Protocol
1. Purificación del colorante
- Preparar una solución acuosa al 4% de verde de metilo disolviendo 0,4 g de polvo de manchas en 10 ml de agua destilada. Mezclar bien hasta que esté completamente disolviéndolo.
- Bajo un humo del capó, se mezcla con al menos 2 partes de cloroformo. Es importante comprobar de antemano si los tubos son resistentes cloroformo.
- Mezclar bien y centrifugar durante 1 min a 2000 xg para acelerar la separación de fases.
- Después de la centrifugación, se obtienen una fase superior acuosa con verde de metilo y una fase orgánica inferior con cloroformo y la habitual cristal violeta contaminante.
- Recuperar la fase superior y repita este paso hasta fase inferior aparece completamente carente de cristal violeta.
- Al final, la fase superior se recuperó y se diluyó en agua hasta una concentración final de 2% de verde de metilo. Esta solución madre es estable en la mesa de trabajo durante meses y no necesita ser protegido de la luz.
- Fijar los embriones durante la noche en 4% de formaldehído (de paraformaldehído) en tampón fosfato salino (PBS).
NOTA: Esto puede tardar desde un par de horas para la noche, dependiendo del grosor de los embriones. En el ejemplo, hemos arreglado 48 horas después de la fecundación (HPF) embriones de pez cebra durante la noche. - Lavar los embriones tres veces en PBS-T (1% Triton X-100 en PBS) durante 5 min. La elevada concentración de detergente permeabiliza la cutícula.
- Preparar una solución 1: 10.000 de verde de metilo (de 2% solución madre) en PBS-T: 5,000-1. La presencia de detergente durante la incubación es útil para muestras gruesas, tales como embriones de pez cebra y larvas.
- Incubar los embriones en la solución durante al menos 6 horas a 4 ° C, con agitación suave. Una vez más, el espesor del embrión es el parámetro de calibración para la longitud de la incubación.
- Lave los embriones 3 times con PBS durante 30 min para eliminar el exceso de detergente. Metil fluorescencia verde sólo es evidente cuando se une al ADN, por lo tanto, el fondo de la molécula no unida es insignificante.
- Montar en una diapositiva excavado o una cámara casera con solución de montaje (75% de glicerol, 0,1 M Tris · HCl pH 8).
NOTA: Si la tinción nuclear se va a realizar después de immunolabeling, verde de metilo se puede incorporar a la solución de montaje en la concentración de trabajo, sin necesidad de lavar a la basura. - Tienda refrigerada o iniciar imágenes inmediatamente. Realizar de imágenes con un confocal de barrido láser (u otro fluorescencia) microscopio con excitación a 633 nm y filtros de emisión establecidos para registrarse en 650-750 nm teniendo en cuenta que el metil emisión verde alcanza su máximo a 677 nm.
NOTA: Proporcionamos los datos medidos del perfil de emisión verde de metilo, para ser cargados en el software de adquisición, como material complementario.
3. Fluorescente Nuclear StESP ACIO Plenario polluelo embriones utilizando metil verde
- Incubar huevos de gallina fertilizados a la etapa de su interés. Fijar los embriones durante la noche en formaldehído al 4% (de paraformaldehído) en PBS a 4 ° C. Lave embriones 3 veces en PBS-T durante 2 horas.
- Preparar una solución 1: 10.000 de verde de metilo (de 2% solución madre) en PBS-T: 5,000-1. Incubar los embriones en la solución de tinción durante la noche a 4 ° C. Lave los embriones 3 veces en PBS, 1 hora cada uno. Monte en la cámara con 75% de glicerol, 0,1 M Tris, pH 8.
4. Imaging marcados con fluorescencia Núcleos de embriones-enteros montada
- Preparar una cámara de imágenes pegando varias capas de cinta aislante sobre un portaobjetos de microscopio y cuidadosamente cortar un agujero en él con un bisturí para colocar los embriones en su interior. Esto evitará que los embriones de aplastamiento durante la exploración.
- Transferir cuidadosamente los embriones a la cámara de imagen y llenar la cámara a la cima con 75% de glicerol, Tris-HCl 0,1 M, pH = 8 a unla formación de burbujas vacío.
- Cubrir con un # 0 cubreobjetos evitando o eliminando medio desbordante. Selle con esmalte de uñas.
- Adquirir imágenes de la muestra en un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro de excitación 633 o línea de láser.
NOTA: Los filtros de emisión deben cubrir el máximo 677 emisión de verde de metilo.
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Representative Results
Tinción nuclear de muestras gruesas. El protocolo aquí descrito permite el logro de la tinción homogénea de estructuras profundas en embriones enteros. Lentes en desarrollo forman núcleos 48 HPF embriones de pez cebra son homogéneamente etiquetados (Figura 1).
Tinción de ADN verde de metilo permite la discriminación de diferencias morfológicas del ciclo celular dependientes tales como la identificación de figuras mitóticas o núcleos apoptóticos (Figura 2a). Estructuras subnuclear en alta resolución también son evidentes como se muestra para los núcleos epidérmicas de embriones de pez cebra (Figura 2B).
Verde de metilo es resistente a photobleaching bajo alta irradiación de intensidad durante períodos prolongados de tiempo. Cuando se irradia con luz láser de 633 nm a la misma intensidad, metilo tinción nuclear verde no blanquear a cabo como es el caso de otro intercambio de manchas de ADN específico características espectrales similares, TO-PRO-34. Se seleccionó un avión confocal de la retina de todo ello montado un embrión de pez cebra y el zoom con un objetivo de 63x 1.4NA para lograr una alta irradiación. Cuando el zoom hacia fuera, las muestras se tiñeron con TO-PRO-3 mostraron blanquear dentro de los 60 segundos de irradiación continua (Figura 3, paneles superiores), mientras que las muestras teñidas con verde de metilo no mostraron evidencia visible de photobleaching, incluso a 120 segundos en las mismas condiciones (Figura 3, paneles inferiores). Imágenes adquiridos en el software LASAF se procesaron más (brillo / contraste, la reconstrucción 3D; proyección de intensidad máxima) utilizando software de código abierto Fiji (http://fiji.sc/).
Figura 1:. Tinción nuclear homogéneo de estructuras profundas con verde de metilo Desarrollar lente de un 48 HPF embriones de pez cebra manchada de verde de metilo (MG) en una o z-proyecciónf 20 aviones confocal. Los embriones fueron counterstained para F-actina con faloidina TRITC conjugado (Phal). Barra de escala: 15 micras.
Figura 2: morfología nuclear y subnuclear resolución con verde de metilo tinción A) Las diferentes morfologías nucleares en la epidermis de un 48 HPF embriones de pez cebra.. MG, verde de metilo. Los especímenes fueron counterstained para F-actina con TRITC-phalloidin. Arrowhead: celular mitótico. Proyección de máxima intensidad de 10 aviones confocal. B) placa neural del embrión del polluelo marcado de la misma manera, se presentan células mitóticas (puntas de flecha) y núcleos picnóticos (flechas). Plano confocal individual. C) Tres aviones confocal únicas de un núcleo epidérmica embrión de pez cebra a gran aumento, mostrando un alto grado de resolución subnuclear. Las barras de escala: A, 15 m; B, 5 m; C, 1 m.
Figura 3:. Fotoestabilidad de verde de metilo bajo excitación continua TO-PRO-3-manchado núcleos de una retina de pez cebra 48 HPF se blanqueó a 60 segundos de la excitación continua a 633 nm (paneles superiores). En las mismas condiciones, un embrión teñido con verde de metilo (MG) no mostró blanqueamiento perceptible, incluso al duplicar el tiempo de exposición (paneles inferiores). El blanqueo y la adquisición se hizo en los escaneos en planos individuales, a 8.000 Hz, 30% la potencia del láser y la línea (x2) y el marco (x4) de promedio. Barra de escala: 30 micras.
| Longitud de onda (nm) | Porcentaje de emisiones |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| 670 | 87.33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Material complementario 1: Espectro de emisión de metilo tinción nuclear verde bajo 633 nm de excitación.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
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