ラットの外側尾静脈から血液をサンプリング

Introduction

血液から得られたバイオマーカーは有用な診断、予測を提供し、心血管疾患^1、がん科学^2、および精神疾患³を含む多くの臨床状況において対策を、階層化。また、飢餓、炎症、またはストレスの存在度を含む、生物の「状態」を評価するために基礎科学において使用され得ます。このような措置は、またはサンプルが得られる時刻と対象者の性別など、関心の問題に重要であってもなくてもよいの変数によって影響を受けることができます。また、血液採取手順自体の間に誘起される応力によって影響され得ます。ストレスホルモンと痛みの知覚は急速に血液の組成を変化させることができます。

げっ歯類は、最も一般的に使用される実験動物であり、そして複数の方法は、血液採取のために開発されています。採血の理想的な方法は、最小限のphysiologicaを持つ必要があります動物のLへの影響は、全く麻酔を必要とせず、迅速かつ繰り返しサンプリングを可能にし、多数の下流の適用のために十分な血液量を提供します。例えば、頸静脈または尾先端切断のカテーテルなどの血液を採取するための一般的な技術は、これらの基準を満たしていません。

このプロトコルの目的は、最小限のストレスであるラットにおける使用のための血液サンプリング技術について記述して麻酔を必要とせず、単一の被験者内で複数の血液採取を可能にし、複数のアッセイを行うことができるように、比較的大きな試料体積を提供します単一のサンプルに。この方法の目的は、最低限、急性ストレス反応に影響される血液サンプルを得ることです。

Protocol

全ての実験は、成体雄ロングエバンスラットを用いて行きました。すべての手順は、米国国立衛生研究所に応じて、実験動物の管理と使用に関する（NIH）ガイドであり、マサチューセッツ工科大学の施設内動物管理使用委員会との動物管理使用レビュー庁によって承認されましたUSAMRMC。

1.準備

1. ヘパリン（千USP単位/ ml）を含む500μlのチューブでシールド針を配置した後、針を介してヘパリン溶液を吸引して排出することによりHepariniseカテーテルとシリンジ。
   1. シリンジに蝶カテーテルを取り付けます。損傷から鋭い先端を保護するために、カテーテルの針の上にシールドしてください。
   2. 収集される血液の量よりもわずかに大きいヘパリンの量を撤回。注射器を外し、空気でそれを埋めます。
   3. 再アタッチカテーテルに注射器を使用し、空気は、過剰なヘパリン溶液を排出します。確実に微量のみ、チューブ、針、シリンジに残ります。
   4. 滅菌表面に、ついたまま注射器で、滅菌カテーテルを配置します。
2. すぐに前足と後足が快適な位置にあり、呼吸が制限されていないことを保証きれいな布でラットを固定します。
   1. フックとループテープでラップを固定し、外性器がくびれていないことを確認してください。
   2. 優しくアシスタントを持ち、しっかりと尾はカウンターの端にぶら下がっで堅実な仕事の表面上にラット（腹部と尾の付け根）を抑制する。

2.採血

1. 40〜50秒の血管を拡張し、ペーパータオルで尾を乾燥させるために42℃の水に尾を浸し。 （尾をねじる防止するために、尾と体全体を回転させる）から採血する尾静脈の位置を確認します。
   注：尾の十分な温暖化が急速collectioのために重要です血液サンプルのN。血管系の狭窄された場合、カテーテルの適切な配置が困難であり、血流が大幅に低減されます。加熱パッドは、水浸漬の代わりに使用することができます。
2. サンプリング点を特定します。
   注：動脈は尾の半ば背側面に沿って位置します。サンプリングのためにこれを使用しないでください。
   1. 動脈への側方に位置する左右の尾静脈のいずれかをターゲットにしています。菌株によって異なり、年齢とともに増加する尾の色素沈着は、血管系の一部を覆い隠すことができます。尾の下部に静脈の一部を対象としています。
   2. 2％クロルヘキシジン消毒液でターゲット領域を拭いてください。
3. 約50μlにゼロからプランジャーを引き出すことによって、注射器やカテーテル内の負圧を作成します。
4. ストレートサンプル収集を通じて尾を維持するために先端付近優しく、しっかりと尾を持ちます。血流が過度にタイトなグリップによって閉塞されていないことを確認してください。
5. ゆっくりと約5cm、尾の先端から浅い角度で静脈にカテーテルを挿入します。静脈が貫通されると、血液がカテーテル内に流れます。ゆっくりと一定の速度（毎秒〜20μL）で所望の体積を収集するために、注射器のプランジャーを撤回。
   1. 収集することができる最大の血液量については、獣医のスタッフにご相談ください。収集する必要があります血液の最大量は、ラットの体重と健康状態に依存します。 14日の期間中の総血液量の15％以上を撤回しないでください。
      注：血液は急性ストレスホルモンが血管系を収縮するので、コレクションをサンプリングする前に数分で強調された動物から収集するためにはるかに困難です。例えば、動物をラップするのに数分を取って、新規の部屋にラットのホームケージを移動、または静脈にカテーテルの挿入を繰り返し、すべての急性ストレス反応を引き起こす可能性があります。
   2. blooを促進「搾乳」静脈からdフロー。尾の先端に向かってベースから、静脈の長さに沿って指を実行しますが、挿入された針やカテーテルの先端から2cm以上が静脈から除去になる可能性が残っています。
   3. 血液が正常にカテーテルの浸透の最初のサイトから収集することができない場合は、静脈までさらに針を再挿入します。血液は最初のサイトで収集された場合は、切断した後、静脈に先立って再挿入するカテーテルと注射器を再接続することにより、針を再加圧します。一般的には、追加の貫通を避けます。
   4. 複数の貫通は、尾への血液供給が遮断され、柔らかい尾組織を壊死されるようになる中で、尾静脈の崩壊を引き起こす可能性がありますように尾静脈の崩壊がある場合に、ラットを安楽死させます。
6. 十分な試料体積が収集されると、切断したカテーテルを再接続することによって、注射器内の圧力を解放します。吸引液がわずかにシリンジプランジャを使用して（〜50＆＃181; L）、および静脈から針を撤回。
   注意：針が第1のシリンジ内の圧力を解放することなく撤回された場合、血液が針から滴下します。
7. 簡単に説明すると出血を止めるために挿入部位に圧力を適用し、消毒液で拭きます。そのホームケージにラットを返します。

3.血液サンプルを処理

1. 吸引した空気には血液がカテーテル針の内部に残っていないことを確認し、ちょうど針の上にカテーテルチューブをカットするはさみを使用しています。滅菌1.5ミリリットルのマイクロチューブに血液を放出します。
   注：血液が針を通して押された場合、剪断力は、多くの下流のアッセイを妨害し得る破裂する赤血球を引き起こす可能性があります。溶血を回避するために、針を外します。
   1. 血漿、ここで（抗凝固剤としてEDTAが含まれている血液の200〜400μlの0.1 M EDTA10μlのを使用し、使用チューブを収集するには、使用されるEDTAの濃度は、Wに干渉しないよう下流アッセイ番目）、氷上に置きます。
      1. 回収の10分以内に10分間冷却遠心機（4℃）で2,100×gでの全血サンプルをスピン。赤および白血球層を乱す避け、プラズマを溶出します。
   2. 凝固を可能にするために最大30分間、室温で（抗凝固剤を含まない）は、血液、血清、場所のサンプルを収集します。 2,000×gで冷却遠心機（4℃）で回収チューブをスピン。血清は、その後、溶出され得ます。
2. 使用直ちに試料、または1年まで-80℃で保存。

Representative Results

プロトコールに記載されているように外側尾静脈から採取した血漿は、外観に半透明で淡黄色であった血漿サンプルを提供します。 図1に示すように、サンプル中の溶血は、血漿に赤い色合いを与えます。急性ストレス反応が急速に血液の組成を変化させることができます。 図2に示すように、例えば、循環コルチコステロン濃度が著しく、ストレッサー曝露の10分以内に増やすことができます。露出をストレッサーの前に、この方法で得られたコルチコステロンの低い基礎レベルは、サンプリング手順自体がストレスの大きな原因ではないことを明らかにしました。

図1：サンプルの外観（A）A溶血試料が示されています。遠心分離後、血漿または血清の層（表面黒Arで示されます行）ピンクや赤を帯び表示されます。暗い色合いは、溶血の高いレベルを示しています。 （B）遠心分離した後、適切に収集したサンプルは、非溶血血漿または血清に対応する上のバンド（黒矢印で示す面）に透明な、黄色がかった外観を持つことになります。この層を除去するとき、それは、いずれかの全血層にピペットの先端を押して、またはチップ内に全血を吸引することにより、下層の全血を乱さないことが重要です。全血で汚染された任意の血漿または血清は破棄されるべきです。

図2：血漿コルチコステロンは急速にストレスの多い経験以下に上昇する血液が前に成人女性ロングエバンスラットの外側尾静脈から得られ、10分4トーン（10秒、2 kHzの、85デシベル）への曝露後の共同終了しました。 fooでtshocks（1秒、350μA）。ベースライン（290.4±138.8 pg / mlで）における血漿コルチコステロンのレベルは、フットショックストレスの提示後10分で観察されるよりも有意に低かった（2204.8±454.5 pg / mlで、p = 0.02、n = 4） は 、対応のあるtによって決定されます-test。 *、p <0.05

Discussion

ここでは、他の一般的に使用される技術上の重要な利点がありますラットから血液サンプルを得るための迅速かつ簡単な手順について説明します。まず、頚静脈または眼窩後洞からのサンプリングとは対照的に、麻酔を必要としません。血液サンプルは、行動手順を取り巻く収集された場合には、学習および記憶^4,5と干渉することができるので、麻酔薬の投与は望ましくありません。第二に、そのような伏在や背ペダル静脈から収集などの他の静脈穿刺技術、より大きな血液容量を収集する機能を提供しています。血液1.5 mlまでの、ここに記載の技術を使用して、単一の時点でラットから回収することができる、容易に複数のアッセイを並行して実行されることを可能にする量。最後に、この手順では、尾の先端切断または眼窩後出血と比較して、組織の損傷の可能性を最小限に抑えることができます。この手順の使用は、動物Wの遵守を促進します動物で実施される実験方法から生じる痛みや苦痛を最小限に抑える必要が法および実験動物の管理と使用に関する指針は 、elfare。

それは、この方法に新しい研究者は、実験動物が抑制されている時間を最小限に抑えるために拘束し、尾の出血技術を練習することをお勧めします。拘束の開始から3分未満で採取した血液は、最適な結果を提供します。

ここで説明するプロトコルは、週に1〜4回のサンプリングに使用されないが、一日二回よりも多くすることができます。繰り返し血液収集を行うことができるが、尾の基部から上方に移動する別のサンプリング部位を使用する必要があり、左右の尾静脈サンプリング部位として交互にされるべきです。げっ歯類の総血液量は、その体重の6〜7％であり、全血液量の15％以下は、2週間の期間内に収集されるべきではありません。血清または血漿を採取したサンプルの体積の約40〜60％を含みます。

いくつかの小さな変更を加えてここで説明したように外側尾静脈を介して血液採取は、マウスで実行されてもよいです。まず、わずかなゲージ（27 G）カテーテルを使用することができます。第二に、それは、マウスを固定化するために、むしろラップよりも、チューブ拘束具を使用することをお勧めします。顎下維管束（200〜500μL）の静脈穿刺を用いて、マウスから得ることができる血液の量を安全に尾静脈（200μlの最大値）から採取することができるよりも大きいです。顎下維管束からのサンプリング血液が最小限の拘束を必要とし、より多くの血液をもたらす可能性があるため、これは、マウスでのサンプリングのための好ましい経路です。

この手順は、その低侵襲性の性質と共に、実行することができるこれで迅速に、また、急性ストレス反応⁶によって血液ベース措置の潜在的な摂動を最小限に抑えることができます。ザ急性ストレス反応は、インターロイキンおよび他の免疫活性因子⁷を含む多くの分子の循環レベル、視床下部-下垂体-副腎軸⁸のホルモン、交感神経系^9、グレリン^10、内因性オピオイド^11、ドーパミンでホルモンを変えることができ、セロトニン^12。これらの分子によって調節されるこれらの分子または他の静止循環対策が望まれる場合には、ストレッサ露光開始の分だけ少なく内でトリガされるストレス応答を最小限にすることが重要です。

ストレス反応は、血液の組成を変化させるだけでなく、交感神経系から増加したドライブを介しているため、血管系の収縮の血液採取のための技術的な障害を表すだけではなく。これは、急性のストレス応答をマウントされたラットからの安定した血流量を得ることが困難になる大きくします。したがって、動物の苦痛はミニムでなければなりません急速に関心のある生理的状態を反映し、サンプルを得るために化さ。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium heparin (1,000 USP units/ml)	Patternson Veterinary Supply	25021040010
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	JT Taylor	JT2020-01
Dermachlor rinse-chlorhexadine	Butler Schein	6356	Topical antiseptic solution, 2% chlorhexidine gluconate
SURFLO Winged Infusion Sets, Terumo, butterfly catheters	VWR Scientific	TESV25BLK
BD Tuberculin 1 cc syringes	VWR Scientific	BD309659
1.5 ml microcentrifuge tubes	VWR Scientific	89202-682
500 μl microcentrifuge tubes	VWR Scientific	21150-330
Scissors, stainless steel, 5"	VWR Scientific	82027-586
500 ml plastic beaker	VWR Scientific	414004-149
Clean cloth wrap	Butler Schein	2993
Velcro tape, 0.75 in width	Monoprice	B004AF9II6	Hook and loop tape
Timer	VWR Scientific	62344-641