Protocol
1. تنقية للصبغ
- إعداد محلول مائي 4٪ من اللون الأخضر الميثيل عن طريق إذابة 0.4 غرام من مسحوق صمة عار في 10 مل من الماء المقطر. تخلط جيدا حتى يذوب تماما.
- تحت الدخان غطاء محرك السيارة، ومزجها مع لا يقل عن 2 أجزاء من الكلوروفورم. من المهم التحقق مسبقا ما إذا كانت الأنابيب هي مقاومة الكلوروفورم.
- تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 2000 x ج لتسريع مرحلة الانفصال.
- بعد الطرد المركزي، ويتم الحصول على مرحلة العليا المائية مع الأخضر الميثيل ومرحلة العضوية أقل مع الكلوروفورم والمعتاد الملوثات الكريستال البنفسجي.
- استرداد المرحلة العليا وكرر هذه الخطوة حتى تظهر المرحلة الدنيا خالية تماما من الكريستال البنفسجي.
- في النهاية، يتم استرداد المرحلة العليا والمخفف في الماء لتركيز النهائي من 2٪ الأخضر الميثيل. هذا المحلول مستقر على طاولة العمل لشهور وليس من الضروري أن تكون محمية من الضوء.
"jove_title"> 2. الفلورسنت تلطيخ النووية من الجامعة الزرد الأجنة باستخدام الميثيل الخضراء
- إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ فورمالدهايد (من امتصاص العرق) في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
ملاحظة: هذا يمكن أن يستغرق من بضع ساعات ليلة وضحاها اعتمادا على سمك الأجنة. في المثال، فإننا الثابتة 48 ساعة بعد الإخصاب (HPF) الأجنة الزرد بين عشية وضحاها. - غسل الأجنة ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني-T (1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) لمدة 5 دقائق. تركيز مرتفع من المنظفات permeabilizes بشرة.
- إعداد 1: 5،000-1: 10،000 حل الأخضر الميثيل (من 2٪ محلول المخزون) في برنامج تلفزيوني-T. وجود المنظفات أثناء الحضانة مفيد لعينات سميكة، مثل الأجنة الزرد واليرقات.
- احتضان الأجنة في حل للا يقل عن 6 ساعة عند 4 درجات مئوية، مع هزاز لطيف. مرة أخرى، سمك الجنين المعلمة معايرة لمدة الحضانة.
- غسل الأجنة 3 تيموفاق مع برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة لإزالة الزائدة المنظفات. الميثيل مخضر واضح فقط عند منضمة إلى الحمض النووي، وبالتالي الخلفية من جزيء غير منضم لا يكاد يذكر.
- جبل على الشريحة حفرها أو غرفة محلية الصنع مع الحل تركيب (75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس · حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8).
ملاحظة: إذا كان تلطيخ النووي التي يتعين القيام بها بعد immunolabeling، يمكن إدراجها الأخضر الميثيل في حل المتصاعدة في تركيز العمل، دون الحاجة إلى غسله. - مخزن في الثلاجة أو بدء التصوير مباشرة. أداء التصوير مع متحد البؤر المسح بالليزر (أو مضان آخر) المجهر مع الإثارة في 633 نانومتر، والانبعاثات مجموعة المرشحات للتسجيل في 650-750 نانومتر مع الأخذ بعين الاعتبار أن الميثيل تصل الانبعاثات الأخضر الحد الأقصى في 677 نانومتر.
ملاحظة: ونحن نقدم البيانات المقاسة من الميثيل الشخصي الانبعاثات الأخضر، ليتم تحميلها في البرنامج الاستحواذ، كمواد إضافية.
3. نيون سانت النوويةaining من الجامعة الفرخ الأجنة باستخدام الميثيل الخضراء
- احتضان بيض الدجاج المخصب إلى مرحلة الاهتمام. إصلاح الأجنة بين عشية وضحاها في 4٪ فورمالدهايد (من امتصاص العرق) في برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية. غسل الأجنة 3 مرات في برنامج تلفزيوني-T لمدة 2 ساعة.
- إعداد 1: 5،000-1: 10،000 حل الأخضر الميثيل (من 2٪ محلول المخزون) في برنامج تلفزيوني-T. احتضان الأجنة في حل تلطيخ بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. غسل الأجنة 3 مرات في برنامج تلفزيوني، 1 ساعة لكل منهما. جبل في غرفة مع 75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس، ودرجة الحموضة 8.
4. التصوير Fluorescently المسمى النواة في الأجنة كامل محمولة
- إعداد غرفة التصوير من خلال إصرارها عدة طبقات من شريط كهربائي على شريحة المجهر وبعناية قطع حفرة في ذلك مع مشرط لوضع الأجنة داخل. وهذا يمنع الأجنة من سحق أثناء التصوير.
- نقل بعناية الأجنة إلى غرفة التصوير وملء الغرفة إلى الأعلى مع 75٪ الجلسرين، 0.1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة = 8 لتشكيل فقاعة باطلة.
- مع تغطية # 0 ساترة تجنب أو القضاء تفيض المتوسط. ختم ذلك بطلاء الأظافر.
- الحصول على صور من العينة على المجهر مضان مجهزة تصفية 633 الإثارة أو خط ليزر.
ملاحظة: يجب أن المرشحات الانبعاثات تغطية الحد الأقصى 677 انبعاث الأخضر الميثيل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تلطيخ النووي من عينات سميكة. بروتوكول الموصوفة هنا يسمح لتحقيق تلطيخ متجانس من البنى العميقة في أجنة كاملة. وصفت عدسة النوع النامية أنويتها 48 HPF الأجنة الزرد متجانس (الشكل 1).
الميثيل تلطيخ DNA الأخضر يسمح تمييز من دورة الخلية الاختلافات الشكلية التي تعتمد مثل التعرف على الأشكال الإنقسامية أو نوى أفكارك (الشكل 2A). هياكل النووية الدقيقة بدقة عالية واضحة أيضا كما هو مبين لنوى البشرة من الأجنة الزرد (الشكل 2B).
الميثيل الأخضر مقاوم للphotobleaching من تحت كثافة عالية الإشعاع لفترات طويلة من الزمن. عندما المشع مع ضوء الليزر 633 نانومتر في نفس كثافة، الميثيل تلطيخ النووي الأخضر لا التبييض خارج كما هو الحال تقاسم صمة عار DNA محددة الخصائص الطيفية أخرى مماثلة، TO-PRO-34. وقد تم اختيار طائرة مبائر من شبكية ككل محمولة على الجنين الزرد والتكبير مع الهدف 63X 1.4NA لتحقيق إشعاع عالية. عند تصغيرها، وعينات ملطخة TO-PRO-3 أظهرت تبيض في غضون 60 ثانية من الإشعاع المستمر (الشكل 3، والألواح العليا)، في حين أظهرت عينات ملطخة الأخضر الميثيل توجد أدلة واضحة على photobleaching من حتى في 120 ثانية في نفس الظروف (الشكل 3، والألواح أقل). كانت الصور المكتسبة في مجال البرمجيات اللصف مزيد من معالجة (السطوع / التباين؛ وإعادة الإعمار 3D، الحد الأقصى الإسقاط كثافة) باستخدام فيجي البرمجيات مفتوحة المصدر (http://fiji.sc/).
الشكل 1: تلطيخ النووي متجانس من البنى العميقة مع الأخضر الميثيل تطوير عدسة ل48 HPF الجنين الزرد ملطخة الأخضر الميثيل (MG) في س ض الإسقاط و 20 طائرة مبائر. تم counterstained الأجنة لF-الأكتين مع phalloidin TRITC مترافق (فال). شريط النطاق: 15 ميكرون.
الشكل 2: التشكل النووي وقرار النووية الدقيقة مع الميثيل الأخضر تلطيخ A) الأشكال التضاريسية النووية مختلفة في البشرة من 48 HPF الجنين الزرد. MG والأخضر الميثيل. تم counterstained العينات للF-الأكتين مع TRITC-phalloidin. رأس السهم: الخلية الإنقسامية. إسقاط الحد الأقصى للكثافة 10 طائرات مبائر. B) الفرخ الجنين لوحة العصبية وصفت في نفس الطريق، وتظهر الخلايا الإنقسامية (السهام) ونوى تغلظية (السهام). طائرة واحدة مبائر. C) ثلاث طائرات متحد البؤر واحدة من الزرد نواة الجنين البشرة في تضخم عالية، مما يدل على درجة عالية من الدقة النووية الدقيقة. أشرطة النطاق: A، 15 ميكرون. B، 5 ميكرون. C، 1 ميكرون.
-page = "دائما"> 
تم تبييض صمود الخضراء الميثيل في إطار الإثارة مستمرة TO-PRO-3 الملون ونوى 48 HPF شبكية العين الزرد على 60 ثانية من الإثارة مستمرة في 633 نانومتر (لوحات العليا): الشكل (3). في ظل نفس الظروف، لم جنين الملون الأخضر الميثيل (MG) لا تظهر تبيض ملموس، حتى عند تكرار مدة التعرض (لوحات أقل). وقدم تبيض والاستحواذ عن طريق المسح الضوئي في طائرات واحدة، في 8000 هرتز، و 30٪ قوة الليزر وخط (X2) والإطار (X4) المتوسط. شريط النطاق: 30 ميكرون.
| الطول الموجي (نانومتر) | الانبعاثات في المئة |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87.33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
المواد التكميلية 1: انبعاث الطيف من الميثيل تلطيخ النووي الأخضر تحت 633 نانومتر الإثارة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9 (1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
