell. Trennen Sie die zugrunde liegenden Linea alba und das Bauchfell mit Hilfe einer sterilen Schere, um den Oberbauch freizulegen.
    2. Verhindern ein Austrocknen der inneren Organe durch regelmäßige Besprühen mit steriler 0,9% Natriumchlorid.
    3. Mit einer sterilen Pinzette oder Tupfer, zurückzuziehen den Magen souverän, indem die Milz und die Milz Lappen (Heckbereich) der Bauchspeicheldrüse.
    4. Den Zwölffingerdarm und einen Teil des oberen Leerdarm sanft zurückziehen, um die rechte Oberbauch, den Kopf, Hals und Body-Bereich der Bauchspeicheldrüse durch die viszerale Bauchfell überzogen aus.
  2. Ligation
    1. Finde die anatomische Lage des Pankreashauptkanal im Halsbereich des Pankreas.
    2. Einzuschneiden das viszerale Peritoneum und die gastro Bänder, Zugang zum Retroperitoneum Gewährung, Aussetzen der Körper und Schwanzbereich des Pankreas. Um den Halsbereich freizulegen, führen Sie einen Kocher Manöver. Heben Sie den Zwölffingerdarm und Leiterdie Bauchspeicheldrüse aus dem Retroperitoneum erhebend sie von der unteren Hohlvene und der Aorta unterhalb.
    3. Legen Sie das Spatel unterhalb der Halsbereich. Ligieren der Pankreasgang mit 6-0 Prolene Gewinde an der linken Seite der Pfortader, der die gastroduodenalen und Milz Lappen trennt.
    4. Durchführen einer zweiten Ligation in der Nähe des ersten Ligation, um sicherzustellen, daß die Lappen sind ausreichend voneinander getrennt sind.
    5. Ligieren sehr vorsichtig, um nicht die zugrunde liegenden Blutgefäße, und zwar die überlegene A. pancreaticoduodenalis, die Arteria pancreaticoduodenalis inferior und die Bauchspeicheldrüsen Teil der Milzarterie beschädigen.
    6. Legen Sie die Organe wieder in die Bauchhöhle.
    7. Die Inzision mit 4-0 Polyglykol filamentösen Gewinde in einer kontinuierlichen Nahtmusters für die Muskel / peritoneale Schicht und in einem diskontinuierlichen Nahtmusters für die Haut.

5. Sham Surgery

  1. Führen Sie alle Schritte wie dein den Schritten 1 bis 4.1.4 beschrieben. Während der Pankreas freigelegt ist, nicht durchführen Ligierung des Pankreasganges.
  2. Am Ende von Schritt 4.1.4 Platzieren inneren Organe wieder in die Bauchhöhle.
  3. Die Inzision wie in 4.2.7 beschrieben.

6. Post-operative Pflege und Überwachung

  1. Nach dem chirurgischen Eingriff abgeschlossen ist, legen Sie die Maus in die Wiederherstellungsbereich. Diese besteht aus einem Käfig auf einem Heizkissen, um normale Körpertemperatur gebracht und mit flachen Betten Papier ausgekleidet.
  2. Bieten Unterstützung mit Nahrungsmitteln, um postoperative Hypoglykämie durch angefeuchtet Essen auf dem Käfigboden angeordnet zu vermeiden. Zu diesem Zweck verwenden Standard-Nagerfutter-Pellets in Wasser eingeweicht, bis sie weich zu machen.
  3. Eine Fluid Unterstützung vom angefeuchteten Essen und liefern Wasser ad libitum.
  4. Verwenden Buprenophine als Analgesie (0,05 bis 0,1 mg / kg) zweimal täglich über 2 Tage nach der Operation. Während der gesamten Versuchs, Follow-up, observe die Mäuse für das Auftreten von möglichen Anzeichen einer Infektion, einschließlich der Absonderung von Flüssigkeit oder Eiter aus der Wunde, oder physikalische Beeinträchtigung durch Reduktion in Putzverhalten und Aktivität gekennzeichnet, unteren Appetit und Gewichtsverlust.

7. Evaluierung Erfolgreiche PDL und Ernte der PDL Schwanz und Sham Schwanz Pancreas

  1. Euthanize Mäuse durch Genickbruch.
  2. Bauchbereich Re-Rasur auf Übertragung von Fell zu vermeiden.
  3. Öffnen Sie die Bauchhaut und Muskulatur und entfernen einen großen Bereich der Haut und Muskeln, um einen guten Zugang zu der Bauchspeicheldrüse zu erhalten.
  4. Mit einer sterilen Pinzette oder Tupfer wird der Magen souverän eingefahren, indem die Milz und die Milz Lappen (Heckbereich) der Bauchspeicheldrüse.
  5. Ziehen Sie vorsichtig den Zwölffingerdarm und einen Teil des oberen Leerdarm, den Magen-Zwölffingerlappen (Kopfbereich) der Bauchspeicheldrüse freizulegen.
    Anmerkung: Die ligierte Teil des PDL Pankreas wurde nun verkleinert und ist fast schondurchscheinend, so dass Inseln wie kleine weiße Punkte zu sehen sind. Der Kopfteil des Pankreas opak rosa und deutliche exokrinen lobuli beobachtet werden können.
  6. Verwendung einer sterilen Schere, trenne die ligiert Schwanzteil der Bauchspeicheldrüse aus der Milz, durch Schneiden entlang der Milz. Losgeschnitten das Verbinden der Heckbereich des Pankreas zu den inneren Organen Bindegewebe.
  7. Schneiden den Schwanzbereich PDL direkt vor der Ligation, mit Ausnahme der Ligatur und dem Gewebe unmittelbar benachbart ist aus der geernteten Gewebes.
  8. Um Schein Schwanz Gewebe zu isolieren, führen Sie die Schritte 7.1 bis 7.5. Verwendung einer sterilen Schere trennen den Heckbereich des Schein Bauchspeicheldrüse aus der Milz durch Schneiden entlang der Milz. Isolieren des Schwanzbereich durch Schneiden in den Halsbereich des Pankreas und Schneiden des Bindegewebes Verbinden des Schwanz Bauchspeicheldrüse zu den inneren Organen
    Hinweis: Sowohl der Schwanz und Kopfbereich der Schein Bauchspeicheldrüse sind opak rosa, um beide Teile separat zu isolieren,schneiden Sie die Bauchspeicheldrüse im Halsbereich.

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Representative Results

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PDL induziert acinar Atrophie und Entzündungen aber keinen Einfluss auf das Körpergewicht und Blutzucker

In 8 Wochen alten männlichen BALB / c Mäusen ist der Kanal Entwässerung der exokrinen Enzyme aus dem Schwanz der Bauchspeicheldrüse ligiert, während der Orgel Kopf, befindet sich neben dem Magen und Zwölffingerdarm, bleibt hiervon unberührt. Alter, Geschlecht und Gewicht abgestimmt männlichen BALB / c Mäusen unterziehen Scheinoperation rekapituliert alle Schritte der Teilkanal Ligation Chirurgie, mit Ausnahme der Unterbindung der Pankreasgang. Pankreasgewebe geerntet wurde 3, 7, 14, 30 Tage nach der Operation.

Wenn PDL korrekt durchgeführt ist, werden Mäuse gesund und keinen signifikanten Unterschied in der Körpergewicht (Abbildung 1A) oder Blutzucker zeigen (1B) im Vergleich zu scheinoperierten Mäusen. Exokrinen acinärem Gewebe allmählich nach PDL Chirurgie (2A-E) verloren, was zu einer Verringerung der Größe und des Gewichts des ligierten Teil des P DL Bauchspeicheldrüse (Abbildung 3), ab hier genannt PDL Schwanz. Drei Tage nach der PDL, acinar Gewebemorphologie wird gestört und Azinuszellen Apoptose (Abbildung 4) und werden wahrscheinlich durch die Infiltration CD45 + Immunzellen (Abbildung 5) verschlungen. Am Tag 7 nach PDL sind viele acinar Läppchen von fibrotischen (Abbildung 6) und Fettgewebe (2C-E) während verbleibenden Azinuszellen laufen Azinuszellen zu duktalen Metaplasie ersetzt. Bis zum Tag 14 nach der PDL, die fast alle acinar lobuli frei von Azinuszellen (2A-E) Herstellung der PDL Schwanz Bauchspeicheldrüse erscheinen durchlässig sind, so dass sich kleine Inseln mit dem bloßen Auge sichtbar ist (Abbildung 3). Gleichzeitig mit der Einleitung der azinösen Apoptose wird eine Zunahme in der Zellzyklusaktivität des duktalen Epithel beobachtet (Abbildung 7).

PDL induziert eine Zunahme der Insulin + beta Zellvolumen

NHALT "> zwei Wochen nach der PDL der Gesamt beta Zellvolumen in PDL tail verdoppelt im Vergleich zu nicht-ligierten Sham Schwanz. Beta Zellvolumen durch Messen des INS + Bereich 4 um-Schnitte quantifiziert, 36 um voneinander spannt den gesamten Anteil von Gewebe 10% des gesamten Volumens der Bauchspeicheldrüse. PDL induziert eine Zunahme der Insulingehalt von zwei Wochen nach der Operation im Vergleich zu nicht-ligierten Pankreas kann durch automatisierte ganze -tissue optische Tomographie (OPT). 15. Da der Betazellgröße angezeigt wird nach PDL geändert werden Der Anstieg der Betazellvolumen ist das Ergebnis einer Erhöhung in der Beta-Zellzahl.

PDL induziert eine Zunahme der beta-Zell-Proliferation und Aktivierung der Expression Ngn3

Beta-Zell-Proliferation wird durch immunhistochemische (IHC) Färbung analysiert in Bauchspeicheldrüsen geerntet 7 Tagen und 14 Tagen nach Sham oder PDL Chirurgie. Der Anteil der Beta-Zellen positiv für Proliferationsmarker Ki-67 wird durch in quantifiziertInspektion der einzelnen Zellen in einem nicht-automatisierten Weise. Bei 7 und 14 Tage nach der PDL Chirurgie, beta-Zellproliferation in PDL Schwanz deutlich erhöht, um nicht-ligierten Bauchspeicheldrüse verglichen.

Innerhalb von 3 Tagen nach der PDL der Ausdruck der embryonalen Inselvorläufermarker Ngn3 deutlich in PDL Schwanz stieg im Vergleich zu nicht-ligierten Bauchspeicheldrüse. Maximal Ebenen der Ngn3-Transkripts wurden innerhalb von 1 Woche erreicht und in der Folge verringerte sich langsam. Wir routinemäßig zu messen Ngn3-Gen-Aktivierung durch das Niveau der mRNA Ngn3 kodierenden in PDL Bauchspeicheldrüse relativ zum stabilen Ngn3 Ebene in Duodenum ausdrückt. Wir haben vor kurzem vorgeschlagen, dass das Ausmaß der Neubildung in PDL möglicherweise auf der Ebene der Ngn3-Gen-Aktivierung ab. 15,30

Abbildung 1
Abbildung 1. PDL hat keine Auswirkungen auf das Körpergewicht oder Blutzucker. Körpergewicht (g) (A) und Blutzucker (mg/ DL) (B) von scheinoperierten (weiße Balken) und PDL-Mäusen (schwarze Balken) wurde zu verschiedenen Zeitpunkten (Tag 0, 7, 14 und 30) nach der Operation gemessen und zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen Schein und PDL zeigen betrieben Mäusen zu jedem Zeitpunkt. Abbildung ursprünglich von Xu et al. Veröffentlichten 2008 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 2
Abbildung 2. PDL führt zu einem allmählichen Verlust der Azinuszellen. Morphologische Veränderung von PDL Schwanz der Bauchspeicheldrüse durch Hämatoxylin-Eosin-Färbung am Tag 3 (B), 7 (C), 14 (D) und 30 (E) nach der Operation zeigte, im Vergleich zu scheinoperierten Schwanz der Bauchspeicheldrüse (A). Bei 3 Tage nach der Ligation kann nur eine subtile Störung des acinärem Gewebe o seinbserved (B). 7 Tage nach der Ligation wird acinärem Gewebe schwer gestört und duktalen Komplexe (C) gebildet wird. 14 Tage nach der Ligation paar Azinuszellen bleiben und acinar Lobuli werden von Gangstrukturen ersetzt, ein Fasernetzwerk und Adipozyten (die mit einem Stern (*) in Panel C und E angegeben). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen .

Figur 3
Abbildung 3. PDL Schwanz bei der Ernte. Sham Schwanz (A) und PDL Schwanz (B) am Tag 14 nach der Operation entnommen. PDL Schwanz ist dramatisch verkleinert im Vergleich zu Sham Schwanz. Bild (C) zeigt PDL Schwanz am Tag 14 nach der Operation in situ. Durch den Verlust der Azinuszellen, die PDL tailerscheint lichtdurchlässig, die Hauptpankreasgang ist deutlich sichtbar (mit schwarzer Pfeil) und Inselchen sichtbar als kleine weiße Punkte (mit weißem Pfeil) sind. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 4
Abbildung 4. PDL induziert Apoptose acinar. Immunfärbung für gespaltene Caspase-3 in PDL Schwanz bei 3, 7 und 14 Tage nach der Operation zeigt apoptotische Körper im acinar Fach am Tag 3 und Tag 7 nach der Operation, während Azinuszellen sind fast abwesend PDL Schwanz am Tag 14 Vergrößerung Bars sind 25 um. Abbildung ursprünglich von Xu et al. Veröffentlichten 2008 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5. PDL induziert Immunzellinfiltration. Immunfärbung für den Leukozytenmarker CD45, welches das Vorhandensein einer hohen Anzahl von Immunzellen in PDL Schwanz 7 Tage nach der Operation im Vergleich zu schein Bauchspeicheldrüse. Vergrößerung Bars sind 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Figur 6
Abbildung 6. PDL induziert Fibrose. Immunfärbung für alpha Glattmuskelaktin zeigt die Anwesenheit eines Fasernetzwerkes in PDL Schwanz 14 Tage nach der Operation im Vergleich zu Schein-Pankreas. Vergrößerung Bars sind 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 7 PDL induziert eine Erhöhung Kanal Zellproliferation. Doppel-Immunfärbung für das Kanalzellmarker Cytokeratin 19 (CK19) und für den Proliferationsmarker BrdU zeigt einen Anstieg in der Zellzyklusaktivität von Gangzellen. Vergrößerung Bars sind 25 um. Abbildung ursprünglich von Xu et al. Veröffentlichten 2008 11. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0.9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki-67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

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References

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Chirurgische Verletzung des Maus-Pankreas durch Ligatur des Pankreasganges als Modell für endokrine und exokrine Reprogrammierung und Proliferation
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De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).More

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