Abstract
Воздействие химических веществ (в том числе алкилирующих агентов химического оружия, как серы и азота горчицы) вызывают множество клинических симптомов, включая заживления ран расстройства. Физиологический процесс заживления ран является очень сложным. Формирование грануляционной ткани является ключевым шагом в этом процессе, в результате предварительного закрытия раны и обеспечивая сеть новых капиллярных кровеносных сосудов - либо через васкулогенеза (образование роман) или ангиогенез (прорастание существующих судов). Оба vasculo- и ангиогенез требует функциональной, направленную миграцию эндотелиальных клеток. Таким образом, исследование раннего эндотелиальных клеток (ЕЭС) миграции важно понимать, патофизиологии химически индуцированных расстройств заживления ран и потенциально идентифицировать новые стратегии для терапевтического вмешательства.
Мы оценили ухудшение заживления ран после алкилирования экспозиции агента и проходят потенциальных соединений-кандидатов для трeatment. Мы использовали набор методов, описанных в данном протоколе. Модифицированный Бойден камеру количественно исследовать хемокинез из ЕЭС описано. Кроме того, использование заживления раны анализа в сочетании с анализом трека качественно оценить миграцию показано. Наконец, мы демонстрируем использование TMRM флуоресцентный краситель для исследования митохондриальной мембраны потенциала для выявления основных механизмов возмущенного миграции клеток. Следующий протокол описывает основные методы, которые были адаптированы для расследования ЕЭС.
Introduction
Миграция клеток важно во многих физиологических и патофизиологических процессах, включая развитие различных заболеваний, и заживления ран после повреждения кожи.
После травмы кожи, воспаление снимает повреждены или некротических тканей и грануляции дисководов предварительный закрытие раны и позволяет формирование сети новых капилляров через васкулогенеза (роман образование) или ангиогенез (прорастание существующих пузырьков) 1-3. Оба vasculo- и ангиогенез требует миграцию эндотелиальных клеток. Растущая сеть кровеносных сосудов необходимо транспортировать кислород и питательные вещества пролиферирующих кератиноцитов, которые, в конечном счете подвергаются кератинизации, сформировать новый эпителий и обеспечить закрытие раны.
Нарушение миграции эндотелиальных клеток основной причиной заживления раны расстройства 4,5. Таким образом, методы оценки миграции эндотелиальных клеток начале необходимо исследовать pathophysiolлогии нарушений клеточной миграции и выявить новые стратегии для терапевтического вмешательства.
Кожные воздействие алкилирующих агентов (например, серы и азота горчицы) вызывает заживление ран расстройства 6. Такие соединения были использованы в качестве боевых отравляющих веществ в несколько конфликтов в 20 веке и остается причину сильного беспокойства из-за существующих запасов в политически нестабильных регионах и относительно простым синтезом. Хотя иприт был впервые синтезирован в 1822 году, молекулярной и клинической патологии воздействия SM не понимать в деталях и не противоядие воздействия SM выявлено не было.
Несколько исследований были проведены, чтобы понять и смоделировать ухудшение заживления ран после воздействия SM и проверить потенциальных кандидатов, способных соединений резервирования, что эффект. Шмидт и др. (2009) исследовали влияние хлорамбуцилом, алкилирующего соединения со свойствами, аналогичными СМ в муSE модели эмбриоидного тела и обнаружили значительное, иногда снижение образования сосудов 7 больше, чем 99%. Этот неблагоприятный эффект наиболее выражен на этапе развития, который, в физиологических условиях, доминируют в пролиферации и миграции эндотелиальных клеток-предшественников. Таким образом, эти клетки были идентифицированы, чтобы быть особенно чувствительны к алкилирующих агентов. Steinritz и др. (2010) протестированы поглотители активных форм кислорода (АФК), в частности, N-ацетилцистеин (NAC) и альфа-линоленовой кислоты (АЛК) за их способности снижать токсичность SM в мышиных моделях эмбриоидного тела и, в частности, к восстановить образование сосудов 8. Временные защитные эффекты наблюдались, указывая, что избыточное образование АФК, вероятно, внести свой вклад в неблагоприятных эффектов СМ на заживление. Эти эффекты не являются постоянными, а два соединения-кандидаты могут быть не способны восстановить образование сосудов и заживлению ран в перспективе 8. Howeveг, эти эксперименты были проведены в сложной 3D модели, которая позволит сделал исследование миграции клеток. Таким образом, мы в дальнейшем проходят NAC и ALA для благотворного воздействия на клеточную миграцию ЕЭС, которые имеют ключевую роль в процессе формирования сосуда 9.
Кроме того, есть свидетельства, что ячейки полярность необходима для миграции клеток. Митохондриальной дисфункцией приводит к образованию активных форм кислорода было показано, ухудшает клеточной полярности и, таким образом, может неблагоприятно повлиять на миграцию клеток. Таким образом, живой клетки визуализации с учетом функции митохондрий проводили и эффекты АФК поглотители были исследованы. Следующий протокол описывает общие требования к выращиванию ЕЭС, камерный анализа Бойден, заживления ран анализа, включая анализ отслеживания клеток и использования TMRM для оценки митохондриальной функции в деталях. Важные аспекты экспериментальных протоколов для выращивания EEC и миграции будут выделены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Следующий протокол описывает методы для исследования ранней миграции эндотелиальных клеток. Надлежащее культивирование эндотелиальных клеток сосудов требуется предварительное покрытие из клеточной культуры колбы с желатином, чтобы обеспечить надлежащее пролиферацию и поддержание эндотелиальных фенотипа.
1. Предварительная покрытие клеточной культуры контейнерах
- Растворить желатин в 0,1 М PBS до конечной концентрации 0,1%.
- Автоклав решение с параметрами для жидкого автоклаве (подробнее см инструкции конкретного автоклава).
- Добавить достаточный объем автоклавного раствора желатина в стерильную колбу для культивирования клеток (например, по крайней мере, 5 мл колбу для культивирования клеток, Т25).
- Передача колбы в термостате (37 ° С, 5% СО 2 не требуется, но не мешает) в течение по крайней мере 30 мин.
- Удалите остатки раствора желатина. Используйте предварительно покрытых колб впоследствии (см выращивание клеток) или сразорвал в стерильных условиях до использования.
2. Сотовый Выращивание ранних эндотелиальных клеток
Примечание: Эмбриональные стволовые клетки получены первые эндотелиальные клетки (EEC) были получены из дифференцированных мышиных эмбриональных органов магнитным активирована сортировки клеток на РЕСАМ-1 положительной клеточной фракции, как описано ранее 10,11.
- Культура EEC на покрытые желатином чашки для культивирования клеток в среде DMEM, дополненной 15% FCS, 50 ед / мл пенициллина, 50 U / мл стрептомицина, 200 мкМ L-глутамина, 100 мкМ бета-меркаптоэтанол и 1% заменимых аминокислот. Ручка клетки в стерильных условиях. Выращивают клетки с 5% CO 2 при 37 ° С и 95% влажности до суб-слияния (макс. 80%).
- В суб-слияния, разделения клетки на соотношении 1: 5. Примечание: Отряд эндотелиальных клеток важный шаг.
- Урожай клетки с РТ Accutase. Удалить СМИ, промыть PBS и добавить 1 мл Accutase на 25 см
- Инкубируйте колбы при комнатной температуре в течение 2-10 мин до тех пор, пока клетки не были отключены. Дисперсные клеток и передать их в нужное приложение. Примечание: химическая нейтрализация Accutase не требуется, как это имеет место, когда отобранные клетки хранятся в инкубаторе при 37 ° С. Тем не менее, Accutase активность также может быть уменьшен путем добавления DMEM, содержащей FCS.
- Урожай клетки с РТ Accutase. Удалить СМИ, промыть PBS и добавить 1 мл Accutase на 25 см
3. Бойден палата
Примечание: Бойден камеры анализы были осуществлены с помощью системы вставки светло-непрозрачным полиэтилентерефталата с размером пор 8 мкм.
- Предварительно смажьте фильтр вставки (что подходит для культивирования клеток внутри скважин, таким образом, создавая камеру Бойдена), добавив 500 мкл 0,1% желатина, растворенного в 0,1 М PBS в течение по крайней мере 30 мин.
- Если клетки подвергаются воздействию токсичных химических веществ, не подвергайте зависимости от конкретного эксперимента до сбора клеток. Примечание: Клетки подвергаются до 12,5 мкг хлорамбуцилом / мл DMEM,в течение 24 ч. Что касается конкретного эксперимента, инструкции могут различаться.
- Урожай ЕЕС и определения количества клеток с помощью подсчета клеток камеру. Примечание: Автоматический подсчет устройства могут быть использованы, но они должны быть использованы с осторожностью: подсчет клеток руководство является более точной, и настоятельно рекомендуется.
- Добавить 500 мкл клеточную культуральную среду в нижнюю камеру отсеке Бойденом палаты.
- Добавить точно 10 4 ЕЭС в 500 мкл клеточной культуральной среды на фильтрующего в верхней палате отделения. Устранить пузырьки.
- Инкубируйте фильтрующие элементы в инкубаторе в течение ровно 8 часов.
- Промыть PBS один раз и заменить жидкость с 0,5 мл 4% параформальдегида в обоих отсеках в течение 25 мин для фиксации клеток. Промойте фильтр широко, но, по крайней мере 3 раза с 0,1 М PBS.
- Акцизный мембраны с помощью скальпеля.
- Установите мембрану между двумя стеклянная крышка скользит с монтажной среде, содержащей DAPI ядерной staininг. Обратите внимание на ориентацию. Убедитесь, что только клетки, которые мигрировали к нижней камере стороне мембраны подсчитываются.
- Количество клеток, которые мигрировали к нижней камере стороне мембраны с флуоресцентным микроскопом при 400-кратном увеличении. Не путайте мембранные поры мигрировавших клеток (рис 1А, 1Б). Исследуйте разумное количество биологических повторяет (по крайней мере, 3 биологических повторяет в состоянии).
4. заживления ран Анализ
- В зависимости от имеющегося оборудования, тщательно выбирать культуре клеток блюда или тарелки: При использовании DIC микроскопии, избежать пластиковой поверхности на основе культуры блюда или тарелки, но также использовать устройства, основанные стекла вместо этого.
Примечание: При использовании фазово-контрастной микроскопии, пластиковые, блюд также могут быть использованы. - Развивайте ЕЭС в устройстве подходит для культивирования клеток (например, 4 см со стеклянным дном чашки Петри подходит для изображений живых клеток) До 80% слияния. Важно: не культивировать клетки для завершения слияния.
- Потрите монослоев с стерильные 10 наконечников пипеток мкл. Нажмите наконечник осторожно без слишком большого давления на поверхности посуды и переместить его по прямой линии плавно от одной стороны к other.Wash клетки дважды 0,1 М PBS, чтобы удалить отдельные клетки.
- Добавить достаточный объем среды в чашку с культурой. Если это применимо, добавить соединения, которые должны быть исследованы.
Примечание: 1,5 мл среды, содержащей 15 нг / мл был добавлен альфа-линоленовой кислоты. - Установите культуры блюдо под микроскопом, способным изображений живых клеток. Убедитесь 5% CO 2, 37 ° C и влажной атмосфере.
Примечание: увлажнение особенно важно, чтобы избежать испарения среды. - Приобретать покадровой изображения в течение 24 часов при 10-минутными интервалами. План больших размеров файлов. Примечание: разрешение 512 х 512 пикселей, как правило, достаточно; Однако, мы рекомендуем использовать изображения, по меньшей мере 1024 х 1,024.
- Измерьте ширину зазора при Т = 0 ч и при Т = 24 ч, используя длины инструмента программного обеспечения, предоставляемого с микроскопом или использовать с открытым исходным кодом (например, ImageJ). Примечание: В общем конкретного приобретения и анализа изображений программное обеспечение предоставляется производителем. Таким образом, для технических деталей в отношении использования программного обеспечения, обратитесь к руководству.
Отслеживание 5. Сотовый
- В зависимости от имеющегося оборудования, тщательно выбирать культуре клеток блюда или тарелки: При использовании DIC микроскопии, избежать пластиковой поверхности на основе культуры блюда или тарелки, но также использовать устройства, основанные стекла вместо этого.
Примечание: При использовании фазово-контрастной микроскопии, пластиковые, блюд также могут быть использованы. - Семенной 5 х 10 4 ЕЕС в дополненной среде DMEM в устройство подходит для культивирования клеток (например, 24-многоямный пластины) и культивировать клетки с 5% CO 2 при 37 ° С и 95% влажности в течение 1-2 дней.
- Когда клетки выросли до 80% Слияния, удалить средства массовой информации и культуры клеток с новыми медиа в присутствии соответствующих испытаний веществ (например, 12,5 мкг хлорамбуцилом / мл DMEM),. Всегда включать контрольные клетки (обработанные в растворителе, например, этаноле) при температуре 37 ° С в течение определенного периода времени (24 ч, в зависимости от индивидуальной системы анализа).
- Установите культуры блюдо под микроскопом, способным живого изображения клеток (37 ° С, 5% СО 2 и 95% влажности). Приобретать покадровой изображения в течение 24 часов в заданных интервалах. Получение изображений на 10-минутные интервалы.
- Выполните вручную отслеживание ЕЭС с использованием плагина ImageJ MTrackJ. Выберите 10 ячеек случайным образом из поля зрения и отслеживать их перемещения, добавив точку данных за момент времени с помощью команды из MTrackJ "Добавить".
Примечание: MTrackJ предоставляется бесплатно в течение и ImageJ в зонах [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]ле на [Расбанд, ImageJ ". http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Подробное руководство о плагине MTrackJ доступна на "http://www.imagescience.org".
6. живых изображений сотовый / Оценка митохондриальной мембраны Потенциал
- Развивайте ЕЭС в подходящей для культивирования клеток устройства (например, 4 см со стеклянным дном чашки Петри подходит для изображений живых клеток) до 80% слияния.
Важно: Не культивировать клетки для завершения слияния. - Если применимо, подвергать клетки к воздействию химических веществ. Примечание: Клетки подвергали воздействию 12,5 мкг / мл хлорамбуцил в течение 24 ч. Что касается конкретного эксперимента, инструкции могут различаться.
- Подготовка 10 мМ исходного раствора тетраметилродамин (TMRM) в ДМСО. Защищать от света. Примечание: Исходный раствор можно хранить при -20 ° С.
- Развести маточного раствора в клеточной культуральной среде для рабочего раствора с концентрацией 10 мкМ (1: 1000 разведение). Защищать от светаи использовать как можно скорее. Примечание: рабочий раствор может храниться при комнатной температуре в течение некоторого времени (> 1 ч), однако, подготовка свежего рабочего раствора рекомендуется.
- Добавьте 2 мкл рабочего раствора до 1 мл свежей среды для культивирования клеток (загрузки раствора).
- Загрузка клеток путем замены клеточную культуральную среду с загрузкой раствора. Инкубируют в течение 15 мин при 37 ° С, 5% СО 2 и влажной атмосфере (инкубатор). Внимание: Почти все показатели флуоресценции экспортируются живых клеток с течением времени; Поэтому избегайте длительного загрузку или задержки анализа.
- Без мытья, разместить блюдо под микроскопом подходит для изображений живых клеток. Важно: показатели флуоресценции очень чувствительны к свету, поэтому, во избежание ненужного воздействия света.
- Получение изображений без изменения параметров измерения для обеспечения сопоставимости между различными изображениями.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кожные воздействие алкилирующих агентов вызывает эритему, образование пузырей и кожной язвы, связанный с заживления ран расстройства. Заживление ран требует ангио- и васкулогенез которые основаны на миграции эндотелиальных клеток. Количественное миграции могут быть оценены с использованием камеры анализа Бойденом. Как показано на рисунке 1С воздействия на ЕЭС алкилирующего агента хлорамбуцил привело к значительному снижению клеточной миграции 9. Добавление РОС-поглотитель альфа-линоленовой кислоты (АЛК) непосредственно после воздействия хлорамбуцилом в течение 24 ч существенно спас этот фенотип, почти до уровня контроля.
Бойден камеру анализ является подходящим инструментом для оценки числа (количества) мигрировавших клеток. Тем не менее, анализ не дает информации о поведении миграции клеток. Рисунок 2 показывает, что неэкспонированная ЕЕС в состоянии ликвидировать разрыв в ране и исцеления задницуай в течение 24 часов 9. В отличие, ЕЭС подвергается алкилирующего агента хлорамбуцилом не смогли закрыть разрыв в заживления раны анализа 9. Кроме того, отслеживание клетка одного ЕЭС показали, что под воздействием направленного движения хлорамбуцил не наблюдалось 9. Лечение ЕЭС с Рос-падальщиков удалось восстановить направленную миграцию клеток 9.
Формирование митохондрий АФК была связана с нарушениями клеточной миграции 12. Как показано на рисунке 3 экспозиции ЕЭС к хлорамбуцилом привело к срыву митохондриальной мембраны потенциального 9. Лечение ЕЭС с РОС-поглотителя предотвратить повреждение митохондрий и поддерживается митохондриальную мембранный потенциал.
В целом, все методы, описанные в разделе протокола подходящие инструменты для оценки миграции клеток. Выводы по потери или сохранения митохондриального мембранного потенциала может обеспечить Valuable намеки относительно лежащих в основе молекулярных механизмов нарушения миграции клеток.
Рисунок 1. Бойден камеру анализа. (A) EEC высевали на фильтровальной камеры Бойдена вставками, инкубировали в течение 8 ч, фиксировали и окрашивали с DAPI. Звездочки указывают мигрировали ЕЕС. В представленном изображение в общей сложности 19 клеток можно пересчитать (Фигура 1В). Красные головы стрелками указывают клетки, которые не мигрировали через вставки полностью или которые не полностью в поле зрения и, таким образом, были исключены из подсчета клеток. (Б) Поры (8 мкм) в мембране становятся видимыми при использовании длинных время экспозиции для получения изображения. Не путайте их с мигрировавших клеток. (С) Под контролемУсловия среднем 212 клеток мигрировали через мембрану. Привело экспозиции Хлорамбуцил всего 128 мигрировавших клеток. Лечение хлорамбуцила подвергшихся воздействию ЕЭС с РОС-поглотитель альфа-линоленовой кислоты (АЛК) значительно спас миграции клеток. Символы представляют отдельные результаты с одного фильтра вставки. Черные горизонтальные полосы указывают средства (п = 4), ошибок указывают SD и звездочки указывают на значительные различия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. заживления ран анализ отслеживания / клетка. ЕЕС были обманом обработке (обмен среды) или воздействию 12,5 мкг / мл хлорамбуцилом. После царапин, клетки WERE исследовали в течение 24 часов. () EEC смогли сократить разрыв в заживления ран анализа в течение 24 часов, тогда как хлорамбуцилом открытой ЕЭС не смогли закрыть этот пробел. Лечение с ALA приводит к значительному улучшению клеточной миграции. (В) Средние значения из 3 независимых экспериментов в каждую по 5 повторов технических каждой группе (п = 15 в каждой группе) показаны. Усы представляют стандартные отклонения и звездочки указывают статистические значимые различия (односторонний ANOVA, p <0,05). Измененный Steinritz др. (2014) 9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Оценка митохондриальной мембранного потенциала. EEC были ложно лечение, подвергается хлорамбуцил (12,5 мкг / мл) или chlorambucil подвергается и АЛК (15 нг / мл) лечение. 24 ч после воздействия, клетки были нагружены TMRM в течение 15 мин и сразу же отображены. () Неэкспонированную ЕЭС показали отличный сигнал после TMRM маркировки, указывающей беспрепятственный митохондриальной мембраны потенциал. Экспозиции (В) Хлорамбуцил привело к значительному уменьшению сигнала TMRM. (С) Лечение хлорамбуцила подвергшихся воздействию ЕЭС с РОС-мусорщика альфа-линоленовой кислоты восстанавливается митохондриальную мембранный потенциал. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Кожные воздействие токсичных химических веществ часто приводит к тяжелым расстройством заживления ран. Основные механизмы в значительной степени неизвестны. Заживление ран представляет собой сложный процесс, который состоит из различных фаз (гемостаз, воспаление, пролиферация и ремоделирования). Миграция клеток участвует в каждой фазе, однако, имеет первостепенное значение для формирования грануляционной ткани. Здесь новые кровеносные сосуды формируются либо ангио- или васкулогенеза.
Оба процесса требуют не отразилось миграции предшественника и в начале эндотелиальных клеток. Оценка миграции клеток и выяснения основных механизмов для возмущенного миграции клеток является весьма актуальным в целях разработки новых терапевтических стратегий против ядовито индуцированных расстройств заживления ран.
Миграция клеток может быть оценена с помощью различных подходов. Обычно используется метод анализа Бойден камеру, которая была первоначально введена, чтобы проанализировать антитело-antigан вызвало хемотаксис лейкоцитов на 13. Этот анализ количественный анализ конечной точки, которая отражает вторжение способности клеток из верхнего отсека в Transwell вставки в нижний отсек в ответ на хемоаттрактанту. В методике, описанной в данном документе, не хемоаттрактантной не был добавлен в нижней камере. Таким образом, было исследовано хемокинез (случайный переход без конкретного хемоаттрактанту) из EEC, при условии управления или в ответ на хлорамбуцил.
Вставка состоит из пористой мембране, который позволяет трехмерную миграцию клеток через поры мембраны. Размер пор мембраны должно быть выбрано в зависимости от размера ячейки: поры, которые слишком малы будет предотвратить миграцию клеток полностью, поры, которые являются слишком большими, позволит беспрепятственное прохождение всех клеток. Для ранних эндотелиальных клеток, размер пор 8 мкм рекомендуется. Использование неподходящего размера пор приведет к невоспроизводимых результатов. В Ордг адаптировать протокол к клеткам с различными свойствами, как ЕЭС, мы рекомендуем начать с размером пор больше, чем ядер и увеличить размер пор шаг за шагом, если необходимо. Например, для малых клеток, таких как лейкоциты размер пор 3 мкм рекомендуется.
Важным вопросом является определение времени инкубации до анализа. Со временем, пролиферации клеток (по крайней мере, в контрольных группах) состоится. Это, в свою очередь, будет усиливать количество клеток, которые могут проникать через мембрану, потенциально снижает чувствительность метода: даже при слегка нарушениями миграционных способностей, клетки могут мигрировать в течение длительных периодов времени. Таким образом, длительные периоды (например, 24 ч) не рекомендуется для эндотелиальных клеток. С другой стороны, если инкубационный слишком коротка после посева клеток, только незначительные количества клеток будет прошли через мембрану. 8 ч инкубации было найдено оптимальное. После определенного времени инкубации 8 часов, а клеткивновь фиксируется, витражи и вручную пересчитать.
Есть три возможных подхода для анализа: (1) клетки на верхней стороне мембраны (которые не мигрировали) удаляются тампоном. Затем клетки на нижней стороне мембраны (мигрировавших клеток) окрашивали либо с цитологических (например, гематоксилином) или флуоресцентным красителем (например, DAPI) и подсчитывают. (2) В качестве альтернативы, клетки на нижней стороне могут быть окрашены флуоресцентным красителем первой и отделяются затем (например, с использованием трипсина). Затем флуоресценции количественно с помощью устройства считывания флуоресценции. (3) Рекомендуется использовать темного цвета пористых мембран, которые блокируют прохождение света, тем самым позволяя дифференциацию неперемещенных клеток (клеток на верхней части мембраны) и мигрировавших клеток (в нижней части мембраны). После окрашивания флуоресценции (цитологические красители не могут быть использованы) клетки на нижней стороне подсчитывают с помощью флуоресцентного микроскопа. Важно, чтобы не Confound ориентации мембраны. Использование матовой мембраны устраняет необходимость удаления неперемещенных клетки. Использование непрозрачных мембраны, флуоресцентного окрашивания и подсчета клеток ручного оказалось превосходит другие подходы.
В общем, камера анализа Бойден представляет собой анализ, который прост в обращении и, таким образом, часто используется тест для оценки миграции клеток. Тем не менее, существуют две основные недостатки: (1) Бойден камеру Анализ конечных точек анализа. Это означает, что если момент времени анализа является неправильным, результат может вводить в заблуждение. (2) Анализ не легко автоматизировать. Тем не менее, этот анализ является одним из наиболее ценных инструментов для оценки миграции клеток.
В отличие от статической Бойденом камеры анализа, анализа заживления ран (также называемый закрытия зазора анализа или анализа царапинам) является динамическим анализа в реальном времени. Это двумерный анализ миграции без трехмерных движений вторжения клеток, После "ранив" слоев клеток с кончика пипетки, клетки мигрируют в зазор. Анализ прост для выполнения и позволяет избежать проблем статического анализа конечной точки. Тем не менее, анализ имеет некоторые проблемы: (1) изображения живых клеток микроскопической системы (37 ° C, 5% СО 2 с влажной атмосфере) требуется. Убедитесь, что культура клеток блюда не высыхают. (2) Покадровый получения изображения приведет к созданию больших файлов данных в зависимости от параметров (разрешение, интервал), используемых. (3) Царапины на слой клеток с кончика пипетки не так легко, как это может на первый взгляд. Слишком большое давление может привести к повреждению поверхности блюдо, которое может привести к появлению артефактов. Кроме того, ширина зазора может отличаться в пустом и могут отличаться между различными исследователями. Опытный следователь рекомендуется. (4) количество образцов, которые могут быть запущены параллельно ограничивается оборудования. Тем не менее, для заживления ран анализа является еще одним ценным инструментом для количественного и качеторитетных оценка миграции клеток. Информация о скорости миграции, расстояние миграции, направленная миграция могут быть собраны в одной экспериментальной установки. Отслеживать сотового в двумерной системе не очень сложно и может быть выполнена с помощью программного обеспечения с открытым исходным кодом (например, ImageJ и MTrackJ).
Окраска чашки для культивирования клеток важно не только для прикрепления клеток, но имеет значительное влияние на функции клеток в отношении миграции. Эндотелиальные клетки рутинно выращивают на 0,1% желатином покрытием поверхностей. Использование без покрытия поверхность для выращивания эндотелиальных клеток в результате снизилась распространения 14. Покрытия другие (например, фибронектин) были найдены также подходит для краткосрочного культивирования, однако, желатин покрытия показали превосходную производительность в долгосрочных экспериментов культивирования 15.
Есть многочисленные флуоресцентные красители на рынке для визуализации живых клеток. Мы чосена TMRM исследовать митохондриальную мембранный потенциал. Многие другие красители (например, JC-1, TMRE) демонстрируют сравнимую производительность. В отличие от монохромных зондов (TMRM, TMRE), JC-1 флуоресценции сдвигается с зеленого на красный после накопления в митохондриях. Это позволяет логометрического полуколичественный анализ митохондриальной состояния поляризации, но затрудняет двойные эксперименты окрашивания (например, с помощью трекера красители для выявления митохондрий) 16. В нашем опыте сам краситель менее важно для эксперимента, тогда как экспериментальный дизайн, обработка клеток и приобретение сложной и требует гораздо больше внимания. Почти все флуоресцентные красители чувствительны к свету. Таким образом, нагрузка сотовой ячейки должно быть сделано в темноте. Сотовый загрузка требуется 15-30 мин. Длительное время загрузки не приведет к увеличению сигналов и не рекомендуется. Хотя конкретные сигналы могут быть обнаружены после длительного нагружения, краситель может накапливаться в субклеточном Compartные или может быть даже уволен из клетки. Как следствие, клетки должны быть загружены непосредственно перед анализом и не обязательно в начале эксперимента. Концентрация красителем, как правило, находится в диапазоне от 10 мкм. Тем не менее, с TMRM гораздо более низкие концентрации (20 нМ) были найдены достаточно для маркировки и до сих пор дал неплохие результаты. Как показано на рисунке 3 результате маркировки 24 ч экспозиции сообщение хлорамбуцил в отдельном потери митохондрий мембранного потенциала. Лечение хлорамбуцил подвергается ЕЭС с Рос-поглотители удалось сохранить митохондриальной мембраны потенциал на 24 часов после первоначального воздействия.
В целом, Бойдена камеры анализе ранозаживляющее анализа в сочетании с одной анализа клеток трека являются ценными инструментами для оценки миграционного поведения в отношении качественных и количественных аспектов. Маркировка митохондриальной потенциала с TMRM может помочь выявить основные механизмы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
- Bauer, S. M., Bauer, R. J., Velazquez, O. C. Angiogenesis, vasculogenesis, and induction of healing in chronic wounds. Vascular and Endovascular Surgery. 39, 293-306 (2005).
- Reinke, J. M., Sorg, H. Wound repair and regeneration. European Surgical Research. Europaische Chirurgische Forschung. Recherches Chirurgicales Europeennes. 49, 35-43 (2012).
- Hart, J. Inflammation. 1: Its role in the healing of acute wounds. Journal of Wound Care. 11, 205-209 (2002).
- Liu, Z. J., Hyperoxia Velazquez, O. C. endothelial progenitor cell mobilization, and diabetic wound healing. Antioxidants & Redox Signaling. 10, 1869-1882 (2008).
- Gallagher, K. A., Goldstein, L. J., Thom, S. R., Velazquez, O. C. Hyperbaric oxygen and bone marrow-derived endothelial progenitor cells in diabetic wound healing. Vascular. 14, 328-337 (2006).
- Kehe, K., Balszuweit, F., Steinritz, D., Thiermann, H. Molecular toxicology of sulfur mustard-induced cutaneous inflammation and blistering. Toxicology. 263, 12-19 (2009).
- Schmidt, A., et al. Nitrogen mustard (Chlorambucil) has a negative influence on early vascular development. Toxicology. 263, 32-40 (2009).
- Steinritz, D., et al. Effect of N-acetyl cysteine and alpha-linolenic acid on sulfur mustard caused impairment of in vitro endothelial tube formation. Toxicological Sciences. 118, 521-529 (2010).
- Steinritz, D., et al. Chlorambucil (nitrogen mustard) induced impairment of early vascular endothelial cell migration - Effects of alpha-linolenic acid and N-acetylcysteine. Chemico-biological Interactions. 219C, 143-150 (2014).
- Schmidt, A., et al. Influence of endostatin on embryonic vasculo- and angiogenesis. Developmental Dynamics : an Official Publication of the American Association of Anatomists. 230, 468-480 (2004).
- Dainiak, M. B., Kumar, A., Galaev, I. Y., Mattiasson, B. Methods in cell separations. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 106, 1-18 (2007).
- Wang, Y., et al. Regulation of VEGF-induced endothelial cell migration by mitochondrial reactive oxygen species. American Journal of Physiology. Cell physiology. 301, C695-C704 (2011).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Relou, I. A., Damen, C. A., van der Schaft, D. W., Groenewegen, G., Griffioen, A. W. Effect of culture conditions on endothelial cell growth and responsiveness. Tissue & Cell. 30, 525-530 (1998).
- Smeets, E. F., von Asmuth, E. J., vander Linden, C. J., Leeuwenberg, J. F., Buurman, W. A. A comparison of substrates for human umbilical vein endothelial cell culture. Biotechnic & Histochemistry : Official Publication of the Biological Stain Commission. 67, 241-250 (1992).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. BioTechniques. 50, 98-115 (2011).
