Protocol
1. Oprensning af Dye
- Der fremstilles en 4% vandig opløsning af methyl green ved at opløse 0,4 g af pletter pulver i 10 ml destilleret vand. Bland grundigt, indtil den er helt opløse den.
- Under en røg-hætte, bland det med mindst 2 dele af chloroform. Det er vigtigt at kontrollere på forhånd, om rørene er chloroform resistente.
- Bland grundigt og centrifugere i 1 min ved 2.000 xg at fremskynde faseadskillelse.
- Efter centrifugering er en øvre vandige fase med methyl grøn og en nedre organiske fase med chloroform og den sædvanlige forurenende krystalviolet opnået.
- Inddrive den øverste fase og gentag dette trin, indtil nedre fase vises helt blottet for krystalviolet.
- Ved afslutningen er den øvre fase udvindes og fortyndes i vand til en slutkoncentration på 2% methylgrønt. Denne stamopløsning er stabil på arbejdsbordet i måneder og behøver ikke at blive beskyttet mod lys.
- Fastsætte embryoner natten over i 4% formaldehyd (fra paraformaldehyd) i phosphatpufret saltopløsning (PBS).
BEMÆRK: Denne kan tage fra nogle få timer til natten over afhængigt af tykkelsen af embryonerne. I eksemplet vi fast 48 timers post-befrugtning (HPF) zebrafisk embryoner natten over. - Vask embryoner tre gange i PBS-T (1% Triton X-100 i PBS) i 5 minutter. Den forhøjede koncentration af vaskemiddel permeabiliserer neglebånd.
- Forbered en 1: 5,000-1: 10,000 opløsning af methyl grøn (fra 2% stamopløsning) i PBS-T. Tilstedeværelsen af detergent under inkubationen er nyttigt for tykke prøver, såsom zebrafisk embryoner og larver.
- Inkubér embryonerne i opløsning i mindst 6 timer ved 4 ° C under forsigtig vipning. Igen er tykkelsen af embryoet er kalibrerings parameter for længden af inkubationen.
- Vask embryoner 3 times med PBS i 30 minutter for at fjerne detergenten overskud. Methyl grøn fluorescens er kun tydelig, når bundet til DNA, dermed baggrund fra det ubundne molekyle er ubetydelig.
- Mount på en udgravet objektglas eller en hjemmelavet kammer med montering opløsning (75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
BEMÆRK: Hvis kernefarvning skal udføres efter immunolabeling kan methylgrønt inkorporeres til monteringsdelen opløsning ved koncentrationen bearbejdning, uden behov for at vaske det væk. - Opbevares i køleskab eller starte billeddannelse straks. Udføre billeddannelse med en laser scanning konfokal (eller anden fluorescens) mikroskop med excitation ved 633 nm og emission filtre sat til at registrere på 650-750 nm under hensyntagen til, methyl grøn emission når sit maksimum ved 677 nm.
OBS: Vi leverer de målte data for methyl grønne emission profil, der skal indlæses i købet software, som supplerende materiale.
3. Fluorescent Nuclear Staining af Whole kyllingeembryoer hjælp Methyl Green
- Inkuber befrugtede hønseæg til den fase af interesse. Fastsætte embryoner natten over i 4% formaldehyd (fra paraformaldehyd) i PBS ved 4 ° C. Vask embryoner 3 gange i PBS-T i 2 timer.
- Forbered en 1: 5,000-1: 10,000 opløsning af methyl grøn (fra 2% stamopløsning) i PBS-T. Inkubér embryonerne i farveopløsning natten over ved 4 ° C. Vask embryonerne 3 gange i PBS, 1 time hver. Mount i kammeret med 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8.
4. Imaging fluorescensmærkede Kerner i Whole monteret embryoer
- Udarbejde en imaging kammer ved stikning flere lag af elektrisk tape over et objektglas og omhyggeligt skære et hul i det med en skalpel til at placere embryoner inden. Dette vil forhindre embryoner fra knusning under billedbehandling.
- Overføre omhyggeligt embryoer afbildningskammeret og fylde kammeret til toppen med 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH 8 til envoid bobledannelse.
- Dæk med en # 0 dækglas undgå eller eliminere medium overfyldte. Forsegle det med neglelak.
- Erhverve billeder af prøven på et fluorescensmikroskop udstyret med en 633 excitationsfilter eller laser linje.
BEMÆRK: Emission filtre bør dække maksimalt methyl grøn 677 emission.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nuklear farvning af tykke prøver. Protokollen heri beskrevne mulighed for opnåelse af homogen farvning af dybe strukturer i hele embryoner. Udviklingslande linse kerner danner 48 HPF zebrafisk embryoner homogent mærket (figur 1).
Methyl grøn DNA farvning tillader diskrimination af cellecyklus afhængige morfologiske forskelle såsom identifikation af mitotiske figurer eller apoptotiske kerner (figur 2A). Subnuclear strukturer med høj opløsning er også indlysende som vist for epidermale kerner af zebrafisk embryoner (figur 2B).
Methylgrønt er resistent over for fotoblegning under høj intensitet bestråling i længere tid. Når det bestråles med 633 nm laserlys ved samme intensitet, er methyl grøn kernefarvning ikke blege ud, som det er tilfældet med en anden DNA-specifik farvning deling lignende spektrale karakteristika, TO-PRO-34.. En konfokal plan nethinden af en hel-monteret zebrafisk foster blev udvalgt og zoomet ind med en 63x 1.4NA målsætning at opnå en høj bestråling. Når zoomet, enhederne farvet med TO-PRO-3 viste blegning inden for 60 sekunders kontinuerlig bestråling (figur 3, øvre paneler), mens prøverne farvet med methyl grøn viste ingen synlige tegn på fotoblegning selv på 120 sekunder under de samme betingelser (figur 3, nederste paneler). Billeder erhvervet i LASAF software blev yderligere bearbejdet (lysstyrke / kontrast, 3D-rekonstruktion, maksimal intensitet projektion) ved hjælp af Fiji open source software (http://fiji.sc/).
Figur 1:. Homogen nuklear farvning af dybe strukturer med methylgrønt Udvikling linse af en 48 HPF zebrafisk embryo farvet med methyl (MG) i en z-fremspring of 20 konfokale fly. Embryoner blev modfarvet til F-actin med TRITC-konjugeret phalloidin (Phal). Målestok: 15 um.
Figur 2: Nuklear morfologi og subnuclear opløsning med methyl grøn farvning A) Forskellige nukleare morfologier i epidermis af en 48 HPF zebrafisk embryo.. MG, methyl grøn. Prøver blev modfarvet til F-actin med TRITC-phalloidin. Arrowhead: mitotisk celle. Maksimal intensitet projektion af 10 konfokale fly. B) Chick embryo neurale plade mærkes på samme måde, viser mitotiske celler (pilespidser) og pyknotiske kerner (pile). Single konfokal fly. C) tre enkelt konfokale planer af en zebrafisk embryo epidermal kerne ved stor forstørrelse, der viser en høj grad af subnuclear opløsning. Scale barer: A, 15 um; B, 5 um; C, 1 um.
Figur 3:. Fotostabilitet af methyl grøn under kontinuerlig excitation TO-PRO-3-farvede kerner af en 48 HPF zebrafisk nethinden blev bleget ved 60 sek kontinuerlig excitation ved 633 nm (øverste paneler). Under de samme betingelser, har en methyl grøn-farvede embryo (MG) ikke viser tydelig blegning, selv når duplikere eksponeringstiden (lavere paneler). Blegning og erhvervelse blev foretaget ved scanning i enkelte fly, ved 8.000 Hz, 30% laser magt og line (x2) og ramme (x4) gennemsnit. Målestok: 30 um.
| Bølgelængde (nm) | Procent emission |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27,5 |
| 646 | 36.69 |
| 44,47 | |
| 652 | 53,92 |
| 655 | 61,82 |
| 658 | 67,86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89,45 |
| 670 | 87,33 |
| 673 | 92,3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97,41 |
| 682 | 90,34 |
| 685 | 83,32 |
| 78,37 | |
| 691 | 76,09 |
| 694 | 73,95 |
| 697 | 67,36 |
| 700 | 64,4 |
| 703 | 61,26 |
| 706 | 56,39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38,8 |
| 724 | 35.97 |
| 33,27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11,49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7,55 |
| 772 | 7,75 |
| 775 | 6,46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2,27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Supplerende materiale 1: Emission spektrum af methyl grønne nukleare farvning under 633 nm excitation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9 (1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
