Abstract
Expansión de las células beta pancreáticas in vivo o ex vivo, o la generación de las células beta por la diferenciación de una célula madre embrionaria o un adulto, puede proporcionar nuevas fuentes expandibles de las células beta para aliviar la escasez de donantes en el trasplante de islotes humanos como terapia para la diabetes. Aunque los avances recientes se han hecho hacia este objetivo, los mecanismos que regulan la expansión de las células beta y la diferenciación de una célula madre / progenitoras aún no se han caracterizado. Aquí, se describe un protocolo para un modelo de lesión en el páncreas de ratón adulto que puede funcionar como una herramienta para estudiar los mecanismos de la remodelación tisular y proliferación de las células beta y la diferenciación. Parcial ligadura del conducto (PDL) es una lesión inducida experimentalmente del páncreas roedor que implica la ligadura quirúrgica del conducto pancreático principal que resulta en una obstrucción del drenaje de los productos exocrinas fuera de la región de la cola del páncreas. El daño infligido induce atrofia acinar, infilt célula inmuneración y la remodelación tisular grave. Hemos informado anteriormente de la activación de Neurogenina (NGN) 3 que expresan las células progenitoras como endógenos y un aumento en la proliferación de las células beta después de PDL. Por lo tanto, PDL proporciona una base para estudiar señales implicadas en la dinámica de las células beta y las propiedades de un progenitor endocrino en páncreas adulto. Dado que, todavía sigue siendo en gran medida poco clara, que los factores y las vías contribuyen a la neogénesis de células beta y la proliferación en PDL, un protocolo estandarizado para PDL permitirá la comparación entre laboratorios.
Introduction
El aumento de la prevalencia de la diabetes, que afecta a más de 300 millones de personas en todo el mundo 1,2 ha impulsado la búsqueda de nuevas fuentes de células beta productoras de insulina, tanto in vitro como in vivo, para reponer la masa de células beta deficiente. 3 Identificar clave mecanismos y factores que regulan la proliferación de células beta y beta neogénesis de células, es decir, la diferenciación de las células beta a partir de una célula o células progenitoras no beta, pueden proporcionar nuevas dianas para el desarrollo de terapias regenerativas en la diabetes.
En el páncreas de roedores en desarrollo, todos los tipos de células endocrinas diferenciar de una población transitoria de células progenitoras endocrino, que expresa el factor de transcripción Neurogenin3 (Ngn3) 4,5. En el páncreas roedor adulto, en condiciones fisiológicas normales, la masa de células beta es se mantiene a un número óptimo para satisfacer las demandas metabólicas. Los cambios en el tamaño de las células beta,apoptosis y la replicación constituyen los principales mecanismos para la expansión de células beta y turn-over. 6-8 Mientras que el potencial de las células beta a proliferar en condiciones fisiológicas normales es homogénea en toda la población, 9 su tasa de proliferación es baja y re-replicación está restringida por un período dinámico de quiescencia o período refractario 6,7, influenciado por la edad y el metabolismo de la glucosa. 10 Dado que las células progenitoras endocrinas hasta ahora no han sido identificados en el páncreas adulto normal, se cree neogénesis de no contribuir al crecimiento normal de las células beta del adulto. 8
Por lo tanto, la identificación de una célula progenitora endocrino facultativa en el páncreas adulto que es expandible y capaz de producir nuevas células beta podría proporcionar una novela, posiblemente fuente ilimitada de las células beta.
Parcial ligadura del conducto (PDL) es un modelo de lesión de animal que ha sido descrito para inducir neogenesi célula betas en el páncreas adulto. 11,12 En este modelo, el conducto pancreático principal drenaje de la cola del páncreas se une quirúrgicamente. La obstrucción resultante de drenaje exocrino induce importante remodelación del tejido, acompañado por la inflamación y atrofia acinar distal a la ligadura. 12-14 Dentro de este entorno inflamatorio, re-expresión del marcador progenitor endocrino Ngn3 se induce y el volumen de las células beta aumenta de dos veces . Esta duplicación en beta resultados del volumen celular de la generación de nuevas células beta a partir de un Ngn3 expresan de tipo embrionario de células progenitoras endocrino y de la proliferación de las células beta pre-existentes y recién formados que son propensos a volver a la duplicación sin "período de inactividad". 11,15
Neogénesis de células beta y replicación en modelos de lesión, tales como la pancreatectomía 6,7,16-19 y la ablación selectiva de las células beta 20 se han descrito ampliamente. Sin embargo, el resultado regenerativa en thesmodelos e está influenciada por la magnitud de los daños causados y se asocia con una masa de células beta inicial disminuido 21. PDL es un modelo quirúrgico en el que no se ve afectada la masa inicial de las células beta y la neogénesis de células beta y la proliferación se activan robusta. De hecho, en el páncreas de ratones que se sometieron a PDL, las células que expresan Ngn3 se identifican cerca del revestimiento epitelial del conducto. Estas células se pueden aislar a partir de los páncreas de ratones transgénicos ligados Ngn3-GFP usando células activadas por fluorescencia (FACS) y son capaces de diferenciarse hacia células beta funcionales siguiente en el injerto y la cultura ex vivo del páncreas de E12.5 Ngn3 - / - . ratones 11 Del mismo modo, en Ngn3 CreERT;. ratones R26 YFP en el que las células que activan el gen Ngn3 están etiquetados de forma permanente después de la inyección tamoxifeno, las células derivadas de células beta Ngn3 etiquetas positivas se detectan después de PDL 15 Por otra parte, las células beta recién formadas diluir pre -existing células beta y preferentemente localizar en pequeños islotes en el que las células beta muestran un alto potencial de proliferación. 15 Ngn3 es importante para la expansión de las células beta después de PDL ya la disminución de la expresión Ngn3 usando específica de la diana de ARN corto horquilla disminuye significativamente la masa de células beta y la proliferación de las células beta después PDL. 11 En particular, la fracción de células derivadas de células beta Ngn3 y la masa de células beta después de PDL depende críticamente del nivel de Ngn3 inducción 15. Esto está de acuerdo con la observación de que el alto nivel de expresión Ngn3 es un paso fundamental para el compromiso endocrina del páncreas progenitores multipotentes durante el desarrollo de páncreas 22 Además, la ablación selectiva de células que expresan Ngn3 por la administración de la difteria-toxina para Ngn3 CreERT;. Ratones R26 IDTR resultados en el contenido de insulina disminuida y la proliferación de células beta reducido, especialmente en pequeños islotes. 15
Estos resultados contradictorios podrían, al menos en parte, atribuirse a una combinación de factores, incluyendo variaciones en los puntos de tiempo post-quirúrgicas de análisis, el peso corporal, el sexo y la edad de los ratones, condiciones fisiológicas y ambientales postoperatorias y, lo más importante, diferencias en la técnica quirúrgica. 30 En nuestras manos, la proliferación de células beta, contenido de insulina, el volumen de las células beta y el número de pequeños islotes se incrementan constantemente después de PDL. TambiénNgn3 ARNm aumenta constantemente, pero hay grandes diferencias en la expresión de ARNm Ngn3 entre PDL páncreas cola, para los que no tenemos explicación directa. La hipótesis de que el nivel de ARNm Ngn3 podría correlacionar con el grado de neogénesis de células beta a partir de células no beta 15, pero esto requiere de mayor fundamentación. A pesar de que no elimina todas las variaciones experimentales, un método estandarizado para la realización de la cirugía PDL permite una mejor uniformidad en los resultados y abre nuevas vías en el estudio de la proliferación de células beta y neogénesis.
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Protocol
Todas las manipulaciones siguen las directrices emitidas por el Convenio Europeo para la Protección de los animales vertebrados utilizados para experimentación y otros fines científicos (ETS 123 y y 2010/63 / UE).
1. Preparación del área de trabajo
- Proporcionar un área de preparación dedicado, un área quirúrgica y un área de recuperación.
- Llevar a cabo todo el procedimiento quirúrgico en una cabina de flujo laminar para reducir al mínimo los contaminantes ambientales.
- Montar los suministros (como se indica en Materiales y Métodos) necesarios en el área de preparación, quirúrgica y la recuperación, utilizando una técnica aséptica adecuada.
- Asegúrese de que los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave antes de la cirugía.
- Proporcionar una almohadilla de calefacción de agua recirculante a una temperatura de 38 ° C para estabilización de la temperatura durante la cirugía. Cubra la almohada eléctrica con un protector impermeable estéril.
- Proporcionar un microscopio con un aumento de al menos 6.3x.
- Utilice un instrumento sterilizer, tal como un esterilizador de cuentas caliente, para esterilizar los instrumentos en entre procedimientos quirúrgicos.
- Prepare un área de recuperación que consiste en una gran jaula, bordeado por las camas papel plano
2. Preparación de los animales para la cirugía
- Para PDL y cirugía simulada, utilizar 8 semanas de edad ratones machos, alojados en jaulas estándar y mantenidos en un 12 horas de luz / 12 h oscuridad ciclo y alimentados con una dieta ad libitum roedores estándar.
Nota: Aquí, utilizamos ratones BALB / cJrJ pero también hemos utilizado con éxito otras cepas y varias cepas transgénicas. - Utilice buprenorfina como analgesia preventiva (desde 0,05 hasta 0,1 mg / kg) 30 min antes de la cirugía.
- Anestesiar a los ratones por inyección intraperitoneal de 100 mg / kg de ketamina y de 5 - 10 mg / kg de xilazina.
- Evaluar anestesia adecuada mediante la observación de pérdida gradual del movimiento voluntario y la relajación muscular. Prueba de la pérdida de los reflejos por pinzamiento toe.
- Aplicar pomada oftálmica de prevsequedad ent de los ojos, mientras que bajo anestesia.
3. Preparación del sitio quirúrgico
- Desinfectar tórax y el abdomen con una solución de clorhexidina antiséptico.
- Afeitarse un área de 2,5 cm x 1,5 cm del abdomen.
- Desinfectar la zona afeitada con una gasa empapada con una solución de clorhexidina, a continuación, solución de alcohol y una aplicación final de la solución de clorhexidina.
- Coloque el animal en el área quirúrgica para que el sitio quirúrgico preparado esté orientado hacia arriba el cirujano.
- Coloque el ratón usando un paño quirúrgico a prueba de agua con una abertura que deja la región abdominal desinfectada expuesta al tiempo que cubre el resto del cuerpo para crear un campo de trabajo estéril. Monitorear el ratón antes del procedimiento para la profundidad de la anestesia.
4. Conducto pancreático Ligadura
- La laparotomía
- Hacer una incisión en la línea media superior en la piel que se extiende desde la apófisis xifoides hasta el ombligo usando un estérilcuchilla quirúrgica. Separar la línea alba subyacente y el peritoneo con unas tijeras estériles con el fin de exponer el cuadrante abdominal superior.
- Prevenir desecación de los órganos internos por aspersión regular con cloruro de sodio estéril al 0,9%.
- El uso de pinzas o hisopo estéril, retraer el estómago superiormente, exponiendo el bazo y el lóbulo esplénica (la región de la cola) del páncreas.
- Retraer suavemente el duodeno y parte de la parte superior del yeyuno al cuadrante abdominal superior derecha para exponer la cabeza, el cuello y la región cuerpo del páncreas cubiertos por el peritoneo visceral.
- Ligadura
- Busque la posición anatómica del conducto pancreático principal en la región del cuello del páncreas.
- Incisión del peritoneo visceral y el ligamento gastrocólico, la concesión del acceso al retroperitoneo, la exposición de la región del cuerpo y la cola del páncreas. Con el fin de exponer la región del cuello, realizar una maniobra de Kocher. Levante el duodeno y el jefe deel páncreas fuera del retroperitoneo elevándolos de la vena cava y la aorta por debajo inferior.
- Coloque cuidadosamente la espátula debajo de la región del cuello. Ligar el conducto pancreático con 6-0 Prolene hilo en el lado izquierdo de la vena porta que separa los lóbulos gastro-duodenal y esplénicas.
- Realizar una segunda ligadura en estrecha proximidad a la primera ligadura para asegurar que los lóbulos están separados adecuadamente.
- Ligar con mucho cuidado a fin de no dañar los vasos sanguíneos subyacentes, a saber, la arteria pancreaticoduodenal superior, la arteria pancreaticoduodenal inferior y la parte de páncreas de la arteria esplénica.
- Coloca los órganos en la cavidad abdominal.
- Cierre la incisión utilizando 4-0 poliglicol hilo filamentoso en un patrón de sutura continuo para la / capa peritoneal muscular y en un patrón de sutura discontinua para la piel.
5. Sham Cirugía
- Realice todos los pasos como dedescribe en los pasos 1 a 4.1.4. Mientras que el páncreas está expuesta, no realice la ligadura del conducto pancreático.
- Al final de la etapa 4.1.4, colocar los órganos internos en la cavidad abdominal.
- Cierre de la incisión como se describe en 4.2.7.
Cuidado 6. Post-operativa y Vigilancia
- Después de la intervención quirúrgica es completa, coloque el ratón en el área de recuperación. Este consiste en una jaula colocada sobre una almohadilla térmica y forrado con ropa de cama de papel plano con el fin de mantener la temperatura corporal normal.
- Brindar apoyo nutricional para evitar la hipoglucemia post-operatorio por el alimento humedecido colocado en la parte inferior de la jaula. Para este propósito, utilizar gránulos de dieta estándar para roedores remojadas en agua hasta que se ablanden.
- Proporcionar apoyo fluido por el alimento humedecido y proporcionar agua a voluntad.
- Utilice buprenorfina como la analgesia (0,05-0,1 mg / kg) dos veces al día durante 2 días después de la cirugía. Durante todo el experimental, el seguimiento, observe los ratones durante la ocurrencia de posibles signos de infección, incluyendo la secreción de líquido o pus de la herida, o por el deterioro físico que se caracteriza por la reducción en el comportamiento de acicalamiento y nivel de actividad, menor apetito y pérdida de peso corporal.
7. Evaluación del éxito PDL y Cosecha de PDL cola y Sham cola de páncreas
- La eutanasia a los ratones por dislocación cervical.
- Vuelva a afeitarse la región abdominal para evitar el arrastre de la piel.
- Abra la capa de la piel y el músculo abdominal y eliminar una gran área de piel y músculo para obtener un buen acceso al páncreas.
- El uso de pinzas o hisopo estéril, el estómago se retrae superiormente, exponiendo el bazo y el lóbulo esplénica (la región de la cola) del páncreas.
- Retire con cuidado el duodeno y parte del yeyuno superior para exponer el lóbulo gastroduodenal (región de la cabeza) del páncreas.
Nota: La porción ligada del páncreas PDL ahora se ha reducido en tamaño y se ha convertido en casitraslúcido para que los islotes son visibles como pequeños puntos blancos. La parte de la cabeza del páncreas es de color rosa opaco y distinta exocrina lobuli se puede observar. - Usando tijeras estériles, separar la parte de la cola del páncreas se ligó a partir del bazo, cortando a lo largo del bazo. Cortar perder el tejido conectivo que conecta la región de la cola del páncreas a los órganos internos.
- Cortar la región de la cola PDL justo en frente de la ligación, con exclusión de la ligadura y el tejido inmediatamente adyacente a la misma desde el tejido cosechado.
- Para aislar el tejido cola farsa, siga los pasos 7.1 a 7.5. Usando tijeras estériles separan la región de la cola del páncreas farsa del bazo por el corte a lo largo del bazo. Aislar la región de la cola por el corte en la región del cuello del páncreas y el corte soltar el tejido conectivo que conecta el páncreas cola a los órganos internos
Nota: Tanto la cola y región de la cabeza del páncreas simulados son de color rosa opaco, para aislar las dos partes por separado,cortar el páncreas en la región del cuello.
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Representative Results
PDL induce atrofia acinar y la inflamación, pero no afecta el peso corporal y la glucemia
En 8 semanas de edad BALB / c ratones, el conducto de drenaje de las enzimas exocrinas de la cola del páncreas se liga mientras que la cabeza del órgano, situado adyacente al estómago y el duodeno, no se ve afectado. Edad, sexo y machos BALB / c ratones con peso se someten a cirugía simulada recapitular todas las medidas de la cirugía parcial ligadura del conducto, a excepción de la ligación del conducto pancreático. Tejido de páncreas fue cosechada 3, 7, 14, 30 días después de la cirugía.
Cuando PDL se realiza correctamente, los ratones parecen sanos y no muestran una diferencia significativa en el peso corporal (Figura 1) o la glucemia (Figura 1B), en comparación con los ratones con operación simulada. Tejido acinar exocrina se pierde gradualmente después de la cirugía PDL (Figura 2A-E), resultando en una reducción en el tamaño y peso de la porción ligada de la P DL páncreas (Figura 3), de aquí en adelante llamado cola PDL. Tres días después de la PDL, la morfología del tejido acinar se altera y las células acinares se someten a la apoptosis (Figura 4) y es probable engullido por la infiltración de CD45 + células inmunes (Figura 5). En el día 7 después de PDL, muchos lóbulos acinares se sustituyen por fibrótico (Figura 6) y el tejido adiposo (Figura 2C-E) mientras que las células acinares restantes se someten a acinar-a-ductal metaplasia. Por día 14 post PDL, casi todos acinar lobuli están desprovistos de células acinares (Figura 2a-e) hacer el páncreas cola PDL aparecen translúcidos de modo que los islotes se hacen visibles a simple vista (Figura 3). Coincidente con el inicio de la apoptosis acinar, se observa un aumento de la actividad del ciclo celular del epitelio ductal (Figura 7).
PDL induce un aumento de la insulina + beta volumen celular
ONTENIDO "> dos semanas después de PDL el volumen de las células beta total en el PDL cola se ha duplicado en comparación con la cola Sham no se ligó. volumen celular Beta se cuantifica midiendo el área INS + en 4 micras secciones, 36 micras aparte que abarca todo el tejido que representa 10% del volumen total de páncreas. PDL induce un aumento en el contenido de insulina dos semanas después de la cirugía en comparación con el páncreas no se ligó como se puede demostrar por tomografía automatizado todo -tissue óptico (OPT). 15 Dado que el tamaño de las células beta no se cambia después de PDL el aumento en el volumen de las células beta es el resultado de un aumento en el número de células beta.PDL induce un aumento en la proliferación de células beta y la activación de la expresión Ngn3
La proliferación de células Beta es analizada por inmunohistoquímica (IHC) tinción en páncreas cosechó 7 días y 14 días después de la cirugía Sham o PDL. El porcentaje de células beta positivas para el marcador de proliferación Ki-67 se cuantifica por eninspección de las células individuales en una forma no automatizada. A los 7 y 14 días después de la cirugía PDL, la proliferación de las células beta en el PDL cola es significativamente aumentó en comparación con el páncreas no ligado.
Dentro de los 3 días después de PDL la expresión del marcador progenitor islote embrionaria Ngn3 se incrementa significativamente en PDL cola en comparación con el páncreas no ligado. Los niveles máximos de Ngn3 transcripción se alcanzaron dentro de 1 semana y posteriormente disminuyeron lentamente. Medimos rutinariamente la activación de genes Ngn3 expresando el nivel de mRNA que codifica Ngn3 en el páncreas PDL relación con el nivel Ngn3 estable en el duodeno. Recientemente hemos sugerido que la extensión de neogénesis en PDL podría depender del nivel de activación de genes Ngn3. 15,30
Figura 1. PDL no afecta el peso corporal o la glucemia. Peso corporal (g) (A) y la glucemia (mg/ DL) (B) de (barras blancas con operación simulada) y PDL ratones (barras negras) se midió en diferentes puntos de tiempo (días 0, 7, 14 y 30) después de la cirugía y no mostraron ninguna diferencia significativa entre la farsa y PDL ratones operados en cualquier punto del tiempo. Figura publicada originalmente por Xu et al., 2008. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. PDL conduce a una pérdida gradual de células acinares. El cambio morfológico de PDL páncreas cola reveladas por tinción hematoxilina-eosina en el día 3 (B), 7 (C), 14 (D) y 30 (E) después de la cirugía, en comparación con el páncreas cola simulacro de accionamiento (A). A los 3 días después de la ligadura, solamente una alteración sutil del tejido acinar puede ser observed (B). A los 7 días después de la ligadura, el tejido acinar está gravemente perturbado y complejos ductales han formado (C). A los 14 días después de la ligadura, pocas células acinares permanecen y acinar lobuli son reemplazados por estructuras ductales, una red y adipocitos fibrosa (indicado con un asterisco (*) en el panel C y E). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .
Figura 3. cola PDL en la cosecha. Cola Sham (A) y la cola PDL (B) cosechado en el día 14 después de la cirugía. PDL cola se reduce drásticamente en tamaño en comparación con la cola Sham. Picture (C) muestra la cola PDL en el día 14 después de la cirugía en el lugar. Debido a la pérdida de células acinares, la cola PDLaparece translúcido, el conducto pancreático principal es claramente visible (indicado con la flecha negro) y los islotes son visibles como pequeños puntos blancos (indicado con la flecha blanca). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. PDL induce apoptosis acinar. Inmunotinción para escindido-caspasa 3 en PDL cola a los 3, 7 y 14 días después de la cirugía revela cuerpos apoptóticos en el compartimiento acinar en la cirugía días 3 y 7 días después, mientras que las células acinares son casi ausente de cola PDL en el día 14. Los bares de ampliación son 25 micras. Figura publicada originalmente por Xu et al., 2008. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
= "Figura 5" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig5.jpg" />
Figura 5. PDL induce infiltración de células inmunes. La inmunotinción para el marcador leucocitario CD45, que muestra la presencia de un alto número de células inmunes en PDL cola 7 días después de la cirugía en comparación con el páncreas farsa. Barras de ampliación son 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. PDL induce fibrosis. La inmunotinción para actina de músculo liso alfa muestra la presencia de una red fibrosa en PDL cola 14 días después de la cirugía en comparación con el páncreas farsa. Barras de ampliación son 50 micras. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
"Figura 7" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg" />
Figura 7. PDL induce un aumento en la proliferación celular conducto. Inmunotinción doble para el marcador de células conducto de citoqueratina 19 (CK19) y para el marcador de proliferación BrdU muestra un aumento en la actividad del ciclo celular de las células de los conductos. Bares de ampliación son 25 micras. Figura publicada originalmente por Xu et al., 2008. 11. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Supplies for preparation area | |||
| Hibiscrub | Regent Medical | 5601IE5F11 | Chlorhexidin diglucon |
| Ketamin | Ceva | BE-V202526 | anesthesia |
| Rompun(2%) (Xylazin) | Bayer | BE-V041815 | anesthesia |
| Duratears | Alcon | 34335-8 | ointment for eyes |
| Razor | |||
| Supplies for surgical area | |||
| Leica Operating microscope | Leica | 10446320 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools (FST) | 18000-45 | |
| autoclaved surgical instruments | Fine Science Tools (FST) | ||
| Recirclulating water heating pad | Gaymar Industries, Inc. | TP702 | |
| Adhesive OP-towel | BARRIER | 706500-07 | |
| OP-tape | BARRIER | 381035-00 | |
| Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) | Lohmann&Rauscher International | 35968 | |
| Mini Plasco 0.9% NaCl solution | B.BRAUN | 3521680 | |
| 6-0 prolene suture | Ethicon | 8706H | |
| 4-0 polyglycol suture | Ethicon | SL-607 | |
| Supplies for recovery area | |||
| Paper bedding (paper towel) | |||
| Vetergesic | ecuPhar | BE-V342955 | |
| Materials for analysis | |||
| Taqman Ngn3 primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.56a.33574796.gs | |
| Taqman CycloA primer | Integrated DNA technologies | Mm.PT.39a.2.gs | |
| anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) | Cell Signaling | 5A1E | |
| anti-mouse/rat Ki-67 antibody | eBioscience | 14-5698-82 | |
| monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) | Sigma | 085K4889 | |
| anti-rat Cytokeratin 19 | DSHB | ||
| monoclonal Mouse anti-BrdU | Dako | M0744 | |
| Hoechst | Sigma | 33342 |
References
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