Introduction
Biomarkers ottenuti da sangue forniscono utili diagnostica predittiva, e stratificando misure in molti contesti clinici, tra cui malattie cardiovascolari 1, scienze cancro 2 e malattia psichiatrica 3. Essi possono essere utilizzati anche in scienza di base per valutare lo "stato" di un organismo, compreso il grado di fame, infiammazione, o stress presenti. Tali misure possono essere influenzati da variabili che possono o non possono essere fondamentali per la questione degli interessi, compreso il tempo del giorno in cui si ottiene il campione e il sesso dei soggetti. Essa può anche essere influenzato dalla sollecitazione indotta durante le procedure di campionamento si sangue. Gli ormoni dello stress e la percezione del dolore possono rapidamente modificare la composizione del sangue.
Roditori sono il laboratorio animale più comunemente usati, e diversi metodi sono stati sviluppati per la raccolta di sangue. Il metodo ideale di prelievo di sangue deve avere Physiologica minimol impatto sull'animale, non richiedono l'anestesia, permettono campionamento rapida e ripetuta, e fornire una sufficiente quantità di sangue per numerose applicazioni a valle. Tecniche popolari per la raccolta del sangue, come cateterizzazione della giugulare amputazione punta vena o della coda non soddisfano questi criteri.
Lo scopo di questo protocollo è quello di descrivere una tecnica di campionamento del sangue per uso in ratti che è minimamente stressante, non richiede anestesia, permette molteplici collezioni sangue all'interno di un singolo soggetto, e fornisce un volume relativamente grande di esempio tale analisi multiple possono essere eseguite su un singolo campione. L'obiettivo di questo metodo è quello di ottenere campioni di sangue che sono minimamente influenzati dalla risposta stress acuto.
Protocol
Tutti gli esperimenti sono stati fatti usando ratti maschi adulti a lungo Evans. Tutte le procedure sono state in conformità con i National Institutes of Health (NIH) Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio e sono stati approvati dalla cura e l'uso degli animali Comitato Istituzionale del Massachusetts Institute of Technology e la cura degli animali ed uso Review Ufficio il USAMRMC.
1. Preparazione
- Heparinise il catetere e la siringa inserendo l'ago schermato in un tubo contenente eparina 500 microlitri (1,000 USP unità / ml) e poi aspirando ed espellendo soluzione di eparina attraverso l'ago.
- Attaccare un catetere farfalla alla siringa. Mantenere la schermatura sopra l'ago del catetere per proteggere la punta affilata da danni.
- Prelevare un volume di eparina che è leggermente maggiore del volume di sangue che sarà incassato. Staccare la siringa e riempirlo con l'aria.
- Rimontare la siringa al catetere e utilizzare ilaria per espellere soluzione di eparina in eccesso; garantire solo tracce rimangono nel tubo, ago e siringa.
- Posizionare il catetere sterile, con la siringa ancora attaccata, su una superficie sterile.
- Garantire rapidamente il topo in un panno pulito assicurando che anteriori e hindpaws sono in una posizione comoda e la respirazione è illimitata.
- Fissare l'involucro con il gancio e le bandelle; garantire che i genitali esterni non sono ristretti.
- Avere un assistente con dolcezza e fermezza frenare il ratto (addome e alla base della coda) su un piano di lavoro solido con la coda appende fuori del bordo del contatore.
Campionamento 2. Sangue
- Immergere la coda in acqua 42 ° C per 40-50 secondi a dilatare i vasi sanguigni e asciugare la coda con un tovagliolo di carta. Individuare la vena della coda per essere dissanguato (ruotare tutto il corpo con la coda per evitare torsioni della coda).
Nota: il riscaldamento sufficiente della coda è fondamentale per la rapida collection di un campione di sangue. Se il sistema vascolare è ristretto, il corretto posizionamento del catetere è difficile, e il flusso di sangue viene notevolmente ridotto. Un rilievo di riscaldamento può essere utilizzata come alternativa alla immersione in acqua. - Identificare il punto di campionamento.
Nota: L'arteria si trova lungo l'aspetto metà dorsale della coda; non utilizzare questo per il campionamento.- Per oggetto sia le vene posteriori sinistro e destro che si trovano lateralmente all'arteria. Pigmentazione della coda, che varia dalla tensione e aumenta con l'età, può oscurare alcuni della vascolarizzazione. Obiettivo una porzione della vena nella porzione inferiore della coda.
- Pulire l'area di destinazione con il 2% clorexidina soluzione antisettica.
- Creare pressione negativa nella siringa e il catetere ritirando lo stantuffo da zero a circa 50 microlitri.
- Tenere la coda delicatamente e saldamente vicino alla punta per mantenere la coda dritta in tutta la raccolta del campione. Assicurarsi che il flusso di sangue non è occluso da una presa troppo stretta.
- Lentamente inserire il catetere nella vena con un angolo basso circa 5 cm dalla punta della coda. Quando la vena è penetrato, il sangue scorrerà nel catetere. Lentamente ritirare lo stantuffo della siringa per raccogliere il volume desiderato ad un tasso costante (~ 20 microlitri per sec).
- Consultare il personale veterinario per informazioni sul volume massimo di sangue che possono essere raccolte. La quantità massima di sangue che devono essere raccolti dipende dal peso e lo stato di salute del ratto. Non prelevare più del 15% del volume totale del sangue in un periodo di 14 giorni.
Nota: Il sangue è molto più difficile da raccogliere da animali che sono stati acutamente sottolineato nel verbale prima del prelievo, perché gli ormoni dello stress restringono la vascolarizzazione. Ad esempio, lo spostamento casa gabbia del topo per una camera romanzo, prendendo diversi minuti per avvolgere l'animale, o ripetuta inserimento del catetere in una vena sono tutti suscettibili di innescare una risposta allo stress acuto. - Facilitare blood flusso da 'mungitura' la vena. Eseguire un dito lungo la lunghezza della vena, dalla base verso la punta della coda, ma rimane superiore a 2 cm dalla punta dell'ago inserito o il catetere possono staccarsi dalla vena.
- Se il sangue non può essere raccolto con successo dal sito iniziale di penetrazione del catetere, reinserire l'ago ulteriormente la vena. Se il sangue è stato raccolto nel sito iniziale, ri-pressurizzare l'ago scollegando e ricollegando il catetere e la siringa prima di reinserimento nella vena. In generale, evitare penetrazioni supplementari.
- Come più penetrazioni possono causare il collasso vena della coda, in cui l'afflusso di sangue alla coda viene interrotta e il tessuto molle coda diventa necrotized, eutanasia il topo se c'è il collasso vena della coda.
- Consultare il personale veterinario per informazioni sul volume massimo di sangue che possono essere raccolte. La quantità massima di sangue che devono essere raccolti dipende dal peso e lo stato di salute del ratto. Non prelevare più del 15% del volume totale del sangue in un periodo di 14 giorni.
- Quando un adeguato volume di campione viene raccolto, rilasciare la pressione nella siringa da scollegare e ricollegare il catetere. Aspirare leggermente con lo stantuffo della siringa (~ 50 & #181; l), ed estrarre l'ago dalla vena.
Nota: Se l'ago viene ritirato senza prima rilasciare la pressione nella siringa, sangue gocciolerà dall'ago. - Brevemente applicare pressione al sito di inserimento per fermare l'emorragia, e pulire la zona con soluzione antisettica. Riportare il topo alla sua gabbia casa.
3. Elaborazione del campione di sangue
- Aria Aspirare a garantire l'assenza di sangue rimane dentro l'ago del catetere, e usare le forbici per tagliare il tubo del catetere appena sopra l'ago. Espellere il sangue in una sterile 1,5 ml provetta.
Nota: Se il sangue viene spinto attraverso l'ago, la forza di taglio può causare globuli rossi a rottura che possono interferire con molti saggi a valle. Rimuovere l'ago per evitare emolisi.- Per raccogliere il plasma sanguigno, tubi di uso contenenti EDTA come anticoagulante (qui, utilizzare 10 ml di 0,1 M EDTA per 200-400 ml di sangue; garantire la concentrazione di EDTA utilizzato non interferisce won il test a valle) e posto sul ghiaccio.
- Spin campioni di sangue intero a 2100 xg in una centrifuga refrigerata (4 ° C) per 10 min entro 10 minuti di raccolta. Eluire il plasma, evitando di disturbare gli strati di globuli rossi e bianchi.
- Per raccogliere siero del sangue, posto campioni (senza anticoagulante) a temperatura ambiente per un massimo di 30 minuti per consentire la coagulazione. Spin tubi di raccolta in una centrifuga refrigerata (4 ° C) a 2000 x g. Il siero può essere poi eluito.
- Per raccogliere il plasma sanguigno, tubi di uso contenenti EDTA come anticoagulante (qui, utilizzare 10 ml di 0,1 M EDTA per 200-400 ml di sangue; garantire la concentrazione di EDTA utilizzato non interferisce won il test a valle) e posto sul ghiaccio.
- Utilizzare i campioni immediatamente, o conservare a -80 ° C per un massimo di un anno.
Representative Results
Plasma di sangue prelevati dalla vena caudale laterale come descritto nel protocollo dà un campione di plasma che era traslucido e giallo pallido in apparenza. Come mostrato in Figura 1, emolisi nel campione conferisce una tinta rossa plasma. La risposta allo stress acuto può rapidamente modificare la composizione del sangue. Ad esempio, concentrazione circolante corticosterone può notevolmente aumentare entro 10 minuti di esposizione di stress, come mostrato nella Figura 2. I bassi livelli basali di corticosterone ottenuti con questo metodo prima stressanti dell'esposizione rivelano che la procedura di campionamento per sé non è una fonte significativa di stress.
Figura 1: viene mostrato l'aspetto del campione (A) Un campione emolizzato.. Dopo centrifugazione, il plasma o il livello nel siero (superficiale indicato dalla ar nerafila) appare tinge di rosa o rosso. Tinte più scuri indicano maggiori livelli di emolisi. (B) Dopo centrifugazione, un campione correttamente raccolti avrà una chiara, aspetto giallastra della banda superiore (superficie indicata dalla freccia nera), che corrisponde al plasma non emolizzati o siero. Quando si rimuove questo strato, è importante non disturbare il sangue intero sottostante, sia spingendo la punta della pipetta in tutto lo strato sangue o aspirando parte del sangue intero nella punta. Qualsiasi plasma o siero contaminati da sangue intero devono essere eliminate.
Figura 2: corticosterone plasma sta rapidamente elevato a seguito di una esperienza stressante Il sangue è stato prelevato dalla vena della coda laterale femmine adulte ratti lungo Evans prima e 10 minuti dopo l'esposizione a 4 toni (10 sec, 2 kHz, 85 dB) co-terminazione. con footshocks (1 sec, 350 μA). Corticosterone plasma sanguigno al basale (290,4 ± 138,8 pg / ml) è risultata significativamente inferiore ai livelli osservati 10 minuti dopo la presentazione dello stress footshock (2204,8 ± 454,5 pg / ml, p = 0,02, n = 4), come determinato da paired t -test. *, P <0,05
Discussion
Qui, si descrive una procedura rapida e semplice per ottenere un campione di sangue da un topo che offre notevoli vantaggi rispetto ad altre tecniche comunemente utilizzate. In primo luogo, non richiede anestesia, in contrasto con il campionamento dalla vena giugulare o del seno retroorbitario. Quando i campioni di sangue sono raccolti circostante procedure comportamentali, la somministrazione di anestetici è indesiderabile perché può interferire con l'apprendimento e la memoria 4,5. In secondo luogo, offre la possibilità di raccogliere volumi sanguigni più grandi rispetto alle altre tecniche di puntura di vena, come la raccolta dalle vene safena pedale o dorsali. Utilizzando la tecnica qui descritta, fino a 1,5 ml di sangue possono essere raccolte da un topo in un singolo punto di tempo, un volume che consente facilmente molteplici test da eseguire in parallelo. Infine, questa procedura riduce al minimo il rischio di danni ai tessuti rispetto alla punta della coda amputazione o sanguinamento retroorbitario. L'uso di questa procedura permette di rispettare l'animale Welfare Act e la guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio, che richiedono riducendo al minimo il dolore e l'angoscia che derivano da procedure di laboratorio sugli animali.
Si raccomanda che gli investigatori nuovi a questo metodo pratica le tecniche di immobilizzazione e sanguinamento coda in modo da minimizzare il tempo che gli animali sperimentali vengono immobilizzati. Il sangue raccolto in meno di 3 minuti dall'inizio del contenimento fornisce risultati ottimali.
Il protocollo qui descritto può essere utilizzato per il campionamento 1 a 4 volte alla settimana, ma non più di due volte al giorno. Mentre collezioni sangue ripetute possono essere eseguite, devono essere utilizzati differenti siti di campionamento si spostano verso l'alto dalla base della coda, e le vene coda sinistra e destra devono essere alternate come siti di campionamento. Il volume totale del sangue di roditori è 6-7% del loro peso corporeo, e non più del 15% del volume totale del sangue deve essere raccolto in un periodo di 2 settimane. Sieroo plasma comprende circa il 40-60% del volume del campione raccolto.
Campionamento del sangue attraverso le vene coda laterali può essere eseguito anche nel topo come descritto qui con alcune piccole modifiche. In primo luogo, possono essere utilizzati solo piccolo calibro (27 G) cateteri. In secondo luogo, si consiglia di utilizzare un dispositivo di immobilizzazione tubo, piuttosto che un involucro, per immobilizzare i topi. Il volume di sangue che può essere ottenuta dal mouse utilizzando venipuntura del fascio vascolare sottomandibolare (200-500 ml) è superiore possono essere raccolti in modo sicuro dalla vena caudale (200 microlitri massimo). Poiché prelievo di sangue dal fascio vascolare sottomandibolare richiede contenimento fisico minimo e può produrre più sangue, questo è il percorso preferito per il campionamento nel topo.
La rapidità con cui può essere eseguita questa procedura, insieme con la sua natura minimamente invasiva, minimizza anche il potenziale perturbazione misure base di sangue dalla risposta stress acuto 6. Ilrisposta allo stress acuto può alterare i livelli circolanti di molte molecole, tra cui le interleuchine e di altri fattori immunitari-attivo 7, ormoni dell'asse ipotalamo-ipofisi-surrene 8, ormoni del sistema nervoso simpatico 9, grelina 10, oppioidi endogeni 11, la dopamina, e serotonina 12. Se si desiderano riposo circolanti misure di queste molecole o altri regolate da queste molecole, è importante minimizzare la risposta allo stress, che viene attivato entro meno di un minuto del inizio dell'esposizione stress.
Risposte di stress non solo alterano la composizione del sangue, ma rappresentano anche un ostacolo tecnico per il prelievo di sangue a causa della costrizione dei vasi attraverso una maggiore unità dal sistema nervoso simpatico. E diventa sempre più difficile ottenere costante il flusso di sangue da un ratto che sta montando una risposta allo stress acuto. Pertanto, l'angoscia degli animali deve essere minimazata per ottenere rapidamente campioni che riflettono lo stato fisiologico di interesse.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Virginia Doherty e Junmei Yao per l'assistenza tecnica. Questa ricerca è stata finanziata dal NIMH (R01 MH084966), e la US Army Research Office e la Defense Advanced Research Projects Agency (concedere W911NF-10-1-0059) per KAG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium heparin (1,000 USP units/ml) | Patternson Veterinary Supply | 25021040010 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | JT Taylor | JT2020-01 | |
| Dermachlor rinse-chlorhexadine | Butler Schein | 6356 | Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate |
| SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters | VWR Scientific | TESV25BLK | |
| BD Tuberculin 1 cc syringes | VWR Scientific | BD309659 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 89202-682 | |
| 500 μl microcentrifuge tubes | VWR Scientific | 21150-330 | |
| Scissors, stainless steel, 5" | VWR Scientific | 82027-586 | |
| 500 ml plastic beaker | VWR Scientific | 414004-149 | |
| Clean cloth wrap | Butler Schein | 2993 | |
| Velcro tape, 0.75 in width | Monoprice | B004AF9II6 | Hook and loop tape |
| Timer | VWR Scientific | 62344-641 |
References
- Vausort, M., Wagner, D. R., Devaux, Y. Long Noncoding RNAs in Patients with Acute Myocardial Infarction. Circ Res. 115 (7), 668-677 (2014).
- Shah, R., et al. Biomarkers for Early Detection of Colorectal Cancer and Polyps: Systematic Review. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 23 (9), 1712-1728 (2014).
- Chan, M. K., et al. Applications of blood-based protein biomarker strategies in the study of psychiatric disorders. Prog Neurobiol. , (2014).
- Cao, L., Li, L., Lin, D., Zuo, Z. Isoflurane induces learning impairment that is mediated by interleukin 1beta in rodents. PLoS One. 7 (12), e51431 (2012).
- Culley, D. J., Baxter, M. G., Yukhananov, R., Crosby, G. Long-term impairment of acquisition of a spatial memory task following isoflurane-nitrous oxide anesthesia in rats. Anesthesiology. 100 (2), 309-314 (2004).
- Vahl, T. P., et al. Comparative analysis of ACTH and corticosterone sampling methods in rats. Am J Physiol Endocrinol Metab. 289 (5), E823-E828 (2005).
- Kalinichenko, L. S., Koplik, E. V., Pertsov, S. S. Cytokine profile of peripheral blood in rats with various behavioral characteristics during acute emotional stress. Bull Exp Biol Med. 156 (4), 441-444 (2014).
- McEwen, B. S. Central effects of stress hormones in health and disease: Understanding the protective and damaging effects of stress and stress mediators. Eur J Pharmacol. 583 (2-3), 174-185 (2008).
- Sanchez, A., Toledo-Pinto, E. A., Menezes, M. L., Pereira, O. C. Changes in norepinephrine and epinephrine concentrations in adrenal gland of the rats submitted to acute immobilization stress. Pharmacol Res. 48 (6), 607-613 (2003).
- Meyer, R. M., Burgos-Robles, A., Liu, E., Correia, S. S., Goosens, K. A. A ghrelin-growth hormone axis drives stress-induced vulnerability to enhanced fear. Mol Psychiatry. , (2013).
- Knoll, A. T., Carlezon, W. A. Dynorphin, stress, and depression. Brain Res. 1314 (56-73), (2010).
- Harvey, B. H., Brand, L., Jeeva, Z., Stein, D. J. Cortical/hippocampal monoamines, HPA-axis changes and aversive behavior following stress and restress in an animal model of post-traumatic stress disorder. Physiol Behav. 87 (5), 881-890 (2006).
