Protocol
염료 1. 정제
- 증류수 10ml에 얼룩 분말 0.4 g을 용해시켜 메틸 녹색의 4 % 수용액을 준비합니다. 완전히 용해 될 때까지 잘 섞는다.
- 흄 후드에서 클로로포름 중 적어도 2 부분으로 섞는다. 그것은 튜브 클로로포름 내성 여부를 사전에 확인하는 것이 중요합니다.
- 철저하게 믹스와 상 분리를 가속화하기 위해 2,000 XG에서 1 분 동안 원심 분리.
- 원심 분리 후, 메틸 녹색 상부 수 성상을 클로로포름으로 하부 유기상과 일반적인 오염물 크리스탈 바이올렛이 얻어진다.
- 위의 위상을 복구하고 낮은 단계는 크리스탈 바이올렛의 완전히없는 나타날 때까지이 단계를 반복합니다.
- 마지막에, 상부 상을 회수하고, 2 % 메틸 그린의 최종 농도로 물에 희석 하였다. 이 원액 개월 작업대에 안정하고 빛으로부터 보호 될 필요가 없다.
- 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 (파라 포름 알데히드)에서 하룻밤에 4 % 포름 알데히드 배아를 수정.
참고 :이 몇 시간 걸릴 수 있습니다 하룻밤 배아의 두께에 따라합니다. 예를 들어, 우리는 밤새 48 시간 후 수정 (HPF) 제브라 피쉬 배아를 고정. - 5 분 동안 PBS-T (PBS에 1 % 트리톤 X-100)에 배아를 세 번 씻으십시오. 세제의 상승 된 농도는 표피를 permeabilizes.
- 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 배양시 세제의 존재는 제브라 피쉬 배아 및 유충 두꺼운 시편에 유용합니다.
- 부드럽게 흔들와, 4 ° C에서 적어도 6 시간 동안 용액에서 배아를 인큐베이션. 또, 배아의 두께는 배양 길이 교정 파라미터이다.
- 배아 3 팀을 씻으십시오30 분 동안 PBS로 ES는 세제 초과를 제거합니다. DNA에 결합시 메틸 녹색 형광 만 명백하고, 결합되지 않은 분자로부터 따라서 백그라운드는 무시할 수있다.
- 발굴 슬라이드 또는 설치 솔루션을 만든 실에 산 (75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 · 염산의 pH 8).
참고 : 핵 염색이 immunolabeling 이후에 수행 될 경우, 메틸 녹색이 그것을 씻어 할 필요없이, 작업 농도 장착 솔루션에 통합 할 수 있습니다. - 스토어 냉장 또는 즉시 영상을 시작합니다. 650-750 nm의 녹색의 발광은 677 nm에서 최대가 상기 메틸 고려에 등록 설정 및 633 nm의 방출 필터와 함께 여기에 레이저 스캐닝 공 초점 (또는 다른 형광) 현미경으로 촬영을 수행한다.
주 : 우리는 메틸 녹색 발광 프로파일의 측정 데이터, 보충 자료로서 수집 소프트웨어에로드 될을 제공한다.
3. 형광 핵 세인트메틸 녹색을 사용하여 항목의 병아리 태아의 aining
- 관심의 단계로 수정 된 암탉이 알을 품어. 4 ℃에서 하룻밤 PBS에서 (파라 포름 알데히드)에서 4 % 포름 알데히드의 배아를 수정. 2 시간 동안 PBS-T에서 배아 3 회 반복한다.
- 5,000-1 : PBS-T (2 %의 원액)에서 메틸 녹색 10,000 용액 1을 준비합니다. 밤새 4 ℃에서 염색 액에 배아를 품어. 배아에게 PBS 3 회, 1 시간 각을 씻으십시오. 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스, pH가 8 실의 산.
4. 이미지 찬란는 전체 마운트 배아에서 핵을 레이블
- 조심스럽게 현미경 슬라이드를 통해 전기 테이프의 여러 층을 고집에 의해 영상 실 준비는 내 배아를 배치 메스로에 구멍을 잘라. 이 영상 중에 분쇄에서 배아를 방지 할 수 있습니다.
- 조심스럽게 75 % 글리세롤, 0.1 M 트리스 -HCl, pH가 8 위로 챔버 촬상 챔버 배아를 전송하고 채우기무효 거품 형성.
- # 0 커버 슬립은 피하거나 매체 넘치는 제거와 커버. 매니큐어와 인감.
- 여기 필터 (633) 또는 레이저 라인을 구비 한 형광 현미경에서 시료의 이미지를 수집.
참고 : 배출 필터는 메틸 녹색의 677 방출 최대를 포함해야한다.
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Representative Results
두꺼운 시편의 핵 염색. 여기에 설명 된 프로토콜은 전체 배아 깊은 구조의 균일 한 염색의 달성을 허용한다. 개발 렌즈 핵 양식 (48) HPF 제브라 피쉬 배아 균일 (그림 1) 표시되어 있습니다.
메틸 녹색 DNA 염색은 유사 분열 또는 세포 사멸 핵 (그림 2A)의 식별로 세포주기에 의존 형태 학적 차이의 차별을 할 수 있습니다. 제브라 피쉬 배아 (그림 2B)의 표피 핵에 대한 그림과 같이 높은 해상도에서 Subnuclear 구조도 분명 있습니다.
메틸 녹색이 장시간 고휘도로 조사시 photobleaching에 강하다. 동일한 강도로 633 nm의 레이저 광을 조사 할 때 또 다른 특정 DNA 염색 공유 유사한 스펙트럼 특성의 경우는 TO-PRO-3이므로, 메틸 녹색 핵 염색 아웃 표백하지4. 전체 장착 지브라 피쉬 배아 망막의 촛점 평면이 선택된 높은 조사를 달성하기 63X 1.4NA 목적으로 확대 하였다. 축소 할 때, 표본 염색 TO-PRO-3 보였다 메틸 녹색으로 염색 표본이 동일한 조건에서도 120 초 photobleaching에의 눈에 보이는 증거가 없었다 동안, 연속 조사 (그림 3, 상단 패널) 60 초 이내에 표백 (그림 3, 낮은 패널). 피지 오픈 소스 소프트웨어 (http://fiji.sc/)를 사용하여 LASAF 소프트웨어에서 획득 된 영상 추가 (최대 강도 투사; 3 차원 복원 밝기 / 명암 대비)를 처리 하였다.
그림 1 :. 메틸 녹색 깊은 구조의 균일 핵 염색 Z 프로젝션 O를 메틸 그린 (MG)로 염색 48 HPF 제브라 피쉬 배아의 렌즈 개발20 공 초점면 (F). 배아는 TRITC - 복합 팔로이 딘 (스 팔)와 F - 굴지에 대한 대조되었다. 스케일 바 : 15 μm의.
그림 2 : 핵 형태와 메틸 녹색 염색) 48 HPF 제브라 피쉬 배아의 표피에서 다른 핵 형태학와 subnuclear 해상도.. MG, 메틸 녹색. 시편은 TRITC-팔로이 딘과 F - 굴지에 대한 대조되었다. 화살촉 : 유사 분열 세포. 10 공 초점 평면의 최대 강도 투사. 유사 분열 세포 (화살촉)와 pyknotic 핵 (화살표)를 표시 같은 방식으로 표시 B) 병아리 배아 신경 판. 단일 공 초점면. C) subnuclear 해상도의 고도를 나타내는 고배율에서 지브라 피쉬 배아 표피 핵의 3 개의 단일 촛점 평면. 스케일 바 : 15 μm의; (B), 5 μm의; C, 1 ㎛.
그림 3 :. 48 HPF 제브라 피쉬 망막의 연속 여기에서 메틸 녹색의 광 안정성 TO-PRO-3-스테인드 핵은 633 nm의 (상단 패널)에서 연속 여자의 60 초에 표백했다. 노출 시간 (하단 패널)을 복제하는 경우에도 동일한 조건으로, 메틸 그린 염색 배아 (MG)는, 지각 표백을 나타내지 않았다. 표백 및 인수는 8,000 Hz에서, 30 %의 레이저 파워 라인 (X2) 및 프레임 (4 개) 평균에, 하나의 평면에 스캔에 의해 만들어졌다. 스케일 바 : 30 μm의.
| 파장 (㎚) | 퍼센트 방출 |
| (640) | 21.37 |
| (643) | 27.5 |
| (646) | 36.69 |
| 44.47 | |
| (652) | 53.92 |
| (655) | 61.82 |
| (658) | 67.86 |
| (661) | 83.2 |
| (664) | 85.22 |
| 667 | 89.45 |
| (670) | 87.33 |
| (673) | 92.3 |
| (676) | (100) |
| 679 | 97.41 |
| (682) | 90.34 |
| 685 | 83.32 |
| 78.37 | |
| 691 | 76.09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67.36 |
| (700) | 64.4 |
| (703) | 61.26 |
| (706) | 56.39 |
| (709) | 55.06 |
| (712) | 49.56 |
| (715) | 46.12 |
| (718) | 41.4 |
| (721) | 38.8 |
| (724) | 35.97 |
| 33.27 | |
| (730) | 30.95 |
| (733) | 28.78 |
| (736) | 26.28 |
| (739) | 24.96 |
| (742) | 23.3 |
| (745) | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| (751) | 17.47 |
| (754) | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| (760) | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| (772) | 7.75 |
| (775) | 6.46 |
| (778) | 5.76 |
| (781) | 4.38 |
| (784) | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| (790) | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
보충 자료 1 : 633 nm의 여기에서 메틸 녹색 핵 염색의 발광 스펙트럼.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
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