Tillämpning av DNA-specifika Stain metylgrönt i Fluorescerande märkning av embryon

Protocol

1. Rening av färgämne

1. Bered en 4% vattenhaltig lösning av metylgrönt genom upplösning 0,4 g fläckpulver i 10 ml destillerat vatten. Blanda väl tills helt lösa det.
2. Enligt ett dragskåp, huva, blanda det med minst två delar kloroform. Det är viktigt att i förväg kontrollera om rören är kloroform resistenta.
3. Blanda väl och centrifugera under 1 min vid 2000 xg för att accelerera fasseparation.
4. Efter centrifugering, är en övre vattenfasen med metylgrönt och en undre organiska fasen med kloroform och den vanliga föroreningskristallviolett erhölls.
5. Åter den övre fasen och upprepa detta steg tills lägre fas visas helt saknar kristallviolett.
6. Vid slutet, är den övre fasen utvanns och utspäddes i vatten till en slutkoncentration av 2% metylgrönt. Denna stamlösning är stabil på arbetsbänken i månader och behöver inte skyddas från ljus.

1. Fäst embryon över natten i 4% formaldehyd (från paraformaldehyd) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
   OBS: Detta kan ta från ett par timmar till över natten beroende på tjockleken av embryona. I exemplet, fast vi 48 timmar efter befruktning (HPF) zebrafisk embryon över natten.
2. Tvätta embryona tre gånger i PBS-T (1% Triton X-100 i PBS) under 5 minuter. Den förhöjda koncentrationer av tvättmedel permeabilizes nagelbanden.
3. Bered en 1: 5,000-1: 10,000 lösning av metylgrönt (från 2% stamlösning) i PBS-T. Närvaron av detergent under inkubationen är användbart för tjocka prover, såsom zebrafisk embryon och larver.
4. Inkubera embryona i lösningen under åtminstone 6 h vid 4 ° C med försiktig skakning. Återigen, är tjockleken av embryot kalibreringsparametern för längden av inkubationen.
5. Tvätta embryona 3 times med PBS för 30 min för att avlägsna detergenten överskott. Metyl grön fluorescens är endast uppenbar när de är bundna till DNA, är följaktligen bakgrund från den obundna molekylen försumbar.
6. Mount på en utgrävd objektglas eller en hemmagjord kammare med monteringslösning (75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH 8).
   OBS: Om nukleär färgning skall utföras efter immunomärkning kan metylgrönt införlivas med monteringslösningen vid arbetskoncentration, utan att behöva tvätta bort.
7. Förvara i kylskåp eller starta avbildning omedelbart. Utför avbildning med en laserskanning konfokala (eller annan fluorescens) mikroskop med excitation vid 633 nm och emissionsfilter som att registrera sig på 650-750 nm med beaktande av att metylgrönt utsläppen når sitt maximum vid 677 nm.
   OBS: Vi tillhandahåller de uppmätta data för metylgrönt emissionsprofil, som skall laddas in i förvärv programvara, som kompletterande material.

3. Fluorescerande Nuclear Staining av hela kycklingembryon genom att använda metyl Grön

1. Inkubera befruktade hönsägg till scenen av intresse. Fäst embryon över natten i 4% formaldehyd (från paraformaldehyd) i PBS vid 4 ° C. Tvätta embryon tre gånger i PBS-T för 2 timmar.
2. Bered en 1: 5,000-1: 10,000 lösning av metylgrönt (från 2% stamlösning) i PBS-T. Inkubera embryona i färgningslösningen över natten vid 4 ° C. Tvätta embryona tre gånger i PBS, 1 h vardera. Montering i kammare med 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluorescerande kärnor i hela monterade Embryon

1. Förbered en avbildning kammare genom att sticka flera lager av eltejp över ett objektglas och försiktigt skära ett hål i den med en skalpell för att placera embryon inom. Detta kommer att förhindra embryon från att krossas under avbildning.
2. Försiktigt överföra embryon till avbildning kammaren och fylla kammaren till toppen med 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH 8 till envoid bubbelbildning.
3. Täck med en # 0 täck undvika eller eliminera medelfyllda. Förslut den med nagellack.
4. Förvärva bilder av provet på ett fluorescensmikroskop utrustat med en 633 excitationsfilter eller laserlinjen.
   OBS: Utsläpps filter bör omfatta högst metylgrönt den 677 utsläpp.

Representative Results

Nukleär färgning av tjocka prover. Protokollet beskrivs här gör det möjligt att uppnå homogen färgning av djupa strukturer i hela embryon. Utvecklingslins kärnor bildar 48 HPF zebrafisk embryon homogent märkta (Figur 1).

Metylgrönt DNA färgning tillåter diskriminering av cellcykelberoende morfologiska skillnader såsom identifiering av mitotiska siffror eller apoptotiska kärnor (Figur 2A). Subnukleära strukturer med hög upplösning är också uppenbara, såsom visas för epidermala kärnor av zebrafiskembryon (Figur 2B).

Metylgrönt är resistent mot fotoblekning under högt intensitet bestrålning under längre tidsperioder. Vid bestrålning med 633 nm laserljus vid samma intensitet, betyder metylgrönt nukleär färgning inte bleka ut som det är fallet med en annan DNA-specifikt färgämne delnings liknande spektrala egenskaper, TO-PRO-34. En konfokala plan av näthinnan av en hel monterad zebrafisk embryo valdes och zoomas in med en 63x 1.4NA mål att uppnå hög strålning. När zoomat ut, proverna färgades med TO-PRO-3 visade blekning inom 60 sekunder kontinuerlig bestrålning (Figur 3, övre paneler), medan proverna färgades med metylgrönt visade inga synliga tecken på fotoblekning även på 120 sekunder på samma villkor (Figur 3, lägre paneler). Bilder som förvärvats i LASAF programvara bearbetades vidare (ljusstyrka / kontrast, 3D-rekonstruktion, maximal intensitet projektion) med hjälp av programvara Fiji öppen källkod (http://fiji.sc/).

Figur 1:. Homogen nukleär färgning av djupa strukturer med metylgrönt Utveckla lins av en 48 HPF zebrafisk embryot färgas med metylgrönt (MG) ​​i en z-projektion of 20 konfokala plan. Embryon motfärgades för F-aktin med TRITC-konjugerad falloidin (Phal). Skala bar: 15 pm.

Figur 2: Kärn morfologi och subnuclear upplösning med metylgrönt färgning A) Olika kärn morfologier i epidermis av en 48 HPF zebrafisk embryo.. MG, metylgrönt. Prover motfärgades för F-aktin med TRITC-falloidin. Arrowhead: mitotiska cellen. Högsta intensitet projektion av 10 konfokala plan. B) från kycklingembryon neurala plattan märkt på samma sätt, visar mitotiska celler (pilspetsar) och pyknotiska kärnor (pilar). Enkel konfokala planet. C) Tre enkla konfokala plan en zebrafisk embryo epidermal kärna med hög förstoring, visar en hög grad av subnuclear upplösning. Skalstrecken: A, 15 | im; B, 5 | im; C, 1 | j, m.

Figur 3:. Foto av metylgrönt under kontinuerlig excitation TO-PRO-3-färgade kärnor av en 48 HPF zebrafisk näthinnan blektes på 60 sekunder av kontinuerlig excitation vid 633 nm (övre paneler). Under samma förhållanden, gjorde en metylgrönt-färgade embryot (MG) inte visar märkbar blekning, även när duplicering exponeringstiden (lägre paneler). Blekning och förvärv gjordes genom scanning i enskilda plan, vid 8000 Hz, 30% lasereffekt och linje (x2) och ram (x4) medelvärdes. Skala bar: 30 pm.

Våglängd (nm)	Procent utsläpps
640	21,37
643	27,5
646	36,69
44,47
652	53,92
655	61,82
658	67,86
661	83,2
664	85,22
667	89,45
670	87,33
673	92,3
676	100
679	97,41
682	90,34
685	83,32
	78,37
691	76,09
694	73,95
697	67,36
700	64,4
703	61,26
706	56,39
709	55,06
712	49,56
715	46,12
718	41,4
721	38,8
724	35,97
	33,27
730	30,95
733	28,78
736	26,28
739	24,96
742	23,3
745	21,12
748	19,86
751	17,47
754	16,14
757	14,21
760	12,45
763	11,49
	9,97
769	7,55
772	7,75
775	6,46
778	5,76
781	4,38
784	2,6
787	2,75
790	2,27
793	1,52
796	0

Kompletterande material 1: Emission spektrum av metylgrönt nukleär färgning i 633 nm excitation.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
Methyl green	Dr. G. Grübler		Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5	Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate	Sigma-Aldrich	P1951
chloroform	Sigma-Aldrich	372978
Centrifuge 5810 R	eppendorf	5811 000.010
microscope slides	Deltalab	D100004
cover slips	Esco optics	R525025