Abstract
L'esposizione a sostanze chimiche (compresi alchilanti agenti di guerra chimica come mostarde zolfo e di azoto) provoca una pletora di sintomi clinici tra cui il disturbo di guarigione delle ferite. Il processo fisiologico di guarigione della ferita è molto complessa. La formazione di tessuto di granulazione è un passo fondamentale in questo processo con un conseguente chiusura preliminare ferita e fornendo una rete di nuovi vasi sanguigni capillari - sia attraverso vasculogenesi (romanzo di formazione) o angiogenesi (germinazione delle navi esistenti). Sia vasculo- e angiogenesi richiedono funzionale, la migrazione diretta delle cellule endoteliali. Così, l'indagine della migrazione precoce delle cellule endoteliali (CEE) è importante per capire la fisiopatologia della chimica indotta guarigione delle ferite e disturbi potenzialmente individuare nuove strategie di intervento terapeutico.
Abbiamo valutato difficoltà nella guarigione dopo alchilanti esposizione agente e testati potenziali composti candidati treatment. Abbiamo usato una serie di tecniche descritte in questo protocollo. Una camera di Boyden modificato per investigare quantitativamente chemochinesi di CEE è descritta. Inoltre, l'uso di guarigione della ferita test in combinazione con analisi pista per valutare qualitativamente migrazione è illustrato. Infine, dimostriamo l'uso del TMRM colorante fluorescente per la ricerca del potenziale di membrana mitocondriale per identificare i sottostanti meccanismi della migrazione cellulare disturbato. Il protocollo che segue descrive le tecniche di base che sono state adattate per la ricerca di CEE.
Introduction
La migrazione delle cellule è importante in molti processi fisiologici e fisiopatologici, tra cui lo sviluppo, varie malattie, e la guarigione delle ferite dopo lesioni della pelle.
Dopo lesioni della pelle, infiammazione rimuove unità tessuti e granulazione danneggiati o necrotiche chiusura preliminare ferita e permette la formazione di una rete di nuovi capillari attraverso vasculogenesi (formazione romanzo) o angiogenesi (germinazione di vescicole esistenti) 1-3. Sia vasculo- e angiogenesi richiedono migrazione delle cellule endoteliali. La crescente rete di vasi sanguigni è essenziale per il trasporto di ossigeno e sostanze nutritive al proliferare cheratinociti che alla fine subiscono cheratinizzazione, formare un nuovo epitelio e fornire la chiusura della ferita.
La migrazione deteriorate delle cellule endoteliali è una causa di fondo di guarigione delle ferite disturbo 4,5. Così, i metodi per valutare la migrazione delle cellule endoteliali primi sono tenuti a esplorare la pathophysiollogia dei disturbi di migrazione delle cellule e di individuare nuove strategie di intervento terapeutico.
Esposizione cutanea ad agenti alchilanti (ad esempio, zolfo e mostarde azoto) provoca la guarigione della ferita disturbo 6. Tali composti sono stati utilizzati come agenti di guerra chimica in molti conflitti nel 20 ° secolo e rimangono motivo di forte preoccupazione a causa di scorte esistenti in regioni politicamente instabili e relativamente semplice sintesi. Anche se la senape di zolfo fu sintetizzato nel 1822, la patologia molecolare e clinica di esposizione SM non è compreso nei dettagli e un antidoto per l'esposizione SM è stato identificato.
Sono stati condotti numerosi studi per comprendere e modellare difficoltà nella guarigione dopo l'esposizione SM e per testare potenziali composti candidati capaci di riservare tale effetto. Schmidt et al. (2009) testato l'effetto di clorambucile, un composto alchilante con proprietà simili a SM in moumodelli corpo embrioide sé e ha trovato una drammatica, a volte riduzione oltre il 99% in formazione dei vasi 7. Questo effetto negativo è stato più pronunciato in una fase di sviluppo che, in condizioni fisiologiche, è dominato dalla proliferazione e la migrazione delle cellule precursori endoteliali vascolari. Così, queste cellule sono state identificate per essere particolarmente sensibile agli agenti alchilanti. Steinritz et al. (2010) testato scavengers di specie reattive dell'ossigeno (ROS), in particolare N-acetilcisteina (NAC) e acido linolenico alfa (ALA) per la loro capacità di ridurre la tossicità SM in modelli di topo embrioide corpo e in particolare, per ripristinare la formazione dei vasi 8. Sono stati osservati effetti protettivi temporanei, che indica che l'eccessiva formazione di ROS è stato in grado di contribuire agli effetti negativi della SM sulla guarigione delle ferite. Questi effetti non sono permanenti e due composti candidati possono non essere in grado di ripristinare la formazione dei vasi e la guarigione della ferita a lungo termine 8. However, quegli esperimenti sono stati condotti in un modello complesso in 3D che ha fatto autorizzazione di indagare su migrazione cellulare. Così, abbiamo successivamente testato NAC e ALA per gli effetti benefici sulla migrazione cellulare di CEE, che hanno un ruolo chiave nel processo di formazione dei vasi 9.
Inoltre, è dimostrato che la polarità cellulare è necessaria per la migrazione delle cellule. Disfunzione mitocondriale che porta alla formazione di ROS ha dimostrato di ridurre la polarità delle cellule e può quindi influenzare negativamente la migrazione delle cellule. Pertanto, cellule vive quanto riguarda la funzione mitocondriale è stata eseguita e gli effetti di scavengers ROS sono stati esaminati. Il protocollo che segue descrive i requisiti generali per la coltivazione della CEE, del test camera di Boyden, la guarigione della ferita test tra cui l'analisi di monitoraggio delle cellule e l'uso di TMRM per la valutazione della funzione mitocondriale nei dettagli. Aspetti importanti di protocolli sperimentali per la coltivazione CEE e la migrazione sono evidenziati.
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Protocol
Il protocollo che segue descrive le tecniche per lo studio della migrazione delle cellule endoteliali presto. La corretta coltivazione di cellule endoteliali vascolari richiede pre-rivestimento dei fiasche di coltura cellulare con gelatina per garantire la corretta proliferazione e la manutenzione di un fenotipo endoteliale.
1. Pre-rivestimento di cella cultura palloni
- Sciogliere la gelatina in 0,1 M PBS ad una concentrazione finale di 0,1%.
- Autoclave la soluzione con i parametri per autoclave liquido (per dettagli vedere le istruzioni dell'autoclave specifico).
- Aggiungere volume sufficiente di soluzione di gelatina autoclavato in un pallone di coltura cellulare sterile (ad esempio, almeno 5 ml per un pallone di coltura di cellule T25).
- Trasferire i flaconi in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2 non è necessaria, ma non interferisce) per almeno 30 min.
- Rimuovere la soluzione di gelatina rimanente. Utilizzare i palloni preverniciati successivamente (vedi coltura cellulare) o store in condizioni sterili fino al momento dell'uso.
2. Cella coltivazione delle antiche cellule endoteliali
Nota: cellule staminali embrionali derivate prime cellule endoteliali (CEE) sono state ottenute da differenziati corpi embrionali murine per separazione delle cellule magnetica attivata della frazione di cellule positive PECAM-1 come descritto in precedenza 10,11.
- Culture CEE su gelatina rivestite piatti di coltura cellulare in DMEM supplementato con 15% FCS, 50 U / ml di penicillina, 50 U / ml di streptomicina, 200 mM L-glutammina, 100 mM ß-mercaptoetanolo e 1% di aminoacidi non essenziali. Gestire le cellule in condizioni sterili. Coltivare le cellule con 5% di CO 2 a 37 ° C e 95% di umidità fino sub-confluenza (max. 80%).
- Al sub-confluenza, dividere le celle in un rapporto 1: 5. Nota: Il distacco delle cellule endoteliali è un passaggio fondamentale.
- Raccogliere le cellule con RT accutase. Rimuovere i supporti, risciacquare con PBS e aggiungere 1 ml di accutase per 25 centimetri
- Incubare la muffola a temperatura ambiente per 2-10 minuti fino a quando le cellule sono distaccato. Disperdere le cellule e trasferirli l'applicazione desiderata. Nota: Una neutralizzazione chimica del accutase non è richiesto come avviene quando le cellule seminate sono memorizzati in incubatrice a 37 ° C. Tuttavia, accutase attività può essere diminuita aggiungendo DMEM contenente FCS.
- Raccogliere le cellule con RT accutase. Rimuovere i supporti, risciacquare con PBS e aggiungere 1 ml di accutase per 25 centimetri
3. Boyden Chamber
Nota: saggi camera di Boyden vengono effettuate utilizzando sistemi di inserti di polietilene tereftalato chiaro opaco con 8 micron dimensione dei pori.
- Pre-coat gli inserti del filtro (che si adattano all'interno pozzetti di coltura cellulare creando così una camera di Boyden) aggiungendo 500 ml di 0,1% di gelatina disciolti in 0,1 M PBS per almeno 30 min.
- Se le cellule devono essere esposti a sostanze chimiche tossiche, esporre secondo il disegno sperimentale specifico prima raccolta di cellule. Nota: Le cellule sono state esposte a 12,5 mcg clorambucil / ml DMEMper 24 ore. Per quanto riguarda il disegno sperimentale specifico, le istruzioni possono variare.
- Harvest CEE e determinare il numero di cella utilizzando una camera di conteggio delle cellule. Nota: Distributori automatici di conteggio possono essere utilizzati, ma devono essere usati con cautela: conteggio manuale delle cellule è più preciso ed è altamente raccomandato.
- Aggiungere 500 microlitri terreno di coltura cellulare nel vano camera inferiore della camera di Boyden.
- Aggiungere esattamente 10 4 CEE in 500 microlitri terreno di coltura cellulare per inserto filtro nel vano camera superiore. Eliminare le bolle.
- Incubare gli inserti del filtro in incubatrice per esattamente 8 ore.
- Risciacquare una volta con PBS e sostituire il mezzo con 0,5 ml di 4% paraformaldeide in entrambi gli scomparti per 25 minuti per la fissazione delle cellule. Lavare il filtro ampiamente ma almeno 3 volte con 0,1 M PBS.
- Accise le membrane con un bisturi.
- Montare la membrana tra due vetrini di vetro con il mezzo di montaggio contenente DAPI per stainin nucleareg. Prestare attenzione all'orientamento. Assicurarsi che solo le cellule che sono migrati verso il lato vano inferiore della membrana vengono contati.
- Contare le cellule che sono migrati verso il lato vano inferiore della membrana con un microscopio a fluorescenza con ingrandimento 400X. Non confondere pori della membrana con le cellule migrate (Figura 1A, 1B). Indagare un numero ragionevole di repliche biologiche (almeno 3 repliche biologiche per condizione).
4. Wound Healing Assay
- A seconda della dotazione disponibile, scegliere con cura i piatti di coltura cellulare o piastre: Quando si utilizza la microscopia DIC, evitare di superficie plastica piatti della cultura basato o pozzetti ma utilizzare dispositivi basati su vetro, invece.
Nota: Se si utilizza la microscopia a contrasto di fase, piatti di plastica a base possono essere usati anche. - Coltivare CEE in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio, 4 centimetri di vetro Petri fondo adatto per l'imaging cellulare dal vivo) Fino all'80% di confluenza. Importante: non coltivare le cellule per completare confluenza.
- Gratta monostrati con sterili 10 consigli microlitri pipetta. Spingere la punta delicatamente senza troppa pressione sulla superficie piatto e spostarlo in linea retta agevolmente da un lato al other.Wash le cellule due volte con 0,1 M PBS per rimuovere le cellule staccate.
- Aggiungere un volume sufficiente di mezzo al piatto di coltura. Se del caso, aggiungere i composti che devono essere esaminati.
Nota: 1.5 ml di mezzo contenente 15 ng / ml alfa è stato aggiunto acido linolenico. - Montare il piatto di coltura al microscopio capace di imaging cellulare dal vivo. Assicurare 5% di CO 2, 37 ° C e atmosfera umidificata.
Nota: umidificazione è particolarmente importante per evitare evaporazione media. - Acquisire time-lapse immagini oltre 24 ore a intervalli di 10 min. Piano per file di grandi dimensioni. Nota: Una risoluzione di 512 x 512 pixel è generalmente sufficiente; tuttavia, si consiglia di utilizzare le immagini di almeno 1.024 x 1,024.
- Misurare la fessura su t = 0 ore e al tempo t = 24 ore utilizzando lo strumento lunghezza del software fornito con il microscopio o utilizzare software open source (per esempio, ImageJ). Nota: In generale software specifico di acquisizione e analisi delle immagini è fornito dal produttore. Pertanto, per i dettagli tecnici relativi all'uso del software, consultare il manuale.
Monitoraggio 5. cellulare
- A seconda della dotazione disponibile, scegliere con cura i piatti di coltura cellulare o piastre: Quando si utilizza la microscopia DIC, evitare di superficie plastica piatti della cultura basato o pozzetti ma utilizzare dispositivi basati su vetro, invece.
Nota: Se si utilizza la microscopia a contrasto di fase, piatti di plastica a base possono essere usati anche. - Seme 5 x 10 4 CEE in DMEM integrato in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio, 24-pozzetti) e coltivare le cellule con 5% di CO 2 a 37 ° C e 95% di umidità per 1-2 giorni.
- Quando le cellule sono cresciuti fino ad un 80% Confluenza, rimuovere i media e la cultura delle cellule con i nuovi media, in presenza dei rispettivi sostanze di prova (ad esempio, 12,5 mcg chlorambucil / ml DMEM). Sempre includere cellule di controllo (trattati con il solvente, ad esempio, etanolo) a 37 ° C per un certo periodo di tempo (24 ore, a seconda del sistema di dosaggio individuale).
- Montare il piatto di coltura al microscopio capace di vivo imaging cellulare (37 ° C, 5% CO 2 e 95% di umidità). Acquisire time-lapse immagini oltre 24 ore a intervalli predefiniti. Acquisire immagini a intervalli di 10 min.
- Eseguire il monitoraggio manualmente della CEE con l'uso del plugin ImageJ MTrackJ. Scegli 10 celle a caso dal campo visivo e seguire i loro movimenti con l'aggiunta di un punto dati per ogni punto nel tempo utilizzando il "Aggiungi" il comando di MTrackJ.
Nota: MTrackJ è disponibile gratuitamente presso e ImageJ è disponibil [Meijering, Mtrackj "http://www.imagescience.org/meijering/software/mtrackj/".]le a [Rasband, ImageJ. "http://rsbweb.nih.gov/ij/"]. Un manuale dettagliato sul plugin MTrackJ è disponibile a "http://www.imagescience.org".
6. Imaging cellulare dal vivo / Valutazione del potenziale di membrana mitocondriale
- Coltivare CEE in un dispositivo di coltura cellulare adeguata (ad esempio 4 cm vetro Petri inferiore adatto per l'imaging cellulare dal vivo) fino ad una confluenza di 80%.
Importante: Non coltivare le cellule per completare confluenza. - Se del caso, esporre le celle a sostanze chimiche. Nota: Le cellule sono state esposte a 12,5 ug / ml clorambucile per 24 ore. Per quanto riguarda il disegno sperimentale specifico, le istruzioni possono variare.
- Preparare una soluzione 10 stock mM di tetrametilrodamina (TMRM) in DMSO. Proteggere dalla luce. Nota: La soluzione madre può essere conservata a -20 ° C.
- Diluire la soluzione madre in mezzo di coltura cellulare per una soluzione di lavoro con una concentrazione di 10 mM (1: 1.000) diluizione. Proteggere dalla lucee utilizzare il più presto possibile. Nota: La soluzione di lavoro può essere conservata a temperatura ambiente per un certo tempo (> 1 ora), tuttavia, la preparazione di una soluzione di lavoro fresco è altamente raccomandato.
- Aggiungere 2 ml di soluzione di lavoro per 1 ml di mezzo (soluzione di caricamento) fresco coltura cellulare.
- Caricare le cellule sostituendo il mezzo di coltura cellulare con la soluzione di carico. Incubare per 15 minuti a 37 ° C, 5% CO 2 e l'atmosfera umidificata (incubatore). Attenzione: Quasi tutti gli indicatori di fluorescenza vengono esportati dalle cellule nel tempo vivente; quindi evitare di caricare prolungata o analisi ritardato.
- Senza lavaggio, mettere il piatto sotto un microscopio adatto per l'imaging cellulare dal vivo. Importante: gli indicatori di fluorescenza sono molto sensibile alla luce, quindi, evitare l'esposizione alla luce non necessaria.
- Acquisire le immagini senza modificare i parametri di acquisizione per garantire la comparabilità tra le immagini differenti.
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Representative Results
Esposizione cutanea ad agenti alchilanti provoca eritema, formazione di bolle e ulcere cutanea che è associato con un disturbo guarigione della ferita. La guarigione della ferita richiede vasculogenesi angio e che si basano sulla migrazione delle cellule endoteliali. Migrazione quantitativa può essere valutata mediante l'uso del dosaggio camera di Boyden. Come mostrato nella Figura 1C esposizione CEE al clorambucile agente alchilante determinato una significativa diminuzione migrazione cellulare 9. L'aggiunta di acido linolenico ROS-scavenger alpha (ALA) direttamente dopo l'esposizione a clorambucil per 24 hr salvato significativamente questo fenotipo, quasi a livelli di controllo.
Il test camera di Boyden è uno strumento atto a valutare il numero (quantità) di cellule migrate. Tuttavia, il test non fornisce informazioni sul comportamento di migrazione delle cellule. Figura 2 dimostra che non impressionate CEE sono in grado di colmare il divario nella ferita e la guarigione culoay entro 24 ore 9. Al contrario, CEE esposto al clorambucile agente alchilante non erano in grado di colmare il divario nella guarigione delle ferite test 9. Inoltre, il monitoraggio cella singola CEE rivelato che sotto l'influenza di clorambucile movimento diretto non è stata osservata 9. Trattamento della CEE con ROS-spazzini è stato in grado di ripristinare la regia migrazione cellulare 9.
Formazione mitocondriale di ROS è stato associato a perdita di valore di migrazione delle cellule 12. Come mostrato in Figura 3 esposizione CEE al clorambucile portato alla ripartizione del potenziale di membrana mitocondriale 9. Trattamento della CEE con ROS-scavenger prevenuto il danno mitocondriale e mantenuto il potenziale di membrana mitocondriale.
In sintesi, tutti i metodi descritti nella sezione del protocollo sono strumenti al fine di valutare la migrazione cellulare. Le conclusioni sulla perdita o conservazione del potenziale di membrana mitocondriale può fornire vsuggerimenti aluable riguardanti i meccanismi molecolari alla base della migrazione delle cellule compromessa.
Figura 1. Boyden test camera. (A) CEE sono state seminate su inserti filtranti camera di Boyden, incubate per 8 ore, fisso e macchiato con DAPI. Asterischi indicano migrati CEE. Nell'immagine presentato un totale di 19 celle può essere contato (Figura 1B). Freccia teste rosse indicano le cellule che non hanno migrato attraverso l'inserto completamente o che non sono completamente nel campo visivo e quindi sono stati esclusi dal conteggio delle cellule. (B) I pori (8 micron) nella membrana diventano visibili con lunghi tempi di esposizione per l'acquisizione delle immagini. Non confonderli con le cellule migrate. (C) Sotto il controllocondizioni una media di 212 cellule migrate attraverso la membrana. Esposizione Chlorambucil portato solo 128 cellule migrate. Trattamento della CEE chlorambucil esposti con l'acido linolenico ROS-scavenger alfa (ALA) la migrazione delle cellule in modo significativo in salvo. I simboli rappresentano i singoli risultati di un inserto del filtro. Barre orizzontali nere indicano mezzi (n = 4), barre di errore indicano SD e asterischi indicano differenze significative. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Ferita guarigione test / monitoraggio delle cellule. CEE erano sham trattati (scambio di media) o esposti a 12,5 mcg / ml clorambucile. Dopo aver grattato, cellule were indagato per 24 ore. (A) CEE sono stati in grado di colmare il divario nel saggio guarigione della ferita entro 24 ore, mentre chlorambucil esposto CEE non erano in grado di colmare il divario. Il trattamento con ALA ha determinato un miglioramento significativo della migrazione cellulare. (B) i valori medi da 3 esperimenti indipendenti ciascuna con 5 repliche tecniche per gruppo (n = 15 per gruppo) sono mostrati. Barre di errore rappresentano deviazioni standard e asterischi indicano differenze statisticamente significative (One-way ANOVA, p <0,05). Modificato da Steinritz et al. (2014) 9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Valutazione del potenziale di membrana mitocondriale. CEE erano sham-trattati, esposti a clorambucil (12,5 mcg / ml) o chlorambUCIL esposta e ALA (15 ng / ml) trattati. 24 ore dopo l'esposizione, le cellule sono state caricate con TMRM per 15 minuti e subito ripreso. (A) non esposto CEE ha rivelato un segnale distinto dopo etichettatura TMRM che indica un potenziale di membrana mitocondriale inalterata. Esposizione (B) Chlorambucil ha determinato una significativa diminuzione del segnale TMRM. (C) Trattamento di chlorambucil esposti CEE con l'acido alfa linolenico ROS-scavenger ripristinato il potenziale di membrana mitocondriale. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Esposizione cutanea a sostanze chimiche tossiche si traduce spesso in grave disturbo guarigione delle ferite. I meccanismi alla base sono in gran parte sconosciuti. La guarigione della ferita è un processo complesso che si compone di diverse fasi (emostasi, infiammazione, proliferazione e rimodellamento). Migrazione cellulare è coinvolto in ogni fase, tuttavia, è di fondamentale importanza per la formazione del tessuto di granulazione. Qui, nuovi vasi sanguigni si formano mediante angio o vasculogenesi.
Entrambi i processi richiedono la migrazione inalterata di precursori e cellule endoteliali primi. Valutazione della migrazione cellulare e chiarire i meccanismi alla base della migrazione delle cellule disturbato è molto importante per lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche contro disturbi di guarigione sostanza tossica indotta ferita.
La migrazione cellulare può essere valutata da approcci diversi. Una tecnica comunemente usato è il dosaggio camera di Boyden originariamente introdotto per analizzare anticorpo antigit causato chemiotassi sui leucociti 13. Questo test è un test endpoint quantitativa che riflette la capacità di invasione delle cellule dal vano superiore di un inserto transwell al vano inferiore in risposta ad un fattore chemiotattico. Nella tecnica qui descritta, senza chemiotattico stato aggiunto alla camera inferiore. Così chemochinesi (migrazione casuale senza chemoattrattante specifico) di CEE sotto condizione di controllo o in risposta al clorambucile è stata studiata.
L'inserto è costituito da una membrana porosa che permette tre migrazione cellulare dimensionale attraverso i pori della membrana. La dimensione dei pori della membrana deve essere scelta in relazione alla dimensione della cella: pori che sono troppo piccoli impedisce completamente la migrazione cellulare, pori che sono troppo grandi permetterà passaggio indisturbato di tutte le cellule. Per le cellule endoteliali primi, si consiglia una dimensione dei pori di 8 micron. L'uso di una dimensione dei pori non appropriati darà luogo a risultati riproducibili. In order per adattare il protocollo di cellule con differenti proprietà come CEE, si consiglia di iniziare con una dimensione dei pori più grandi dei nuclei e aumentare la dimensione dei pori passo-passo, se necessario. Ad esempio, per piccole cellule come leucociti si raccomanda una dimensione dei pori di 3 micron.
Un problema critico è la determinazione del tempo di incubazione fino all'analisi. Nel corso del tempo, la proliferazione cellulare (almeno in gruppi di controllo) avrà luogo. Questo a sua volta amplifica il numero di cellule che possono penetrare attraverso la membrana, riducendo potenzialmente la sensibilità del metodo: anche con abilità migratori leggermente ridotta, le cellule possono essere in grado di migrare per lunghi periodi di tempo. Pertanto, lunghi periodi (ad esempio 24 ore) non sono raccomandati per le cellule endoteliali. D'altra parte, se l'incubazione è troppo breve dopo la semina cellulare, solo minor quantità di cellule saranno trascorsi membrana. Un incubazione 8 ore è stato trovato ottimale. Dopo il tempo di incubazione definito di 8 ore, le cellule ari fisso, macchiato e contati manualmente.
Ci sono tre possibili approcci di analisi: (1) le cellule sulla parte superiore della membrana (che non sono emigrati) vengono rimossi da un tampone. Poi sono colorate le cellule sulla parte inferiore della membrana (cellule migrate) o con una citologica (ad esempio, ematossilina) o un colorante fluorescente (ad esempio, DAPI) e sono contati. (2) In alternativa, le cellule sul lato inferiore possono essere colorati con un colorante fluorescente prima e si staccano successivamente (ad esempio, mediante l'uso di tripsina). La fluorescenza è quindi quantificato mediante l'uso di un lettore di fluorescenza. (3) Si consiglia di utilizzare membrane porose di colore scuro che bloccano la trasmissione della luce consentendo in tal modo la differenziazione di cellule non migrate (cellule sulla parte superiore della membrana) e le cellule migrate (sul fondo della membrana). Dopo la colorazione in fluorescenza (coloranti citologici non possono essere utilizzati) celle del lato inferiore vengono contati utilizzando un microscopio a fluorescenza. Non è importante confound l'orientamento membrana. Utilizzando una membrana opaca elimina la necessità di rimuovere le cellule non migrate. L'uso di membrane opache, colorazione fluorescente e conteggio manuale delle cellule è risultato superiore agli altri approcci.
In generale, il dosaggio camera di Boyden è un metodo che è facile da gestire e quindi è un test frequentemente usato per la valutazione della migrazione cellulare. Tuttavia, ci sono due svantaggi principali: (1) Il test camera di Boyden è un test endpoint. Ciò significa che, se il punto di tempo di analisi è corretta, il risultato può essere fuorviante. (2) Il test non è facile da automatizzare. Tuttavia, questo saggio è uno degli strumenti più importanti per la valutazione della migrazione cellulare.
In contrasto con la statica Boyden dosaggio camera, la guarigione della ferita dosaggio (indicato anche come test di chiusura del gap o dosaggio scratch) è un test dinamico in tempo reale. Si tratta di un test a due dimensioni di migrazione senza tre movimenti di invasione delle cellule tridimensionali. Dopo "ferimento" di strati di cellule con un puntale, le cellule migrano nella fessura. Il test è semplice da eseguire ed evita i problemi di un test endpoint statico. Tuttavia, il saggio presenta alcune sfide: (1) un sistema microscopico imaging cellulare dal vivo (37 ° C, 5% di CO 2 in atmosfera umidificata) è necessaria. Assicurarsi che i piatti di coltura cellulare non si asciugano. (2) Time-lapse acquisizione delle immagini si tradurrà in grandi quantità di dati a seconda dei parametri (risoluzione, intervallo) utilizzati. (3) Graffiare lo strato di cellule con un puntale non è così facile come può sembrare inizialmente. Troppa pressione per evitare di danneggiare la superficie piatto che può causare artefatti. Inoltre, la fessura può essere diverso all'interno del graffio e può variare tra i diversi ricercatori. Si raccomanda un investigatore esperto. (4) Il numero di campioni che possono essere eseguite in parallelo è limitata dalle apparecchiature. Tuttavia, la guarigione della ferita test è un altro strumento prezioso per il quantitativo e qualvalutazione luni di migrazione delle cellule. Informazioni su velocità di migrazione, distanza di migrazione, la migrazione diretta possono essere raccolte in un unico setup sperimentale. Inseguimento cellulare in un sistema bidimensionale non è molto difficile e può essere effettuata con il software open source (ad esempio, ImageJ e MTrackJ).
Rivestimento dei piatti di coltura cellulare non è importante solo per l'adesione cellulare, ma ha una notevole influenza sulla funzione cellulare in materia di migrazione. Le cellule endoteliali sono regolarmente coltivate su superfici rivestiti di gelatina 0,1%. L'uso di non rivestiti a superficie per la coltivazione delle cellule endoteliali ha provocato una diminuzione della proliferazione 14. Altri rivestimenti (ad esempio, la fibronectina) sono stati trovati anche adatto per la coltivazione di breve termine, tuttavia, i rivestimenti di gelatina hanno mostrato prestazioni superiori in esperimenti di coltura a lungo termine 15.
Ci sono numerosi coloranti fluorescenti sul mercato per l'imaging cellulare dal vivo. Abbiamo Chợsen TMRM per indagare il potenziale di membrana mitocondriale. Molti altri coloranti (ad esempio, JC-1, TMRE) mostrano prestazioni paragonabili. In contrasto con le sonde monocromatici (TMRM, TMRE), JC-1 fluorescenza si sposta dal verde al rosso, dopo l'accumulo nei mitocondri. Questo permette un raziometrica analisi semi-quantitativa dello stato di polarizzazione mitocondriale ma ostacola esperimenti doppia colorazione (ad esempio, utilizzando coloranti inseguitore identificare mitocondri) 16. Nella nostra esperienza il colorante in sé è meno critica per l'esperimento, mentre il disegno sperimentale, la manipolazione delle cellule e l'acquisizione è impegnativo e richiede molta più attenzione. Quasi tutti i coloranti fluorescenti sono sensibili alla luce. Pertanto, il carico cella dovrebbe essere eseguita di notte. Cella di carico richiede 15-30 minuti. Tempo di caricamento prolungato non si traduca in un aumento dei segnali e non è consigliato. Anche se i segnali specifici potrebbero essere rilevati dopo lunghi periodi di carico lunghi, il colorante potrebbe accumularsi nel compartimento subcellularementi o potrebbe anche essere scaricati dalla cella. Di conseguenza, le cellule devono essere caricati appena prima dell'analisi e non necessariamente all'inizio dell'esperimento. La concentrazione loading dye solito è nella gamma di 10 pM. Tuttavia, con TMRM sono state trovate concentrazioni molto più basse (20 Nm) sufficiente per l'etichettatura ed ancora dato risultati ragionevoli. Come mostrato in figura 3 etichettatura 24 h post-esposizione clorambucile provocato una perdita netta di potenziale di membrana mitocondriale. Trattamento di chlorambucil esposto CEE con ROS-spazzini è stato in grado di mantenere il potenziale di membrana mitocondriale a 24 ore dopo l'esposizione iniziale.
In sintesi, Boyden saggio da camera, la guarigione della ferita test in combinazione con l'analisi traccia singola cella sono preziosi strumenti per valutare il comportamento di migrazione per quanto riguarda qualitativi e aspetti quantitativi. Etichettatura di potenziale mitocondriale con TMRM può aiutare a individuare i meccanismi di base.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Boyden Chamber | |||
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 3 µm | Corning Incorporated | #351151 | |
| Corning FluoroBlok Tissue Culture (TC)-treated Inserts, 24 well - 8 µm | Life Sciences | #351152 | |
| (for use with Falcon Insert 24 well Companion Plate (353504) | |||
| Wound healing assay | |||
| Glass bottom dishes | Word Precision Instruments, Inc. | #FD35-100 | |
| Assessment of mitochondrial potential | |||
| TMRM (tetramethylrhodamine methyl ester) | Life Technologies | #T669 | |
| Cell culture | |||
| Accutase | PAA, Pasching, Austria | # L11-007 | |
| α-Linolenic acid | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # L2376 | |
| Chlorambucil | Fluka (Sigma), Steinheim, Germany | # 23125 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich, Steinheim, Germany | # G2500-100G |
References
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