Protocol
1. Reinigung des Dye
- Bereiten Sie einen 4% igen wässrigen Lösung von Methylgrün durch Auflösen von 0,4 g Fleck Pulver in 10 ml destilliertem Wasser. Gründlich mischen, bis sie vollständig gelöst wird.
- Unter einer Abzugshaube, mischen Sie es mit mindestens 2 Teilen Chloroform. Es ist wichtig, vorher zu prüfen, ob die Rohre sind Chloroform beständig.
- Gründlich mischen und zentrifugieren für 1 min bei 2.000 xg um die Phasentrennung zu beschleunigen.
- Nach dem Zentrifugieren eine obere wässrige Phase mit Methyl-grün und eine untere organische Phase mit Chloroform und die üblichen Schadstoffkristallviolett erhalten.
- Wiederherstellen der oberen Phase, und wiederholen Sie diesen Schritt, bis untere Phase völlig frei von Kristallviolett wird angezeigt.
- Am Ende wird die obere Phase abgetrennt und in Wasser auf eine Endkonzentration von 2% Methylgrün verdünnt. Diese Stammlösung ist auf der Werkbank über Monate stabil ist und nicht den Inhalt vor Licht geschützt werden müssen.
- Fixieren die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (aus Paraformaldehyd) in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
HINWEIS: Das kann von ein paar Stunden, um über Nacht abhängig von der Dicke der Embryonen. In dem Beispiel fest wir 48 Stunden nach der Befruchtung (HPF) Zebrafischembryonen über Nacht. - Dreimal 5 min waschen die Embryonen in PBS-T (1% Triton X-100 in PBS). Die erhöhte Konzentration des Reinigungsmittels permeabel die Nagelhaut.
- Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Gegenwart von Detergens während der Inkubation ist nützlich für dicke Proben, wie Zebrafischembryonen und Larven.
- Die Embryonen in der Lösung für mindestens 6 h Inkubation bei 4ºC unter leichtem Schütteln. Auch die Dicke des Embryos ist die Kalibrierparameter für die Dauer der Inkubationszeit.
- Waschen Sie die Embryonen 3 times mit PBS für 30 min, um die Reinigungsmittelüberschuß zu entfernen. Methyl grüne Fluoreszenz ist nur offensichtlich, wenn die DNA gebunden ist, zu vernachlässigen ist somit Hintergrund von dem ungebundenen Molekül.
- Berg auf einem ausgegrabenen Dia oder einem hausgemachten Kammer mit Montagelösung (75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
HINWEIS: Wenn die Kernfärbung ist es, nach Immunmarkierung durchgeführt werden, kann Methylgrün an der Montagelösung in der Arbeitskonzentration eingebracht werden, ohne die Notwendigkeit, es abzuwaschen. - Einer Lagerung oder starten Bildgebung sofort. Führen Bildgebung mit einem konfokalen Laserraster (oder andere Fluoreszenz) Mikroskop mit einer Anregung bei 633 nm und Emissionsfilter eingestellt, um bei 650 bis 750 nm unter Berücksichtigung, dass grüne Emission sein Maximum bei 677 nm erreicht Methyl registrieren.
Anmerkung: Wir stellen die Messdaten des Methylgrün Emissionsprofil, in das Erfassungssoftware geladen werden, als Zusatzmaterial.
3. Fluorescent Nuclear Staining von Whole Hühnerembryonen mit Methylgrün
- Befruchtete Hühnereier Inkubieren auf die Bühne von Interesse. Befestigen Sie die Embryonen über Nacht in 4% Formaldehyd (von Paraformaldehyd) in PBS bei 4 ° C. Waschen Embryonen 3 mal in PBS-T für 2 Std.
- Bereiten Sie eine 1: 5,000-1: 10.000 Lösung von Methyl-grün (2% Stammlösung) in PBS-T. Die Embryonen in der Färbungslösung beimpft und über Nacht bei 4 ° C. 3 mal in PBS, jeweils 1 Stunde Waschen Sie die Embryonen. Berg in der Kammer mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris, pH 8.
4. Imaging fluoreszierend markierten Zellkerne in Whole-montiert Embryos
- Bereiten Sie eine Imaging-Kammer durch Kleben mehreren Lagen Isolierband über einen Objektträger und vorsichtig ein Loch in sie mit einem Skalpell, um die Embryonen im Rahmen zu platzieren. Dies wird Embryonen aus Brechen während der Bilderzeugung zu verhindern.
- Die Embryonen vorsichtig in die Abbildungskammer und füllt die Kammer bis zum Rand mit 75% Glycerin, 0,1 M Tris-HCl, pH = 8, um eineLeere Blasenbildung.
- Deckel mit einem # 0 Deck Vermeidung oder Beseitigung von überquellenden Medium. Verschließen Sie diese mit Nagellack.
- Erwerben Bilder der Probe auf einem Fluoreszenzmikroskop mit einem Anregungsfilter 633 bzw. Laserlinie ausgestattet.
HINWEIS: Emissionsfilter sollten die 677 Emissionsmaximum von Methylgrün decken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kernfärbung von dicken Proben. Das Protokoll beschrieben gestattet das Erreichen einer homogenen Färbung von tiefen Strukturen in ganzen Embryonen. Entwicklungslinsenkerne Form 48 HPF Zebrafischembryonen homogen markiert (Abbildung 1).
Methylgrün DNA-Färbung erlaubt die Unterscheidung von Zellzyklus-abhängigen morphologischen Unterschiede, wie beispielsweise die Identifizierung von Mitosen oder apoptotischen Kernen (2A). Subnuklearen Strukturen mit hoher Auflösung zeigen sich auch als für den epidermalen Kerne von Zebrafischembryonen (2B) gezeigt.
Methylgrün ist beständig gegen Photobleichen bei hoher Intensität der Bestrahlung für längere Zeit. Wenn sie mit 633 nm-Laserlicht mit der gleichen Intensität bestrahlt wird, wird Methylgrün Kernfärbung nicht ausbleichen, wie es bei einer anderen DNA-spezifisches Färbemittel, die ähnliche spektrale Eigenschaften, TO-PRO-34. Ein konfokales Ebene der Netzhaut eines Ganzen montiert Zebrafischembryo wurde ausgewählt und mit einem 63x 1.4NA Ziel gezoomt in hoher Bestrahlung zu erreichen. Wenn herausgezoomt die Proben gefärbt mit TO-PRO-3 zeigte Bleichen innerhalb von 60 Sekunden kontinuierlicher Bestrahlung (Figur 3, obere Felder), während die Proben mit Methylgrün gefärbt wurden, keine sichtbaren Anzeichen für Photobleichung selbst bei 120 Sekunden unter den gleichen Bedingungen (Abbildung 3, untere Felder). Bilder in LASAF Software erworben wurden weiter verarbeitet (Helligkeit / Kontrast, 3D-Rekonstruktion; Maximum Intensity Projection) mit Fiji Open Source Software (http://fiji.sc/).
Abb. 1: Homogene Kernfärbung von tiefen Strukturen mit Methylgrün Entwickeln Linse einer 48 hpf Zebrafisches mit Methylgrün (MG) gefärbt in einer Z-Projektions of 20 konfokalen Ebenen. Die Embryonen wurden für F-Actin mit TRITC-Phalloidin (Phal) gegengefärbt. Maßstab: 15 & mgr; m.
Abbildung 2: Kernmorphologie und subnuclear Auflösung mit Methyl-grüne Färbung A) Verschiedene Kern Morphologien in der Epidermis einer 48 HPF Zebrafischembryo.. MG, Methylgrün. Proben wurden auf F-Actin mit TRITC-Phalloidin gegengefärbt. Arrowhead: mitotische Zelle. Maximum-Intensitätsprojektion von 10 konfokalen Ebenen. B) Hühnerembryo neuronalen Platte in der gleichen Weise gekennzeichnet und zeigt mitotischen Zellen (Pfeilspitzen) und pyknotische Kerne (Pfeile). Einzel Konfokalebene. C) Drei Einzel konfokalen Ebenen eines Zebrafischembryo epidermalen Zellkern bei hoher Vergrößerung und zeigt ein hohes Maß an subnuclear Auflösung. Maßstabsbalken: A, 15 & mgr; m; B, 5 & mgr; m; C, 1 & mgr; m.
Abb. 3: Photostabilität von Methylgrün unter Dauererregung TO-PRO-3-gefärbten Zellkernen eines 48 HPF Zebrafisch Retina wurde auf 60 Sekunden kontinuierlicher Anregung bei 633 nm (obere Felder) gebleicht. Unter den gleichen Bedingungen, hat eine Methyl grün gefärbten Embryo (MG) nicht wahrnehmbar Bleich zeigen, auch wenn das Duplizieren der Belichtungszeit (untere Felder). Bleaching und Übernahme wurde durch Scannen in einzelne Ebenen gemacht, bei 8000 Hz, 30% Laserleistung und Linie (x2) und Rahmen (x4) Mittelwertbildung. Maßstab: 30 um.
| Wellenlänge (nm) | Prozent Emissions |
| 640 | 21,37 |
| 643 | 27,5 |
| 646 | 36.69 |
| 44,47 | |
| 652 | 53,92 |
| 655 | 61,82 |
| 658 | 67,86 |
| 661 | 83,2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89,45 |
| 670 | 87,33 |
| 673 | 92,3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97,41 |
| 682 | 90,34 |
| 685 | 83,32 |
| 78,37 | |
| 691 | 76,09 |
| 694 | 73,95 |
| 697 | 67,36 |
| 700 | 64,4 |
| 703 | 61,26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41,4 |
| 721 | 38,8 |
| 724 | 35.97 |
| 33,27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23,3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Zusatzmaterial 1: Emissionsspektrum der Methylgrün Kernfärbung unter 633 nm Anregung.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9 (1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
