Introduction
खून से प्राप्त Biomarkers उपयोगी नैदानिक, भविष्य कहनेवाला प्रदान करते हैं, और हृदय रोग 1, कैंसर विज्ञान 2, और मनोरोग बीमारी 3 सहित कई चिकित्सीय संदर्भों में उपायों, stratifying। उन्होंने यह भी भूख, सूजन, या तनाव वर्तमान की डिग्री सहित, एक जीव की "राज्य" का आकलन करने के लिए बुनियादी विज्ञान के क्षेत्र में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के उपाय या नमूना प्राप्त किया जाता है कि दिन के समय और विषयों के लिंग सहित हित का सवाल है, के लिए महत्वपूर्ण हो सकता है और नहीं है कि चर से प्रभावित किया जा सकता है। यह भी रक्त नमूने प्रक्रियाओं के दौरान ही प्रेरित तनाव से प्रभावित किया जा सकता है। तनाव हार्मोन और दर्द की धारणा तेजी से रक्त की संरचना बदल सकते हैं।
चूहे सबसे अधिक इस्तेमाल किया प्रयोगशाला जानवर हैं, और कई तरीकों रक्त संग्रह के लिए विकसित किया गया है। रक्त नमूने का आदर्श तरीका न्यूनतम physiologica होनी चाहिएजानवर पर एल प्रभाव, कोई संज्ञाहरण की आवश्यकता होती है, तेजी से और बार-बार नमूना लेने की अनुमति देते हैं, और कई बहाव के अनुप्रयोगों के लिए पर्याप्त रक्त की मात्रा प्रदान करते हैं। इस तरह इन मानदंडों को पूरा नहीं करते गले नस या पूंछ टिप विच्छेदन की कैथीटेराइजेशन के रूप में रक्त एकत्रित करने के लिए लोकप्रिय तकनीक।
इस प्रोटोकॉल का उद्देश्य, संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है, कम तनावपूर्ण है कि चूहों में इस्तेमाल के लिए एक रक्त नमूना तकनीक का वर्णन करने के लिए है एक ही विषय के भीतर अनेक रक्त संग्रह के लिए अनुमति देता है, और कई assays के किया जा सकता है कि इस तरह के एक अपेक्षाकृत बड़े नमूना मात्रा प्रदान करता है एक भी नमूना पर। इस पद्धति का लक्ष्य न्यूनतम भारी तनाव की प्रतिक्रिया से प्रभावित कर रहे हैं कि रक्त के नमूने प्राप्त करने के लिए है।
Protocol
सभी प्रयोगों वयस्क पुरुष लंबे समय इवांस चूहों का उपयोग किया गया था। सभी प्रक्रियाओं प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए स्वास्थ्य (एनआईएच) गाइड के अमेरिका के राष्ट्रीय संस्थान के अनुसार कर रहे थे और मैसाचुसेट्स इंस्टीट्यूट ऑफ टेक्नोलॉजी के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति और पशु की देखभाल और का प्रयोग रिव्यू कार्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया USAMRMC।
1. तैयारी
- सुई के माध्यम से हेपरिन समाधान (1,000 खासियत इकाइयों / एमएल) के एक 500 μl युक्त ट्यूब हेपरिन में परिरक्षित सुई रखने और फिर aspirating और खदेड़ने से कैथेटर और सिरिंज Heparinise।
- सिरिंज के लिए एक तितली कैथेटर संलग्न। नुकसान से तेज टिप की रक्षा के लिए कैथेटर की सुई से अधिक ढाल रखें।
- एकत्र किया जाएगा कि रक्त की मात्रा की तुलना में थोड़ा बड़ा होता है कि हेपरिन की एक मात्रा वापस ले लें। सिरिंज को अलग करें और हवा के साथ भरें।
- फिर से जोड़ना कैथेटर के लिए सिरिंज और उपयोगहवा अतिरिक्त हेपरिन समाधान को निष्कासित करने के लिए; केवल मात्रा ट्यूबिंग, सुई, सिरिंज में बने रहने का पता लगाने सुनिश्चित करते हैं।
- एक बाँझ सतह पर, अभी भी जुड़ी सिरिंज के साथ, बाँझ कैथेटर रखें।
- जल्दी fore- और hindpaws एक आरामदायक स्थिति में हैं और साँस लेने में अप्रतिबंधित है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक साफ कपड़े में चूहे सुरक्षित।
- हुक और पाश टेप के साथ रैप सुरक्षित; बाह्य जननांग constricted नहीं कर रहे हैं कि सुनिश्चित करते हैं।
- धीरे एक सहायक है और मजबूती से पूंछ काउंटर के किनारे से फांसी के साथ एक ठोस काम की सतह पर चूहा (पेट और पूंछ के आधार) को नियंत्रित।
2. रक्त का नमूना लेना
- रक्त वाहिकाओं को चौड़ा और एक कागज तौलिया के साथ पूंछ सुखाने के लिए 40-50 सेकंड के लिए 42 डिग्री सेल्सियस पानी में पूंछ विसर्जित कर दिया। (पूंछ घुमा को रोकने के लिए पूंछ के साथ पूरे शरीर को बारी बारी से) लहूलुहान होने के लिए पूंछ नस का पता लगाएँ।
नोट: पूंछ की पर्याप्त वार्मिंग तेजी collectio के लिए महत्वपूर्ण हैएक खून का नमूना के एन। वैसक्यूलेचर constricted जाता है, तो कैथेटर के उचित स्थान के लिए मुश्किल है, और रक्त का प्रवाह बेहद कम है। एक हीटिंग पैड पानी विसर्जन के लिए एक विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। - नमूना बिंदु को पहचानें।
नोट: धमनी पूंछ के मध्य पृष्ठीय पहलू के साथ निहित है; नमूना लेने के लिए इस का उपयोग नहीं करते।- धमनी के लिए पार्श्व कि झूठ छोड़ दिया और सही पूंछ नसों या तो लक्ष्य बनाएं। तनाव से भिन्न होता है और उम्र के साथ बढ़ जाती है जो पूंछ के pigmentation, vasculature की कुछ अस्पष्ट हो सकता है। पूंछ के निचले हिस्से में नस के एक हिस्से को लक्ष्य बनाएं।
- 2% chlorhexidine एंटीसेप्टिक समाधान के साथ लक्षित क्षेत्र साफ कर लें।
- लगभग 50 μl शून्य से सवार वापस लेने के द्वारा सिरिंज और कैथेटर में नकारात्मक दबाव बनाएं।
- सीधे नमूना संग्रह के दौरान पूंछ रखने के लिए टिप के पास धीरे से और दृढ़ता पूंछ पकड़ो। रक्त के प्रवाह को एक पीढ़ी मजबूत पकड़ से occluded नहीं है सुनिश्चित करें।
- धीरे-धीरे लगभग 5 सेमी पूंछ की नोक से एक उथले कोण पर नस में कैथेटर डालें। नस प्रवेश कर जाता है, तो रक्त कैथेटर में बहेगा। धीरे धीरे (~ प्रति सेकंड 20 μl) एक स्थिर दर पर वांछित मात्रा एकत्र करने के लिए सिरिंज के सवार वापस ले लें।
- एकत्र किया जा सकता है कि अधिक से अधिक रक्त की मात्रा के बारे में जानकारी के लिए पशु चिकित्सा स्टाफ से परामर्श करें। एकत्र किया जाना चाहिए कि रक्त की अधिकतम राशि चूहे के वजन और स्वास्थ्य की स्थिति पर निर्भर करता है। एक 14 दिन की अवधि में कुल रक्त की मात्रा का 15% से अधिक वापस नहीं है।
नोट: रक्त तीव्रता से तनाव हार्मोन वाहिका कसना क्योंकि संग्रह नमूना करने के लिए पहले ही मिनट में जोर देकर कहा गया है कि जानवरों से इकट्ठा करने के लिए और अधिक कठिन है। उदाहरण के लिए, एक नस में पशु, या कैथेटर के दोहराया प्रविष्टि रैप करने के लिए कई मिनट ले रही है, एक उपन्यास के कमरे में चूहे के घर पिंजरे चलती सब एक तीव्र तनाव प्रतिक्रिया को गति प्रदान करने के लिए की संभावना है। - Bloo सुकर'दुहना' नस द्वारा डी प्रवाह। पूंछ की नोक की ओर आधार से, नस की लंबाई के साथ एक उंगली भागो, लेकिन नस से उखाड़ फेंकना बन सकते डाला सुई या कैथेटर की नोक से अधिक से अधिक 2 सेमी रहते हैं।
- रक्त सफलतापूर्वक कैथेटर प्रवेश की प्रारंभिक स्थल से एकत्र नहीं किया जा सकता है, तो नस आगे सुई फिर से डालें। रक्त प्रारंभिक स्थल पर एकत्र किया गया था, तो रखती हैं और फिर नस में प्रविष्टि फिर से करने से पहले कैथेटर और सिरिंज reconnecting द्वारा सुई फिर से दबाव। सामान्य में, अतिरिक्त पेनेट्रेशन से बचें।
- एकाधिक पेनेट्रेशन पूंछ को रक्त की आपूर्ति काट रहा है और मुलायम पूंछ ऊतक necrotized हो जाता है जिसमें पूंछ नस पतन, पैदा कर सकता है जैसा कि पूंछ नस पतन होता है तो चूहा euthanize।
- एकत्र किया जा सकता है कि अधिक से अधिक रक्त की मात्रा के बारे में जानकारी के लिए पशु चिकित्सा स्टाफ से परामर्श करें। एकत्र किया जाना चाहिए कि रक्त की अधिकतम राशि चूहे के वजन और स्वास्थ्य की स्थिति पर निर्भर करता है। एक 14 दिन की अवधि में कुल रक्त की मात्रा का 15% से अधिक वापस नहीं है।
- पर्याप्त नमूना मात्रा एकत्र किया जाता है, रखती है और कैथेटर reconnecting द्वारा सिरिंज में दबाव जारी है। महाप्राण थोड़ा सिरिंज सवार का उपयोग कर (~ 50 & #181, एल), और नस से सुई वापस ले लें।
नोट: सुई पहले सिरिंज में दबाव जारी करने के बिना वापस ले लिया जाता है, तो रक्त सुई से ड्रिप जाएगा। - संक्षेप में रक्तस्राव को रोकने, और एंटीसेप्टिक समाधान के साथ क्षेत्र पोंछने के लिए प्रविष्टि साइट के लिए दबाव डालते हैं। अपने घर पिंजरे में चूहे लौटें।
3. रक्त नमूना प्रसंस्करण
- महाप्राण हवा में कोई खून कैथेटर सुई के अंदर रहता है सुनिश्चित करने, और सिर्फ सुई से ऊपर कैथेटर ट्यूबिंग कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करने के लिए। एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रक्त निष्कासित।
नोट: रक्त सुई के माध्यम से धक्का दे दिया गया है, तो बाल काटना बल कई बहाव के assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं जो टूटना करने के लिए लाल रक्त कोशिकाओं का कारण बन सकता है। रक्तापघटन से बचने के लिए सुई निकालें।- , रक्त प्लाज्मा, यहाँ एक anticoagulant (के रूप में EDTA के होते हैं कि उपयोग ट्यूबों इकट्ठा खून की 200-400 μl के लिए 0.1 एम EDTA के 10 μl का उपयोग करने के लिए; सुनिश्चित डब्ल्यू हस्तक्षेप नहीं करता इस्तेमाल किया EDTA के एकाग्रताबर्फ पर नीचे की ओर परख) और जगह रबर।
- संग्रह के 10 मिनट के भीतर 10 मिनट के लिए एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में 2,100 XG पर पूरे रक्त के नमूने स्पिन। लाल और सफेद रक्त कोशिका परतों को परेशान करने से परहेज, प्लाज्मा elute।
- थक्के सक्षम करने के लिए 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर रक्त सीरम (थक्का-रोधी) के बिना जगह के नमूने लेने के लिए। 2,000 x जी पर एक प्रशीतित अपकेंद्रित्र (4 डिग्री सेल्सियस) में संग्रह ट्यूबों स्पिन। सीरम तो eluted जा सकता है।
- , रक्त प्लाज्मा, यहाँ एक anticoagulant (के रूप में EDTA के होते हैं कि उपयोग ट्यूबों इकट्ठा खून की 200-400 μl के लिए 0.1 एम EDTA के 10 μl का उपयोग करने के लिए; सुनिश्चित डब्ल्यू हस्तक्षेप नहीं करता इस्तेमाल किया EDTA के एकाग्रताबर्फ पर नीचे की ओर परख) और जगह रबर।
- इस्तेमाल की तुरंत नमूने, या स्टोर करने के लिए एक वर्ष के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर।
Representative Results
प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में पार्श्व पूंछ नस से एकत्र रक्त प्लाज्मा पारदर्शी और दिखने में पीले रंग पीला था कि एक प्लाज्मा नमूना देता है। चित्र 1 में दिखाया गया है, एक नमूने में रक्तापघटन प्लाज्मा करने के लिए एक लाल रंग प्रदान करता है। भारी तनाव प्रतिक्रिया तेजी से रक्त की संरचना बदल सकते हैं। चित्रा 2 में दिखाया गया है उदाहरण के लिए, परिसंचारी corticosterone एकाग्रता स्पष्ट रूप से, तनाव-जोखिम के 10 मिनट के भीतर बढ़ा सकते हैं। जोखिम stressor करने से पहले इस विधि के साथ प्राप्त corticosterone की कम बेसल स्तर नमूना प्रक्रिया ही तनाव का एक महत्वपूर्ण स्रोत नहीं है कि पता चलता है।
चित्रा 1:। नमूना उपस्थिति (ए) एक hemolyzed नमूना दिखाया गया है। Centrifugation के बाद, प्लाज्मा या सीरम परत (सतह काली की गिरफ्तारी ने संकेत दियापंक्ति) गुलाबी या लाल रंग के साथ रंग दिखाई देता है। गहरे रंग टिंट रक्तापघटन की अधिक से अधिक स्तर का संकेत मिलता है। (बी) centrifugation के बाद, एक ठीक से एकत्र नमूना गैर hemolyzed प्लाज्मा या सीरम से मेल खाती है, जो ऊपरी बैंड (काला तीर द्वारा संकेत सतह), के लिए एक स्पष्ट, पीले उपस्थिति होगा। इस परत को हटाने, यह या तो पूरे रक्त परत में पिपेट टिप धक्का द्वारा या टिप में पूरे रक्त की कुछ aspirating द्वारा अंतर्निहित पूरे रक्त को परेशान नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। पूरे रक्त के साथ दूषित किसी भी प्लाज्मा या सीरम खारिज किया जाना चाहिए।
चित्रा 2: प्लाज्मा corticosterone तेजी से एक तनावपूर्ण अनुभव के बाद उठाया है रक्त से पहले वयस्क महिला लंबे समय इवांस चूहों के पार्श्व पूंछ नस से प्राप्त की और 10 मिनट के 4 टन (10 सेकंड, 2 किलोहर्ट्ज़, 85 डीबी) के प्रदर्शन के बाद सह समाप्त हो गया था। foo के साथtshocks (1 सेकंड, 350 μA)। आधारभूत (290.4 ± 138.8 स्नातकोत्तर / एमएल) में रक्त प्लाज्मा corticosterone स्तरों footshock तनाव की प्रस्तुति के बाद 10 मिनट मनाया की तुलना में काफी कम था (2204.8 ± 454.5 स्नातकोत्तर / मिलीलीटर, पी = 0.02, एन = 4), बनती टी द्वारा निर्धारित -test। *, पी <0.05
Discussion
यहाँ, हम अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया तकनीकों से अधिक महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है जो एक चूहे से एक खून का नमूना प्राप्त करने के लिए एक त्वरित और आसान प्रक्रिया का वर्णन। सबसे पहले, यह गले नस या retroorbital साइनस से नमूने के साथ इसके विपरीत, संज्ञाहरण की आवश्यकता नहीं है। रक्त के नमूनों व्यवहार प्रक्रिया आसपास के एकत्र कर रहे हैं जब यह सीखने और स्मृति 4,5 के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, क्योंकि एनेस्थेटिक्स के प्रशासन अवांछनीय है। दूसरा, यह इस तरह के saphenous या पृष्ठीय पेडल नसों से संग्रह के रूप में अन्य venipuncture तकनीक, की तुलना में बड़ा खून संस्करणों इकट्ठा करने की क्षमता प्रदान करता है। रक्त की 1.5 मिलीलीटर अप करने के लिए यहाँ वर्णित तकनीक का प्रयोग एक ही समय बिंदु पर एक चूहे से एकत्र किया जा सकता है, आसानी से एकाधिक assays के समानांतर में चलाने के लिए अनुमति देता है एक मात्रा। अंत में, इस प्रक्रिया पूंछ टिप विच्छेदन या retroorbital खून बह रहा है की तुलना में ऊतकों को नुकसान के लिए क्षमता को कम करता है। इस प्रक्रिया का उपयोग पशु डब्ल्यू के साथ अनुपालन की सुविधाelfare अधिनियम और जानवरों पर प्रदर्शन प्रयोगशाला प्रक्रिया से परिणाम है कि दर्द और संकट को कम करने की आवश्यकता होती है जो प्रयोगशाला पशु की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड।
यह इस विधि के लिए नए जांचकर्ताओं प्रायोगिक पशुओं रोका रहे हैं कि समय को कम करने के क्रम में संयम और पूंछ से खून बह रहा तकनीक का अभ्यास की सिफारिश की है। संयम की दीक्षा से कम से कम 3 मिनट में एकत्र रक्त इष्टतम परिणाम प्रदान करता है।
यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल प्रति सप्ताह 1 से 4 बार नमूना लेने के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन दिन में दो बार से अधिक नहीं हो सकता है। दोहराया रक्त संग्रह का प्रदर्शन किया जा सकता है, पूंछ के आधार से ऊपर की तरफ आगे बढ़ अलग नमूना साइटों का इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और छोड़ दिया और सही पूंछ नसों नमूना साइटों के रूप में alternated किया जाना चाहिए। कृन्तकों की कुल रक्त की मात्रा उनके शरीर के वजन के 6-7% है, और कुल रक्त की मात्रा का कोई अधिक से अधिक 15% एक 2 सप्ताह की अवधि के भीतर एकत्र किया जाना चाहिए। सीरमया प्लाज्मा एकत्र नमूना मात्रा का लगभग 40-60% शामिल हैं।
कुछ मामूली संशोधनों के साथ यहाँ वर्णित के रूप में पार्श्व पूंछ नसों के माध्यम से रक्त नमूने भी माउस में प्रदर्शन किया जा सकता है। सबसे पहले, केवल छोटे गेज (27 जी) कैथेटर इस्तेमाल किया जा सकता है। दूसरा, यह चूहों को स्थिर करने के लिए, बल्कि एक कपड़े में लपेटकर, की तुलना में एक ट्यूब restrainer उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। अवअधोहनुज संवहनी बंडल (200-500 μl) की venipuncture माउस का प्रयोग कर से प्राप्त किया जा सकता है कि रक्त की मात्रा सुरक्षित रूप से पूंछ नस (200 μl अधिकतम) से एकत्र किया जा सकता से अधिक है। अवअधोहनुज संवहनी बंडल से रक्त नमूने न्यूनतम संयम की आवश्यकता है और अधिक रक्त उपज हो सकती है, क्योंकि इस माउस में नमूना लेने के लिए पसंदीदा मार्ग है।
इस प्रक्रिया के अपने न्यूनतम आक्रामक प्रकृति के साथ-साथ किया जा सकता है जो तेज़ी के साथ, यह भी भारी तनाव प्रतिक्रिया 6 से रक्त-आधारित उपायों की संभावित गड़बड़ी को कम करता है।भारी तनाव प्रतिक्रिया interleukins और अन्य प्रतिरक्षा सक्रिय कारकों 7, हाइपोथैलेमस पीयूषिका- अधिवृक्क अक्ष 8 के हार्मोन, सहानुभूति तंत्रिका तंत्र 9 में हार्मोन, ghrelin 10, अंतर्जात नशीले पदार्थों के 11, डोपामाइन सहित कई अणुओं की परिसंचारी स्तर, बदल सकते हैं, और सेरोटोनिन 12। इन अणुओं द्वारा विनियमित इन अणुओं या दूसरों के आराम परिसंचारी उपायों वांछित हैं, यह तनाव जोखिम की शुरुआत के एक मिनट के रूप में कम के भीतर शुरू हो रहा है, जो तनाव की प्रतिक्रिया, कम करने के लिए महत्वपूर्ण है।
तनाव प्रतिक्रियाओं केवल रक्त की संरचना में परिवर्तन, लेकिन यह भी सहानुभूति तंत्रिका तंत्र से बढ़कर ड्राइव के माध्यम क्योंकि vasculature की कसना का रक्त नमूना लेने के लिए एक तकनीकी बाधा का प्रतिनिधित्व नहीं। यह एक तीव्र प्रतिक्रिया तनाव बढ़ते है कि एक चूहे से स्थिर रक्त प्रवाह प्राप्त करने के लिए मुश्किल बढ़ती जा रही हो जाता है। इसलिए, जानवर के संकट राग होना चाहिएतेजी से ब्याज की शारीरिक स्थिति को दर्शाते हैं कि नमूने प्राप्त करने के क्रम में ized।
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है।
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए वर्जीनिया डोहर्टी और Junmei याओ धन्यवाद। इस शोध एच (R01 MH084966), और अमेरिकी सेना के अनुसंधान कार्यालय और रक्षा एडवांस्ड रिसर्च प्रोजेक्ट्स एजेंसी द्वारा वित्त पोषित किया गया KAG करने के लिए (W911NF-10-1-0059 अनुदान)।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
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