Protocol
1. A purificação do corante
- Prepara-se uma solução aquosa a 4% de verde de metilo por dissolução de 0,4 g de pó de mancha em 10 ml de água destilada. Misture bem até dissolver completamente.
- Sob um fume-hood, misturá-lo com pelo menos 2 partes de clorofórmio. É importante verificar com antecedência se os tubos são resistentes ao clorofórmio.
- Misturar bem e centrifuga-se durante 1 min a 2000 xg para acelerar a separação de fases.
- Após centrifugação, a fase aquosa superior com verde de metilo e uma fase orgânica inferior com clorofórmio e o violeta de cristal de contaminantes são obtidos habitual.
- Recuperar a fase superior e repita esta etapa até a fase mais baixa parece completamente desprovida de cristal violeta.
- No final, a fase superior é recuperada e diluído em água até uma concentração final de 2% com verde de metilo. Esta solução de reserva é estável sobre a bancada durante meses e não necessita de ser protegido da luz.
- Fixar os embriões durante a noite em 4% de formaldeído (paraformaldeído) a partir de em tampão fosfato salino (PBS).
NOTA: Este pode levar desde algumas horas até durante a noite, dependendo da espessura dos embriões. No exemplo, nós fixa 48 horas pós-fertilização (HPF) embriões de peixe-zebra durante a noite. - Lavar os embriões três vezes em PBS-T (1% de Triton X-100 em PBS) durante 5 min. A concentração elevada de detergente permeabiliza a cutícula.
- Prepara-se uma solução de 1: 10.000 de verde de metilo (a partir da solução stock 2%) em PBS-T: 5,000-1. A presença de detergente durante a incubação é útil para amostras de espessura, tais como embriões de peixe-zebra e larvas.
- Incubar os embriões na solução, durante pelo menos 6 horas a 4 ° C, com agitação suave. Mais uma vez, a espessura do embrião é o parâmetro de calibração para o comprimento da incubação.
- Lavar os embriões 3 times com PBS durante 30 min para remover o excesso de detergente. Metil fluorescência verde só é evidente quando ligado ao DNA, daí fundo da molécula não ligada é insignificante.
- Montagem em um slide escavado ou de uma câmara caseira com solução de montagem (75% de glicerol, 0,1 M Tris-HCl pH 8).
NOTA: Se a coloração nuclear deve ser realizada após imunomarcação, verde metilo pode ser incorporado à solução de montagem na concentração de trabalho, sem a necessidade de lavá-lo afastado. - Loja refrigerado ou iniciar imagiologia imediatamente. Realizar imagem com um confocal de varredura a laser (ou outra fluorescência) microscópio com excitação a 633 nm e emissão filtros definidos como registrar em 650-750 nm tendo em conta que metil emissão verde atinge o seu máximo em 677 nm.
NOTA: Nós fornecemos os dados de medição do perfil de emissão verde de metilo, a ser carregados no software de aquisição, como material suplementar.
3. Fluorescent Nuclear Staining de Whole Pintainho embriões usando Metil Verde
- Incubar ovos de galinha fertilizados para a fase de interesse. Fixar os embriões durante a noite em 4% de formaldeído (paraformaldeído a partir de) em PBS a 4 ° C. Lavar os embriões 3 vezes em PBS-T, durante 2 h.
- Prepara-se uma solução de 1: 10.000 de verde de metilo (a partir da solução stock 2%) em PBS-T: 5,000-1. Incubar os embriões na solução de coloração durante a noite a 4 ° C. Lavar os embriões 3 vezes em PBS, 1 h cada. Mount na câmara com 75% de glicerol, 0,1 M Tris, pH 8.
4. Criação de Imagens fluorescente etiquetado Núcleos em embriões inteiros montado
- Preparar uma câmara de imagem furando várias camadas de fita isolante sobre uma lâmina de microscópio e cuidadosamente cortar um buraco para ele com um bisturi para colocar os embriões dentro. Isso impedirá que os embriões de esmagamento durante o exame.
- Transferir cuidadosamente os embriões para a câmara de imagiologia e encher a câmara com a parte superior com 75% de glicerol, Tris-HCl 0,1 M, pH = 8 para umaformação de bolhas vazio.
- Cubra com um # 0 lamela evitar ou eliminar transbordante médio. Selá-lo com unha polonês.
- Aquisição de imagens do espécime no microscópio de fluorescência equipado com um filtro de excitação de 633 ou linha de laser.
NOTA: filtros de emissão deve cobrir o máximo de 677 emissões de verde metilo.
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Representative Results
A coloração nuclear de amostras grossas. O protocolo aqui descrito permite a realização de coloração homogênea de estruturas profundas no embriões inteiros. Lente desenvolvimento formar núcleos 48 hpf embriões de peixe-zebra são homogeneamente marcado (Figura 1).
Coloração de ADN com verde de metilo permite a discriminação do ciclo celular dependentes diferenças morfológicas, tais como a identificação de figuras mitóticas ou núcleos apoptóticos (Figura 2A). Subnuclear estruturas com elevada resolução, também são evidentes, como mostrado para núcleos epidérmicas de embriões de peixes-zebra (Figura 2B).
Verde de metilo é resistente à fotodegradação sob alta irradiação intensidade por períodos prolongados de tempo. Quando irradiado com luz laser de 633 nm com a mesma intensidade, coloração nuclear verde de metilo não lixívia para fora, como é o caso de outra mancha partilha específica de ADN-características espectrais semelhantes, TO-PRO-34. Um avião confocal da retina de um peixe-zebra embrião todo montado foi selecionado e ampliada com um objetivo 63x 1.4NA para alcançar alta irradiação. Ao reduzir, as amostras coradas com TO-PRO-3 mostrou branqueamento no prazo de 60 segundos de irradiação contínua (Figura 3, painéis superiores), enquanto as amostras coradas com verde de metilo mostrou nenhuma evidência visível de fotobranqueamento até aos 120 segundos, nas mesmas condições (Figura 3, painéis inferiores). Imagens adquiridas em software LASAF foram tratados posteriormente (brilho / contraste; reconstrução 3D; projeção de intensidade máxima), utilizando software de código aberto Fiji (http://fiji.sc/).
Figura 1:. Coloração nuclear homogêneo de estruturas profundas com verde metil Desenvolvimento lente de um embrião de peixe-zebra 48 hpf coradas com verde de metilo (MG) em um o z-projeçãof 20 aviões confocal. Os embriões foram contrastadas para F-actina com faloidina-TRITC conjugado (Phal). Barra de escala: 15 um.
Figura 2: morfologia e Nucleares resolução subnuclear com verde metil coloração A) diferentes morfologias nucleares na epiderme de um embrião de peixe-zebra 48 hpf.. MG, verde metilo. Os espécimes foram contrastadas para F-actina com TRITC-phalloidin. Arrowhead: células mitóticas. Projeção de intensidade máxima de 10 aviões confocal. B) placa neural Pintainho embrião marcado da mesma forma, exibindo células mitóticas (setas) e núcleos picnóticos (setas). Confocal plano único. C) Três aviões confocal únicas de um núcleo epidérmica embrião de peixe-zebra em alta ampliação, mostrando um alto grau de resolução subnuclear. Barras de escala: A, 15 m; B, 5 mm; C, 1 um.
Figura 3:. Fotoestabilidade de verde metilo sob excitação contínua TO-PRO-3-manchado núcleos de uma retina zebrafish 48 hpf foi branqueada em cima de 60 seg de excitação contínua a 633 nm (painéis superiores). Sob as mesmas condições, um embrião verde metil-corados (MG) não mostraram branqueamento perceptível, mesmo quando a duplicação do tempo de exposição (painéis inferiores). Branqueamento e aquisição foi feita por varrimento em planos individuais, a 8.000 Hz, 30% potência do laser e linha (x2) e estrutura (x4) de média. Barra de escala: 30 mm.
| Comprimento de onda (nm) | Emissão por cento |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27,5 |
| 646 | 36.69 |
| 44.47 | |
| 652 | 53.92 |
| 655 | 61,82 |
| 658 | 67,86 |
| 661 | 83,2 |
| 664 | 85,22 |
| 667 | 89,45 |
| 670 | 87,33 |
| 673 | 92,3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97.41 |
| 682 | 90,34 |
| 685 | 83,32 |
| 78,37 | |
| 691 | 76,09 |
| 694 | 73,95 |
| 697 | 67,36 |
| 700 | 64,4 |
| 703 | 61,26 |
| 706 | 56,39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49.56 |
| 715 | 46,12 |
| 718 | 41,4 |
| 721 | 38,8 |
| 724 | 35.97 |
| 33.27 | |
| 730 | 30,95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23,3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19.86 |
| 751 | 17,47 |
| 754 | 16,14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12,45 |
| 763 | 11,49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Material suplementar 1: espectro de emissão de coloração nuclear verde de metilo sob excitação 633 nm.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
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