Introduction
Biomarkører opnået fra blod give nyttige diagnostisk, forudsigende og stratificering foranstaltninger i mange kliniske sammenhænge, herunder hjertekarsygdomme 1, kræft videnskaber 2, og psykiatrisk sygdom 3. De kan også anvendes i grundforskning til at vurdere "tilstand" af en organisme, herunder graden af sult, inflammation, eller stress stede. Sådanne foranstaltninger kan være påvirket af variabler, som måske eller måske ikke er afgørende for spørgsmålet om interesse, herunder det tidspunkt på dagen, at prøven er opnået, og køn af de emner. Det kan også blive påvirket af stress induceret under blodprøvetagning procedurer selv. Stresshormoner og opfattelsen af smerte kan hurtigt ændre sammensætningen af blodet.
Gnavere er de mest almindeligt anvendte forsøgsdyr, og der er udviklet flere metoder til indsamling af blod. Den ideelle metode til blodprøvetagning skal have minimal Physiological indvirkning på dyret, kræver ingen bedøvelse, tillade hurtig og gentagen prøvetagning, og give blodvolumen tilstrækkelig for mange efterfølgende anvendelser. Populære teknikker til opsamling af blod, såsom kateterisation af halsvenen eller halespids amputation ikke opfylder disse kriterier.
Formålet med denne protokol er at beskrive en blodprøvetagning teknik til brug i rotter, som er minimalt stressende, ikke kræver anæstesi, giver mulighed for flere blod samlinger i et enkelt emne, og tilvejebringer et relativt stort prøvevolumen, således at multiple assays kan udføres på en enkelt prøve. Målet med denne fremgangsmåde er at opnå blodprøver, der er minimalt påvirket af den akutte stress-respons.
Protocol
Alle forsøg blev udført ved hjælp af voksne mandlige Lang Evans rotter. Alle procedurer var i overensstemmelse med de amerikanske National Institutes of Health (NIH) Guide til Pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg for Massachusetts Institute of Technology og Animal Care og brug anmeldelse kontor Den USAMRMC.
1. Fremstilling
- Heparinise kateteret og sprøjten ved at anbringe afskærmet nål i en 500 pi rør indeholdende heparin (1.000 USP-enheder / ml) og derefter opsugning og udstøde heparinopløsning gennem nålen.
- Vedhæft en sommerfugl kateter til sprøjten. Holde skjoldet over nålen af kateteret for at beskytte den skarpe spids mod beskadigelse.
- Tilbagekalde et volumen af heparin, der er lidt større end volumenet af blod, der vil blive indsamlet. Tag sprøjten og fyld den med luft.
- Re-vedhæfte sprøjten til kateteret og brugeluft for at uddrive overskydende heparinopløsning; sikre, at kun spormængder forbliver i slangen, nål og sprøjte.
- Anbring steril kateter, med sprøjten stadig er fastgjort, på en steril overflade.
- Hurtigt sikre rotte i en ren klud der sikrer, at for- og bagpoter er i en behagelig stilling og vejrtrækning er ubegrænset.
- Fastgør wrap med krog og løkke tape; sikre, at eksterne kønsorganer ikke er indsnævret.
- Have en assistent blidt og fast holde rotten (underliv og base af hale) på en solid arbejde overflade med halen hængende ud over kanten af tælleren.
2. Blood Sampling
- Fordyb halen i 42 ° C vand i 40-50 sek at spile blodkar og tør halen med et stykke køkkenrulle. Find halevenen til udluftes (dreje hele kroppen med halen for at forhindre vridning halen).
Bemærk: Tilstrækkelig opvarmning af halen er kritisk for den hurtige Collection af en blodprøve. Hvis vaskulaturen indsnævres, er vanskeligt korrekt placering af katetret, og blodgennemstrømningen er væsentligt mindsket. En varmepude kan anvendes som et alternativ til nedsænkning i vand. - Identificer prøvetagningsstedet.
Bemærk: arterie ligger langs midten dorsale aspekt af halen; Brug ikke dette for prøveudtagning.- Target enten den venstre og højre halevenerne der ligger lateralt i forhold til arterien. Pigmentering af halen, som varierer efter belastning og stiger med alderen, kan tilsløre nogle af karrene. Målrette en del af venen i den nedre del af halen.
- Tør målområdet med 2% klorhexidin antiseptisk løsning.
- Skabe undertryk i sprøjten og kateteret ved at trække stemplet fra nul til ca. 50 pi.
- Hold halen blidt og fast nær spidsen for at holde halen lige i hele prøvetagningen. Sørg for, at blodgennemstrømningen ikke tilstoppet af en alt for stramt greb.
- Sæt langsomt kateteret ind i venen i en flad vinkel ca. 5 cm fra spidsen af halen. Når venen gennemtrænges, vil blod strømme ind i kateteret. Langsomt trække stemplet i sprøjten til at indsamle det ønskede volumen ved en konstant hastighed (~ 20 pi per sekund).
- Konsultere det veterinære personale til oplysninger om den maksimale blodvolumen, der kan indsamles. Den maksimale mængde blod, der skal indsamles, afhænger af vægten og sundhedstilstand rotten. Træk ikke mere end 15% af den samlede blodvolumen i en 14 dages periode.
Bemærk: Blod er meget vanskeligere at indsamle fra dyr, der akut stressede i minutter før at prøve samling, fordi stresshormoner snøre karrene. For eksempel flytter rottens bur en hidtil ukendt rum, idet flere minutter til wrap dyret, eller gentagen indføring af kateteret i en vene er alle tilbøjelige til at udløse en akut stress-respons. - Lette Blood flow af 'malkning «venen. Køre en finger langs længden af venen, fra bunden mod spidsen af halen, men forbliver mere end 2 cm fra spidsen af den indsatte nål eller kateteret kan løsne sig fra venen.
- Hvis blodet ikke kan med held indsamles fra den indledende site af kateter penetration, re-indsætte nålen længere op venen. Hvis blod blev opsamlet i den indledende site, re-tryk nålen ved at frakoble og derefter tilslutte kateteret og sprøjte før re-indsættelse i venen. Generelt undgå yderligere gennemføringer.
- Som flere gennembrydninger kan forårsage halevenen sammenbrud, ved hvilken blodtilførsel til halen er afskåret og det bløde hale væv bliver bortdøet, aflive rotten hvis der er halevenen sammenbrud.
- Konsultere det veterinære personale til oplysninger om den maksimale blodvolumen, der kan indsamles. Den maksimale mængde blod, der skal indsamles, afhænger af vægten og sundhedstilstand rotten. Træk ikke mere end 15% af den samlede blodvolumen i en 14 dages periode.
- Når tilstrækkelig prøvevolumen indsamles Slip trykket i sprøjten ved at afbryde og tilslutte kateteret. Aspirer lidt hjælp sprøjtestemplet (~ 50 & #181 l), og trække nålen ud af venen.
Bemærk: hvis nålen trækkes tilbage uden først at udløse trykket i sprøjten, vil blod dryppe fra nålen. - Kortvarigt lægge pres på insertionsstedet at standse blødninger, og tør området med antiseptisk løsning. Retur rotten til sit hjem bur.
3. Behandling blodprøven
- Aspirer luft sikrer ingen blod forbliver inde i kateteret nålen og brug saks til at klippe kateterrøret lige over nålen. Uddrive blodet i en steril 1,5 ml mikrocentrifugerør.
Bemærk: hvis blod skubbes gennem kanylen, kan forskydningskraften forårsager røde blodlegemer til at sprænges som kan interferere med mange downstream assays. Fjern nålen for at undgå hæmolyse.- At indsamle blodplasma, bruge rør, der indeholder EDTA som antikoagulans (her skal du bruge 10 pi 0,1 M EDTA til 200-400 pi blod, sikre koncentrationen af EDTA, ikke interfererer wed downstream assay) og sted på is.
- Spin fuldblodsprøver ved 2.100 xg i en nedkølet centrifuge (4 ° C) i 10 minutter inden for 10 min for indsamlingen. Eluering af plasma, undgå at forstyrre de røde og hvide blodlegemer lag.
- At indsamle blodserum, place prøver (uden antikoagulant) ved stuetemperatur i op til 30 minutter for at aktivere koagulation. Spin opsamlingsrør i en afkølet centrifuge (4 ° C) ved 2.000 x g. Serumet kan derefter elueres.
- At indsamle blodplasma, bruge rør, der indeholder EDTA som antikoagulans (her skal du bruge 10 pi 0,1 M EDTA til 200-400 pi blod, sikre koncentrationen af EDTA, ikke interfererer wed downstream assay) og sted på is.
- Brug prøver straks eller opbevares ved -80 ° C i op til et år.
Representative Results
Blodplasma opsamlet fra den laterale halevene som beskrevet i protokollen giver en plasmaprøve, der var gennemskinnelige og bleggult udseende. Som vist i figur 1, hæmolyse i en prøve bibringer en rød farvetone til plasmaet. Kan den akutte stress respons hurtigt ændre sammensætningen af blod. For eksempel kan cirkulerende corticosteron koncentration markant stigning inden for 10 min af stressor eksponering, som vist i figur 2. De lave basale niveauer af corticosteron opnået med denne metode før stressor eksponering afslører, at prøveudtagningsproceduren selv er ikke en væsentlig kilde til stress.
Figur 1:. Prøve udseende (A) A hæmolyserede prøve er vist. Efter centrifugering plasmaet eller serumet lag (overflade angivet af den sorte arrække) vises farvet med pink eller rød. Mørkere nuancer angiver højere grad af hæmolyse. (B) Efter centrifugering vil en korrekt indsamlet prøve har en klar, gullig udseende til det øvre bånd (overflade angivet ved den sorte pil), der svarer til den ikke-hæmolyserede plasma eller serum. Ved fjernelse dette lag, er det vigtigt at ikke forstyrre den underliggende fuldblod, enten ved at skubbe pipettespidsen i helblodet lag eller ved at suge noget af fuldblod ind i spidsen. Enhver plasma eller serum forurenet med fuldblod skal kasseres.
Figur 2: Plasma corticosteron er hurtigt forhøjet efter en stressende oplevelse Blod blev opnået fra den laterale halevene af voksne kvindelige Lang Evans rotter før og 10 min efter udsættelse for 4 toner (10 sek, 2 kHz, 85 dB) co-terminerende. med footshocks (1 sek, 350 uA). Blodplasma corticosteron ved baseline (290,4 ± 138,8 pg / ml) var signifikant lavere end niveauerne observeret 10 min efter præsentation af fodchok stress (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), bestemt ved parret t -test. *, P <0,05
Discussion
Her beskriver vi en hurtig og enkel procedure til opnåelse af en blodprøve fra en rotte, der giver betydelige fordele i forhold til andre almindeligt anvendte teknikker. Først kræver det ikke bedøvelse, i modsætning til prøvetagning fra halsvenen eller retroorbitale sinus. Når der indsamles blodprøver omgivende adfærdsmæssige procedurer, administration af anæstetika er uønsket, fordi det kan forstyrre indlæring og hukommelse 4,5. For det andet, det giver mulighed for at indsamle større blod- mængder end andre venepunktur teknikker, såsom indsamling fra saphenous eller dorsale pedal vener. Ved hjælp af teknikken beskrevet her, op til 1,5 ml blod kan indsamles fra en rotte på et enkelt tidspunkt, et volumen, der let tillader flere analyser, der skal køres parallelt. Endelig er denne procedure minimerer muligheden for vævsbeskadigelse forhold til halespids amputation eller retroorbital blødning. Brugen af denne procedure letter overholdelsen af Animal Welfare Act og Guide for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr, som kræver at minimere smerte og lidelse, der skyldes laboratorie procedurer udføres på dyr.
Det anbefales, at undersøgere nye denne metode praktisere de fastholdelsesanordninger og hale blødning teknikker for at minimere den tid, som forsøgsdyr de fastholdes. Blod opsamles i mindre end 3 min fra indledningen af tilbageholdenhed giver optimale resultater.
Den her beskrevne protokol kan anvendes til prøveudtagning 1 til 4 gange om ugen, men ikke mere end to gange om dagen. Mens gentagne samlinger blod kan udføres, bør der anvendes forskellige prøveudtagningssteder bevæger opad fra haleroden, og venstre og højre halevener bør skiftes som prøveudtagningssteder. Det samlede blodvolumen af gnavere er 6-7% af deres kropsvægt, og ikke mere end 15% af det samlede blodvolumen bør indsamles inden for en 2 ugers periode. Serumeller plasma omfatter ca. 40-60% af den indsamlede prøvevolumen.
Blodprøvetagning via de laterale halevenerne kan også udføres i mus som beskrevet her med et par mindre modifikationer. For det første kan der kun lille gauge (27 G) katetre anvendes. Sekund, anbefales det at anvende et rør fastholdelsesanlæg, snarere end en wrap, at immobilisere musene. Volumenet af blod, der kan opnås fra musen ved hjælp venepunktur af submandibulære vaskulære bundt (200-500 pi) er større end kan sikkert opsamlet fra halevenen (200 maksimum pi). Fordi prøvetagning blod fra submandibulære vaskulære bundt kræver minimal tilbageholdenhed og kan give mere blod, dette er den foretrukne vej til prøvetagning i musen.
Den hurtighed, hvormed denne procedure kan udføres, sammen med sin minimalt invasive karakter, minimerer også den potentielle forstyrrelse af foranstaltninger blod-baserede af akut stress respons 6. Denakut stress respons kan ændre cirkulerende niveauer af mange molekyler, herunder interleukiner og andre immun-aktive faktorer 7, hormoner af hypothalamus-hypofyse-binyre-aksen 8, hormoner i det sympatiske nervesystem 9, ghrelin 10, endogene opioider 11, dopamin og serotonin 12. Hvis der ønskes hvilende cirkulerende foranstaltninger af disse molekyler eller andre, der reguleres af disse molekyler, er det vigtigt at minimere stress respons, som udløses inden for så lidt som et minut af starten af stressor eksponering.
Stress reaktioner ikke kun ændre sammensætningen af blodet, men også repræsentere en teknisk forhindring for blodprøveudtagning på grund af indsnævringen af vaskulaturen gennem øget kørsel fra det sympatiske nervesystem. Det bliver stigende vanskeligere at opnå steady blodgennemstrømning fra en rotte, der er montering af en akut stress-respons. Derfor skal dyrets nød være minimliseret for hurtigt at få prøver, der afspejler den fysiologiske tilstand af interesse.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker Virginia Doherty og Junmei Yao til teknisk bistand. Denne forskning blev finansieret af NIMH (R01 MH084966), og den amerikanske hær Research Office og Defense Advanced Research Projects Agency (give W911NF-10-1-0059) til KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
