Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Tillämpning av DNA-specifika Stain metylgrönt i Fluorescerande märkning av embryon

doi: 10.3791/52769 Published: May 2, 2015

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Rening av färgämne

  1. Bered en 4% vattenhaltig lösning av metylgrönt genom upplösning 0,4 g fläckpulver i 10 ml destillerat vatten. Blanda väl tills helt lösa det.
  2. Enligt ett dragskåp, huva, blanda det med minst två delar kloroform. Det är viktigt att i förväg kontrollera om rören är kloroform resistenta.
  3. Blanda väl och centrifugera under 1 min vid 2000 xg för att accelerera fasseparation.
  4. Efter centrifugering, är en övre vattenfasen med metylgrönt och en undre organiska fasen med kloroform och den vanliga föroreningskristallviolett erhölls.
  5. Åter den övre fasen och upprepa detta steg tills lägre fas visas helt saknar kristallviolett.
  6. Vid slutet, är den övre fasen utvanns och utspäddes i vatten till en slutkoncentration av 2% metylgrönt. Denna stamlösning är stabil på arbetsbänken i månader och behöver inte skyddas från ljus.

  1. Fäst embryon över natten i 4% formaldehyd (från paraformaldehyd) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
    OBS: Detta kan ta från ett par timmar till över natten beroende på tjockleken av embryona. I exemplet, fast vi 48 timmar efter befruktning (HPF) zebrafisk embryon över natten.
  2. Tvätta embryona tre gånger i PBS-T (1% Triton X-100 i PBS) under 5 minuter. Den förhöjda koncentrationer av tvättmedel permeabilizes nagelbanden.
  3. Bered en 1: 5,000-1: 10,000 lösning av metylgrönt (från 2% stamlösning) i PBS-T. Närvaron av detergent under inkubationen är användbart för tjocka prover, såsom zebrafisk embryon och larver.
  4. Inkubera embryona i lösningen under åtminstone 6 h vid 4 ° C med försiktig skakning. Återigen, är tjockleken av embryot kalibreringsparametern för längden av inkubationen.
  5. Tvätta embryona 3 times med PBS för 30 min för att avlägsna detergenten överskott. Metyl grön fluorescens är endast uppenbar när de är bundna till DNA, är följaktligen bakgrund från den obundna molekylen försumbar.
  6. Mount på en utgrävd objektglas eller en hemmagjord kammare med monteringslösning (75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH 8).
    OBS: Om nukleär färgning skall utföras efter immunomärkning kan metylgrönt införlivas med monteringslösningen vid arbetskoncentration, utan att behöva tvätta bort.
  7. Förvara i kylskåp eller starta avbildning omedelbart. Utför avbildning med en laserskanning konfokala (eller annan fluorescens) mikroskop med excitation vid 633 nm och emissionsfilter som att registrera sig på 650-750 nm med beaktande av att metylgrönt utsläppen når sitt maximum vid 677 nm.
    OBS: Vi tillhandahåller de uppmätta data för metylgrönt emissionsprofil, som skall laddas in i förvärv programvara, som kompletterande material.

3. Fluorescerande Nuclear Staining av hela kycklingembryon genom att använda metyl Grön

  1. Inkubera befruktade hönsägg till scenen av intresse. Fäst embryon över natten i 4% formaldehyd (från paraformaldehyd) i PBS vid 4 ° C. Tvätta embryon tre gånger i PBS-T för 2 timmar.
  2. Bered en 1: 5,000-1: 10,000 lösning av metylgrönt (från 2% stamlösning) i PBS-T. Inkubera embryona i färgningslösningen över natten vid 4 ° C. Tvätta embryona tre gånger i PBS, 1 h vardera. Montering i kammare med 75% glycerol, 0,1 M Tris, pH 8.

4. Imaging fluorescerande kärnor i hela monterade Embryon

  1. Förbered en avbildning kammare genom att sticka flera lager av eltejp över ett objektglas och försiktigt skära ett hål i den med en skalpell för att placera embryon inom. Detta kommer att förhindra embryon från att krossas under avbildning.
  2. Försiktigt överföra embryon till avbildning kammaren och fylla kammaren till toppen med 75% glycerol, 0,1 M Tris-HCl, pH 8 till envoid bubbelbildning.
  3. Täck med en # 0 täck undvika eller eliminera medelfyllda. Förslut den med nagellack.
  4. Förvärva bilder av provet på ett fluorescensmikroskop utrustat med en 633 excitationsfilter eller laserlinjen.
    OBS: Utsläpps filter bör omfatta högst metylgrönt den 677 utsläpp.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Nukleär färgning av tjocka prover. Protokollet beskrivs här gör det möjligt att uppnå homogen färgning av djupa strukturer i hela embryon. Utvecklingslins kärnor bildar 48 HPF zebrafisk embryon homogent märkta (Figur 1).

Metylgrönt DNA färgning tillåter diskriminering av cellcykelberoende morfologiska skillnader såsom identifiering av mitotiska siffror eller apoptotiska kärnor (Figur 2A). Subnukleära strukturer med hög upplösning är också uppenbara, såsom visas för epidermala kärnor av zebrafiskembryon (Figur 2B).

Metylgrönt är resistent mot fotoblekning under högt intensitet bestrålning under längre tidsperioder. Vid bestrålning med 633 nm laserljus vid samma intensitet, betyder metylgrönt nukleär färgning inte bleka ut som det är fallet med en annan DNA-specifikt färgämne delnings liknande spektrala egenskaper, TO-PRO-34. En konfokala plan av näthinnan av en hel monterad zebrafisk embryo valdes och zoomas in med en 63x 1.4NA mål att uppnå hög strålning. När zoomat ut, proverna färgades med TO-PRO-3 visade blekning inom 60 sekunder kontinuerlig bestrålning (Figur 3, övre paneler), medan proverna färgades med metylgrönt visade inga synliga tecken på fotoblekning även på 120 sekunder på samma villkor (Figur 3, lägre paneler). Bilder som förvärvats i LASAF programvara bearbetades vidare (ljusstyrka / kontrast, 3D-rekonstruktion, maximal intensitet projektion) med hjälp av programvara Fiji öppen källkod (http://fiji.sc/).

Figur 1
Figur 1:. Homogen nukleär färgning av djupa strukturer med metylgrönt Utveckla lins av en 48 HPF zebrafisk embryot färgas med metylgrönt (MG) ​​i en z-projektion of 20 konfokala plan. Embryon motfärgades för F-aktin med TRITC-konjugerad falloidin (Phal). Skala bar: 15 pm.

Figur 2
Figur 2: Kärn morfologi och subnuclear upplösning med metylgrönt färgning A) Olika kärn morfologier i epidermis av en 48 HPF zebrafisk embryo.. MG, metylgrönt. Prover motfärgades för F-aktin med TRITC-falloidin. Arrowhead: mitotiska cellen. Högsta intensitet projektion av 10 konfokala plan. B) från kycklingembryon neurala plattan märkt på samma sätt, visar mitotiska celler (pilspetsar) och pyknotiska kärnor (pilar). Enkel konfokala planet. C) Tre enkla konfokala plan en zebrafisk embryo epidermal kärna med hög förstoring, visar en hög grad av subnuclear upplösning. Skalstrecken: A, 15 | im; B, 5 | im; C, 1 | j, m.


Figur 3:. Foto av metylgrönt under kontinuerlig excitation TO-PRO-3-färgade kärnor av en 48 HPF zebrafisk näthinnan blektes på 60 sekunder av kontinuerlig excitation vid 633 nm (övre paneler). Under samma förhållanden, gjorde en metylgrönt-färgade embryot (MG) inte visar märkbar blekning, även när duplicering exponeringstiden (lägre paneler). Blekning och förvärv gjordes genom scanning i enskilda plan, vid 8000 Hz, 30% lasereffekt och linje (x2) och ram (x4) medelvärdes. Skala bar: 30 pm.

Våglängd (nm) Procent utsläpps
640 21,37
643 27,5
646 36,69
44,47
652 53,92
655 61,82
658 67,86
661 83,2
664 85,22
667 89,45
670 87,33
673 92,3
676 100
679 97,41
682 90,34
685 83,32
78,37
691 76,09
694 73,95
697 67,36
700 64,4
703 61,26
706 56,39
709 55,06
712 49,56
715 46,12
718 41,4
721 38,8
724 35,97
33,27
730 30,95
733 28,78
736 26,28
739 24,96
742 23,3
745 21,12
748 19,86
751 17,47
754 16,14
757 14,21
760 12,45
763 11,49
9,97
769 7,55
772 7,75
775 6,46
778 5,76
781 4,38
784 2,6
787 2,75
790 2,27
793 1,52
796 0

Kompletterande material 1: Emission spektrum av metylgrönt nukleär färgning i 633 nm excitation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glycerol Sigma-Aldrich G5516
Methyl green Dr. G. Grübler Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 158127
Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 Leica Microsystems
Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate Sigma-Aldrich
P1951 
chloroform Sigma-Aldrich 372978
Centrifuge 5810 R eppendorf 5811 000.010  
microscope slides Deltalab D100004
cover slips Esco optics R525025

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192, (5), 292-301 (2010).
  2. Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70, (5), 220-233 (1995).
  3. Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24, (1), 24-33 (1976).
  4. Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17, (2), 185-189 (1994).
  5. Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11, (1), 9 (1995).
  6. Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142, (3), 335-345 (2014).
  7. Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315, (1), 61-64 (1993).
  8. Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50, (3), 508-512 (1977).
  9. Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18, (2-3), 90-94 (1986).
  10. Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55, (4), 563-578 (2013).
  11. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10, (6), 508-5013 (2013).
  12. Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38, (16), 3662-3669 (1999).
Tillämpning av DNA-specifika Stain metylgrönt i Fluorescerande märkning av embryon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).More

Prieto, D., Aparicio, G., Machado, M., Zolessi, F. R. Application of the DNA-Specific Stain Methyl Green in the Fluorescent Labeling of Embryos. J. Vis. Exp. (99), e52769, doi:10.3791/52769 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter