Introduction
Biomarker aus dem Blut erhalten nützliche diagnostische, vorausschauende und Stratifizierung von Maßnahmen in vielen klinischen Zusammenhängen, einschließlich Herz-Kreislauf-Krankheit 1, Krebs Wissenschaften 2 und psychiatrische Erkrankungen 3. Sie können auch in der Grundlagenforschung verwendet, um den "Zustand" eines Organismus zu bewerten, einschließlich des Grades der Hunger, Entzündung oder vorhanden Stress werden. Solche Maßnahmen können durch Variablen, oder auch nicht entscheidend für die Frage von Interesse, darunter die Tageszeit, die die Probe erhalten wird, und das Geschlecht der Probanden sein kann beeinflusst werden. Es kann auch durch die Belastung während der Blutentnahme Verfahren selbst induzierten beeinflusst werden. Stresshormonen und die Wahrnehmung von Schmerz schnell verändern die Zusammensetzung des Blutes.
Nagetiere sind die am häufigsten verwendeten Labortieren und mehrere Verfahren wurden für die Blutentnahme entwickelt. Die ideale Methode der Blutentnahme sollte minimal Physiologica habenl Einfluss auf das Tier, erfordert keine Narkose, erlauben eine schnelle und wiederholte Probenahme erfolgen, und eine ausreichende Blutmenge für zahlreiche Downstream-Anwendungen. Beliebte Techniken zum Sammeln von Blut, wie Katheterisierung der Halsschlagader oder Amputation der Schwanzspitze diese Kriterien nicht erfüllen.
Das Ziel des Protokolls ist es, eine Blutentnahmetechnik zur Verwendung bei Ratten, die minimal belastenden beschreiben, erfordert keine Anästhesie, ermöglicht mehrere Blutsammlungen innerhalb eines einzelnen Subjekts, und eine relativ große Probenmenge, so dass mehrere Tests durchgeführt werden, an einer einzigen Probe. Das Ziel dieser Methode ist, um Blutproben, die minimal von der akuten Stressreaktion beeinflußt werden erhalten.
Protocol
Alle Experimente wurden unter Verwendung von ausgewachsenen männlichen Long-Evans-Ratten durchgeführt. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den US National Institutes of Health (NIH) Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und wurden von der Institutional Animal Care und Verwenden Committee des Massachusetts Institute of Technology und der Animal Care und Verwenden schreiben Amt zugelassener die USAMRMC.
1. Vorbereitung
- Heparinise der Katheter und der Spritze, indem das abgeschirmte Nadel in einer 500 ul Röhrchen mit Heparin (1000 USP-Einheiten / ml) und dann Ansaugen und Ausstoßen von Heparin-Lösung durch die Nadel.
- Bringen Sie einen Schmetterling Katheter an der Spritze. Halten Sie das Schild über der Nadel des Katheters, um die scharfe Spitze vor Beschädigungen zu schützen.
- Zurückzuziehen ein Volumen von Heparin, der etwas größer als das Volumen des Blutes, das gesammelt werden soll. Trennen Sie die Spritze und füllen Sie es mit Luft.
- Bringen Sie die Spritze mit dem Katheter und verwenden Sie dieLuft, um überschüssige Heparin-Lösung zu vertreiben; sicherzustellen, nur Spuren in der Rohrleitung, Nadel und Spritze bleiben.
- Legen Sie die sterile Katheter, mit der Spritze noch angebracht, auf eine sterile Oberfläche.
- Sichern Sie schnell die Ratte in einem sauberen Tuch um sicherzustellen, dass Vorder- und Hinterpfoten sind in einer komfortablen Position und Atmung ist nicht beschränkt.
- Sichern Sie den Wrap mit Klettband; sicherzustellen, dass äußeren Genitalien sind nicht eingeschnürt.
- Einen Assistenten sanft und fest zurückhalten die Ratte (Bauch und Rutenansatz) auf einer festen Arbeitsfläche mit der Schwanz hängen über den Rand des Zählers.
2. Blutentnahme
- Tauchen Sie das Heck in 42 ° C Wasser für 40-50 Sek Blutgefäße erweitern und trocknen Sie den Schwanz mit einem Papiertuch. Suchen Sie die Schwanzvene entlüftet werden (drehen Sie den ganzen Körper mit dem Schwanz verdrehen den Schwanz zu verhindern).
Hinweis: Eine ausreichende Erwärmung des Schwanzes ist entscheidend für die rasche collection einer Blutprobe. Wenn der Gefäß verengt ist, ist die richtige Plazierung des Katheters schwierig, und der Blutfluss in beträchtlichem Ausmaß verringert. Heizkissen kann als Alternative zum Eintauchen in Wasser verwendet werden. - Identifizieren Sie die Entnahmestelle.
Anmerkung: Die Arterie liegt entlang der Mitte der dorsalen Seite des Schwanzes; verwenden Sie nicht diese für die Probenahme.- Ziel entweder die linke und rechte Schwanzvenen, die lateral der Arterie liegen. Pigmentierung der Schwanz, der durch den Stamm variiert und mit dem Alter zunimmt, kann ein Teil des Gefäßsystems zu verdunkeln. Ziel einen Abschnitt der Vene in dem unteren Abschnitt des Schwanzes.
- Wischen Sie den Zielbereich mit 2% Chlorhexidin antiseptischen Lösung.
- Erzeugen Unterdruck in der Spritze und dem Katheter durch Herausziehen des Kolbens von Null bis ungefähr 50 & mgr; l.
- Halten Sie den Schwanz sanft und fest in der Nähe der Spitze, um den Schwanz gerade ganzen Probensammlung zu halten. Stellen Sie sicher, dass der Blutfluss nicht durch eine zu enge Griff verschlossen.
- Langsam setzen Sie den Katheter in die Vene in einem flachen Winkel von ungefähr 5 cm von der Schwanzspitze. Wenn die Vene eingedrungen ist, wird Blut in den Katheter fließt. Ziehen Sie langsam den Kolben der Spritze zu sammeln Sie die gewünschte Lautstärke mit einer konstanten Rate (~ 20 & mgr; l pro Sekunde).
- Wenden Sie sich an Tierärzten für Informationen über die maximale Blutvolumen, die gesammelt werden können. Die maximale Blutmenge, die gesammelt werden soll, hängt von dem Gewicht und dem Gesundheitszustand der Ratte. Mehr als 15% der Gesamtblutvolumen in einem Zeitraum von 14 Tagen widerrufen Sie nicht.
Hinweis: Das Blut ist viel schwieriger, von Tieren, die akut in den Minuten vor der Proben weil Stresshormone verengen die Gefäße betont wurden zu sammeln. Zum Beispiel bewegt Heimkäfig der Ratte auf ein neues Zimmer, wobei einige Minuten, um das Tier, oder wiederholte Einführen des Katheters in eine Vene wickeln werden wahrscheinlich eine akute Stressreaktion auslösen. - Erleichtern blood Fluss durch "Melken" der Vene. Führen einen Finger entlang der Länge der Vene von der Basis zur Spitze des Schwanzes, bleiben jedoch mehr als 2 cm von der Spitze des eingesteckten Nadel oder des Katheters kann abgelöste aus der Vene zu werden.
- Wenn Blut nicht erfolgreich von der ersten Seite des Katheters Eindringen gesammelt werden, weitere Wieder führen Sie die Nadel bis die Vene. Wenn Blut wurde in der Anfangs Website gesammelt, re-Druck die Nadel durch Trennen und anschließendem Verbinden des Katheters und Spritze vor dem Wiedereinsetzen in die Vene. In der Regel vermeiden, zusätzliche Durchführungen.
- Wie mehrere Durchdringungen können Schwanzvene Zusammenbruch, in dem die Blutversorgung der Schwanz abgeschnitten und die weiche Schwanzgewebe wird nekrotisiert verursachen, einschläfern die Ratte, wenn es Schwanzvene Zusammenbruch.
- Wenden Sie sich an Tierärzten für Informationen über die maximale Blutvolumen, die gesammelt werden können. Die maximale Blutmenge, die gesammelt werden soll, hängt von dem Gewicht und dem Gesundheitszustand der Ratte. Mehr als 15% der Gesamtblutvolumen in einem Zeitraum von 14 Tagen widerrufen Sie nicht.
- Wenn eine ausreichende Probenmenge erhoben werden, freigeben Druck in der Spritze durch Trennen und Wiederverbinden des Katheters. Saugen Sie leicht mit dem Spritzenkolben (~ 50 & #181; l), und die Nadel aus der Vene zurücktreten.
Hinweis: Wenn die Nadel, ohne vorher die Druckentlastungs in die Spritze gezogen wird Blut von der Nadel tropft. - Druck auf die Einstichstelle kurzzeitig gelten die Blutung zu stoppen, und wischen Sie den Bereich mit antiseptischen Lösung. Gibt die Ratte in seinen Heimkäfig.
3. Verarbeitung der Blutprobe
- Saugen Luft, um sicherzustellen, kein Blut im Katheter Nadel bleibt, und mit einer Schere, um den Katheterschlauch direkt über der Nadel zu schneiden. Vertreibt das Blut in ein steriles 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
Hinweis: Wenn das Blut durch die Nadel geschoben wird, kann die Scherkraft roten Blutkörperchen führen zu Bruch, die mit vielen stromabwärts Assays stören können. Entfernen Sie die Nadel, um eine Hämolyse zu vermeiden.- Zu sammeln Blutplasma, Nutzung Rohre, die EDTA als Antikoagulans (hier enthalten, verwenden Sie 10 ul 0,1 M EDTA für 200-400 ul Blut; sicherzustellen, die Konzentration von EDTA verwendet wird, nicht stören wit der nachgeschalteten Test) und auf Eis.
- Spin Blutproben bei 2.100 × g in einer gekühlten Zentrifuge (4 ° C) für 10 Minuten innerhalb von 10 Minuten der Sammlung. Elution des Plasmas, die Vermeidung der roten und weißen Blutzellschichten zu stören.
- Um Blutserum, Ort Proben (ohne Antikoagulans) bei Raumtemperatur für bis zu 30 min zu sammeln, um die Gerinnung zu ermöglichen. Dreh die Sammelröhrchen in einer Kühlzentrifuge (4ºC) bei 2000 x g. Das Serum kann dann eluiert werden.
- Zu sammeln Blutplasma, Nutzung Rohre, die EDTA als Antikoagulans (hier enthalten, verwenden Sie 10 ul 0,1 M EDTA für 200-400 ul Blut; sicherzustellen, die Konzentration von EDTA verwendet wird, nicht stören wit der nachgeschalteten Test) und auf Eis.
- Verwenden Proben sofort oder bei -80 ° C für bis zu einem Jahr.
Representative Results
Blutplasma von der lateralen Schwanzvene wie in dem Protokoll beschrieben gesammelt gibt eine Plasmaprobe, die durchscheinend hellgelb im Aussehen war. Wie in 1 gezeigt, Hämolyse in einer Probe vermittelt einen roten Farbton zu dem Plasma. Die akute Stressreaktion schnell verändern die Zusammensetzung des Blutes. Beispielsweise kann zirkulierenden Corticosteron Konzentration deutlich erhöht innerhalb von 10 min der Stressor Belichtung, wie in Abbildung 2 dargestellt. Die niedrige basale Niveaus von Corticosteron bei diesem Verfahren vor der Belichtung Stressor erhalten zeigen, dass sich die Abtastung selbst nicht eine signifikante Quelle von Stress.
Abb. 1: Beispielbild (A) A hämolysierten Probe gezeigt. Nach der Zentrifugation durch die schwarze ar angegeben das Plasma oder Serum Schicht (OberflächenReihe) erscheint mit rosa oder rot gefärbt. Dunklere Farbtöne zeigen ein höheres Maß an Hämolyse. (B) Nach der Zentrifugation wird eine einwand gesammelten Probe eine klare, gelbliche Erscheinung zum oberen Band (Oberfläche durch den schwarzen Pfeil angedeutet), die mit dem nicht-hämolysierten Plasma oder Serum entspricht. Beim Entfernen dieser Schicht ist es wichtig, um die zugrunde liegende Vollblut nicht stören, entweder, indem der Pipettenspitze in die Vollblut-Schicht oder durch Absaugen ein Teil des Vollbluts in die Spitze. Alle Plasma oder Serum mit Vollblut kontaminiert ist zu verwerfen.
Abbildung 2: Plasma-Corticosteron schnell Anschluss an eine stressige Erfahrung erhöhten Blut wurde aus der laterale Schwanzvene der erwachsenen weiblichen Long-Evans-Ratten vor erhalten und 10 Minuten nach Exposition mit 4 Tönen (10 sec, 2 kHz, 85 dB) Co-Abschluss. mit footshocks (1 sec, 350 & mgr; A). Blutplasma Corticosteron zu Studienbeginn (290,4 ± 138,8 pg / ml) deutlich weniger als die Niveaus beobachtet 10 min nach Vorlage des Fußschock Stress war (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), geändert durch die gepaarten t bestimmt -test. *, P <0,05
Discussion
Hier beschreiben wir ein schnelles und einfaches Verfahren zur Aufnahme einer Blutprobe von einer Ratte, die gegenüber anderen üblicherweise verwendeten Techniken erhebliche Vorteile bietet erhalten wurde. Erstens erfordert sie keine Narkose im Gegensatz Probenahme aus der Jugularvene oder retroorbitalen Sinus. Wenn Blutproben gesammelt umgebenden Verhaltens Verfahren ist die Verabreichung von Anästhetika unerwünscht, da sie mit Lernen und Gedächtnis 4,5 stören. Zweitens bietet es die Möglichkeit, größeres Blutvolumen als andere Venenpunktionstechniken wie das Erheben von den Vena oder Rückenpedal Venen zu sammeln. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren bis zu 1,5 ml Blut können von einer Ratte an einem einzigen Zeitpunkt gesammelt werden, ein Volumen, das leicht ermöglicht mehrere Tests parallel ausgeführt werden. Schließlich minimiert dieses Verfahren das Potenzial für Gewebeschäden im Vergleich zu Amputation der Schwanzspitze oder retroorbitale Blutung. Die Verwendung dieses Verfahrens erleichtert die Einhaltung der Tier Welfare Act und der Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren, die Minimierung der Schmerzen und Leiden, die von Laborverfahren an Tieren durchgeführt, führen müssen.
Es wird empfohlen, dass die Ermittler neu in diesem Verfahren die Zurückhaltung zu üben und Schwanz Blutungen Techniken, um die Zeit, die Versuchstiere sind zurückhaltend zu minimieren. Blut in weniger als 3 min vom Beginn der Zurückhaltung gesammelt bietet optimale Ergebnisse.
Das hier beschriebene Protokoll kann zum Abtasten 1-4 Mal pro Woche verwendet werden, aber nicht mehr als zweimal pro Tag. Während wiederholte Blutentnahmen durchgeführt werden, sollten verschiedene Messstellen, nach oben bewegt von der Basis des Schwanzes verwendet werden und die linken und rechten Schwanzvenen sollten Probenahmestellen abgewechselt werden. Das Gesamtblutvolumen von Nagetieren ist 6-7% ihres Körpergewichts, und nicht mehr als 15% des gesamten Blutvolumens innerhalb eines Zeitraum von 2 Wochen gesammelt werden. Serumoder Plasma enthält etwa 40-60% des gesammelten Probenvolumen.
Blutentnahme über die seitlichen Schwanzvenen können auch in der Maus als hier mit einigen kleineren Modifikationen durchgeführt werden, beschrieben. Erstens können nur kleine Überdruck (27 G) Katheter verwendet werden. Zweitens ist es empfehlenswert, eine Rohrrückhalteeinrichtung zu verwenden, statt einer Verpackung, um die Mäuse zu immobilisieren. Das Volumen an Blut, die aus der Maus unter Verwendung der Venenpunktion der Unterkiefergefäßbündel (200-500 ul) erhalten werden kann, ist größer als sicher aus der Schwanzvene (200 ul maximal) gesammelt werden. Da Probenahme von Blut aus dem Unterkieferspeichelgefäßbündel erfordert minimale Zurückhaltung und kann mehr Blut zu erhalten, ist dies der bevorzugte Weg für die Probenahme in der Maus.
Die Schnelligkeit, mit der dieses Verfahren durchgeführt werden kann, zusammen mit seiner minimal invasive Art, minimiert auch das Potential Störung der Blut basierenden Maßnahmen der akuten Stressreaktion 6. Dieakuter Stressantwort zirkulierenden Spiegel von vielen Molekülen, einschließlich Interleukinen und anderen Immun aktiven Faktoren 7, Hormone der Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse 8, Hormone im sympathischen Nervensystem 9, Ghrelin 10, endogene Opioide 11, Dopamin zu ändern und Serotonin-12. Wenn Ruhe zirkulierenden Maßnahmen dieser Moleküle oder andere von diesen Molekülen reguliert erwünscht sind, ist es wichtig, die Stressreaktion, die innerhalb von weniger als einer Minute nach dem Beginn der Belichtung Stressor ausgelöst wird, zu minimieren.
Stressreaktionen nicht nur die Zusammensetzung des Blutes verändern, sondern auch eine technische Hindernis zur Blutentnahme wegen der Verengung der Blutgefäße darstellen über erhöhte Fahrt vom sympathischen Nervensystems. Es wird schwierig, stetige Erhöhung des Blutflusses von einer Ratte, die Montage ist eine akute Stressreaktion zu erhalten. Daher muss das Tier Not minim seinized, um schnell zu erhalten Proben, die den physiologischen Zustand von Interesse zu reflektieren.
Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Virginia Doherty und Junmei Yao für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde von NIMH (R01 MH084966) und der US Army Research Office und der Defense Advanced Research Projects Agency finanziert (gewähren W911NF-10-1-0059) bis KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
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