Protocol
Boyar 1. Saflaştırma
- Damıtılmış su, 10 ml leke tozu 0.4 g çözülmesiyle metil yeşili bir% 4 sulu çözelti hazırlayın. Tamamen eritilmesi gelene kadar iyice karıştırınız.
- Bir duman-Kaputun altında, kloroform en az 2 parçaları ile karıştırarak. Bu tüpler kloroform dayanıklı olup olmadığını önceden kontrol edilmesi önemlidir.
- İyice karıştırın ve faz ayrımını hızlandırmak için 2,000 xg'de 1 dakika boyunca santrifüj.
- Santrifüj işleminden sonra, metil yeşili bir üst sulu faz ve kloroform ile daha düşük bir organik faz ve her zamanki gibi kirletici kristal viyole elde edilir.
- Üst fazı kurtarmak ve alt faz kristal viyole tamamen yoksun görünene kadar bu adımı tekrarlayın.
- Sonunda, üst faz elde edilir ve% 2'lik bir metil yeşili bir nihai konsantrasyona kadar su ile seyreltilir. Bu stok çözeltisi, ay tezgahında stabil olduğu ve ışıktan korunması gerekmez.
- Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde (paraformaldehid ile ilgili) bir karışımı,% 4 formaldehid embriyolar sabitleyin.
NOT: Bu bir kaç saat sürebilir gecede embriyoların kalınlığına bağlı olarak. Örneğin, biz bir gecede 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) zebrafish embriyolar sabit. - 5 dakika boyunca PBS-T (PBS içinde% 1 Triton X-100), embriyolar üç kez yıkayın. deterjanın yüksek konsantrasyonu, kütikül permeabilizes.
- 5,000-1: PBS-T içinde (% 2 stok çözeltiden) metil yeşili 10,000 çözeltisi 1 hazırlayın. inkübasyon sırasında deterjan varlığının örneğin zebra balığı embriyolarının ve larva gibi kalın örneklerde, için kullanışlıdır.
- Hafifçe çalkalanarak, 4 ° C de en az 6 saat boyunca çözelti içinde embriyolar inkübe edin. Yine, embriyo kalınlığı inkübasyon süresi için kalibrasyon parametredir.
- Embriyoların 3 tim yıkayın30 dakika boyunca PBS ile ES deterjan fazlasının ayrılması için. DNA'ya bağlandığı zaman metil, yeşil floresan özelliğinin yalnızca belirgindir, bağlanmamış molekülden dolayısıyla arka ihmal edilebilir düzeydedir.
- Bir kazı slayt veya montaj çözeltisi ile yapımı bölmesi üzerine monte (% 75 gliserol, 0.1 M Tris-HCI, pH 8).
NOT: Nükleer boyanma immunolabeling sonra yapılacak ise, metil yeşil bunu yıkayacak gerek kalmadan, çalışma konsantrasyonunda montaj çözüm eklenebilir. - Mağaza buzdolabında ya da hemen görüntüleme başlatın. 650-750 nm yeşil emisyon 677 nm maksimum ulaşır metil dikkate alarak kayıt ayarlanmış 633 nm ve emisyon filtreleri de uyarma ile bir lazer tarama konfokal (ya da diğer floresan) mikroskop ile görüntüleme gerçekleştirin.
NOT: metil yeşil emisyon profili ölçülen verileri, ek malzeme olarak, satın alma yazılımı yüklenecek sağlamak.
3. Floresan Nükleer StMetil Yeşil kullanarak Tüm Chick Embriyolar Tahliye
- Ilgi sahneye döllenmiş tavuk yumurtaları kuluçkaya yatmaktadır. 4 ° C'de bir gece boyunca PBS (paraformaldehid ile ilgili)% 4 formaldehit embriyolar düzeltildi. 2 saat süre ile, PBS-T içinde embriyolar 3 kere yıkayın.
- 5,000-1: PBS-T içinde (% 2 stok çözeltiden) metil yeşili 10,000 çözeltisi 1 hazırlayın. Gece boyunca 4 ° C sıcaklıkta boyama çözeltisi embriyolar inkübe edin. Embriyolar 3 kere PBS ile 1 saat, her yıkayın. % 75 gliserol, 0.1 M Tris, pH 8, oda içinde monte edin.
4. Görüntüleme Floresan Tüm monte Embriyolar Çekirdeği Etiketli
- Dikkatli bir mikroskop lamı üzerine elektrik bandı birkaç kat yapışmasını tarafından bir görüntüleme odası hazırlayın içinde embriyolar yerleştirmek için bir neşter ile içine bir delik kesti. Bu görüntüleme sırasında ezilme embriyolar önleyecektir.
- Dikkatli bir şekilde% 75 gliserol, 0.1 M Tris-HCI, pH = 8, üstüne bölmeyi görüntüleme odasına embriyo transferi ve dolgugeçersiz kabarcık oluşumu.
- Bir # 0 lamel kaçınarak veya orta taşan ortadan ile kaplayın. Oje ile mühür.
- Bir 633 uyarılma filtreli veya lazer hattı ile teçhiz edilmiş bir flüoresans mikroskobu, numunenin görüntüleri elde edin.
NOT: Emisyon filtreleri metil yeşili 677 emisyon maksimum kapsamalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kalın numunelerin Nükleer boyanma. Burada tarif edilen protokol bütün embriyolar derin yapıların homojen lekelenme başarı sağlar. Gelişmekte mercek çekirdek formu 48 hpf Zebra balığı embriyolar homojen (Şekil 1) etiketlenir.
Metil yeşil DNA boyama gibi mitoz veya apoptotik çekirdeklerin (Şekil 2A) tanımlanması gibi hücre döngüsü bağımlı morfolojik farklılıkların ayrımcılığa izin verir. Zebra balığı embriyolar (Şekil 2B) epidermal çekirdekleri için gösterildiği gibi, yüksek çözünürlükte çekirdek içi yapılar da belirgindir.
Metil yeşil zaman uzun süreler için yüksek yoğunluklu ışınlama altında ışıkla ağartma dayanıklıdır. Aynı yoğunlukta 633 nm lazer ışığı ile ışınlanmış zaman başka bir DNA-spesifik leke paylaşımı benzer spektral özelliklerinin durum TO-PRO-3, olduğu gibi, metil yeşil nükleer boyanma dışarı ağartıcı değil4. Bütün monte Zebra balığı embriyo retinanın Konfokal düzlemi seçilir ve yüksek radyasyon ulaşmak için 63x 1.4NA amacı ile yakınlaştırılmış edildi. Uzaklaştırdınız zaman numuneler ile boyanmış TO-PRO-3 göstermiştir metil yeşili ile boyanmış numuneler aynı şartlarda bile 120 saniye photobleaching hiçbir görünür kanıt gösterirken, sürekli ışınlama (Şekil 3, üst paneller) 60 saniye içinde ağartma (Şekil 3, alt paneller). Fiji açık kaynak kodlu yazılım (http://fiji.sc/) kullanarak LASAF yazılımında edinilen Görüntüler ayrıca (maksimum intensite projeksiyon,, 3 boyutlu rekonstrüksiyon parlaklık / kontrast) işlenmiştir.
Şekil 1:. Metil yeşil derin yapıların Homojen nükleer boyanma z-projeksiyon o da metil yeşil (MG) ile boyandı 48 hpf Zebra balığı embriyo lensi Geliştirme20 konfokal uçakları f. Embriyolar TRITC birleşmiş falloidin (Phal) F-aktin zıt. Ölçek çubuğu: 15 mikron.
Şekil 2: Nükleer morfolojisi ve metil yeşil boyama A) 48 hpf Zebra balığı embriyo epidermis Farklı nükleer morfolojileri ile subnuclear çözünürlük.. MG, metil yeşil. Numuneler TRITC-Phalloidin ile F-aktin zıt. Ok başı: mitotik hücre. 10 konfokal uçaklarının maksimum yoğunluk projeksiyonu. Mitotik hücreler (ok başları) ve piknotik çekirdekleri (oklar) görüntüleme aynı şekilde etiketlenmiş B) Civciv embriyo nöral plak. Tek konfokal uçağı. C) subnuclear çözünürlük yüksek derecede gösteren yüksek büyütmede bir Zebra balığı embriyo epidermal çekirdeğinin, üç tek konfokal uçakları. Ölçek çubukları: A, 15 mikron; B, 5 um; Cı, 1 um.
Şekil 3:. 48 hpf Zebra balığı retinanın sürekli uyarma altında metil yeşil fotostabilite TO-PRO-3-lekeli çekirdekleri 633 nm (üst panel) sürekli uyarım 60 saniye sonra ağartılmış edildi. Maruz kalma süresi (alt paneller) çoğaltma zaman bile, aynı koşullar altında, bir metil-yeşil lekeli embriyo (MG), algılanabilir ağartma göstermemiştir. Beyazlatma ve satın alma 8.000 Hz,% 30 lazer gücü ve hat (x2) ve çerçeve (x4) ortalamasından az, tek düzlemlerde tarama tarafından yapıldı. Ölçek çubuğu: 30 mikron.
| Dalga boyu (nm) | Yüzde emisyonu |
| 640 | 21.37 |
| 643 | 27.5 |
| 646 | 36,69 |
| 44,47 | |
| 652 | 53,92 |
| 655 | 61.82 |
| 658 | 67.86 |
| 661 | 83.2 |
| 664 | 85.22 |
| 667 | 89,45 |
| 670 | 87,33 |
| 673 | 92.3 |
| 676 | 100 |
| 679 | 97,41 |
| 682 | 90,34 |
| 685 | 83,32 |
| 78,37 | |
| 691 | 76,09 |
| 694 | 73.95 |
| 697 | 67,36 |
| 700 | 64.4 |
| 703 | 61.26 |
| 706 | 56.39 |
| 709 | 55.06 |
| 712 | 49,56 |
| 715 | 46.12 |
| 718 | 41.4 |
| 721 | 38.8 |
| 724 | 35.97 |
| 33,27 | |
| 730 | 30.95 |
| 733 | 28.78 |
| 736 | 26.28 |
| 739 | 24.96 |
| 742 | 23.3 |
| 745 | 21.12 |
| 748 | 19,86 |
| 751 | 17.47 |
| 754 | 16.14 |
| 757 | 14.21 |
| 760 | 12.45 |
| 763 | 11.49 |
| 9.97 | |
| 769 | 7.55 |
| 772 | 7.75 |
| 775 | 6.46 |
| 778 | 5.76 |
| 781 | 4.38 |
| 784 | 2.6 |
| 787 | 2.75 |
| 790 | 2.27 |
| 793 | 1.52 |
| 796 | 0 |
Ek madde 1: 633 nm uyarma altında metil yeşil nükleer boyanma Emisyon spektrumu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Methyl green | Dr. G. Grübler | Also tested Sigma-Aldrich 323829, which is crystal violet-free | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Laser scanning confocal microscopy Leica TCS-SP5 | Leica Microsystems | ||
| Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate | Sigma-Aldrich | P1951 |
|
| chloroform | Sigma-Aldrich | 372978 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 5811 000.010 | |
| microscope slides | Deltalab | D100004 | |
| cover slips | Esco optics | R525025 |
References
- Klonisch, T., Wark, L., Hombach-Klonisch, S., Mai, S. Nuclear imaging in three dimensions: a unique tool in cancer research. Annals of anatomy. 192 (5), 292-301 (2010).
- Kapuscinski, J. DAPI: a DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic. 70 (5), 220-233 (1995).
- Latt, S. A., Stetten, G. Spectral studies on 33258 Hoechst and related bisbenzimidazole dyes useful for fluorescent detection of deoxyribonucleic acid synthesis. The journal of histochemistry and cytochemistry. 24 (1), 24-33 (1976).
- Van Hooijdonk, C. A., Glade, C. P., Van Erp, P. E. TO-PRO-3 iodide: a novel HeNe laser-excitable DNA stain as an alternative for propidium iodide in multiparameter flow cytometry. Cytometry. 17 (2), 185-189 (1994).
- Beumer, T. L., Veenstra, G. J., Hage, W. J., Destrée, O. H. Whole-mount immunohistochemistry on Xenopus embryos using far-red fluorescent dyes. Trends in genetics. 11 (1), 9 (1995).
- Prieto, D., Aparicio, G., Morande, P. E., Zolessi, F. R. A fast, low cost, and highly efficient fluorescent DNA labeling method using methyl green. Histochemistry and cell biology. 142 (3), 335-345 (2014).
- Kim, S. K., Nordén, B. Methyl green. A DNA major-groove binding drug. FEBS letters. 315 (1), 61-64 (1993).
- Nordén, B., Tjerneld, F. Binding of methyl green to deoxyribonucleic acid analyzed by linear dichroism. Chemical Physics Letters. 50 (3), 508-512 (1977).
- Lyon, H., Jakobsen, P., Andersen, aP. Standardized methyl green-pyronin Y procedures using pure dyes. The Histochemical journal. 18 (2-3), 90-94 (1986).
- Amat, F., Keller, P. J. Towards comprehensive cell lineage reconstructions in complex organisms using light-sheet microscopy. Development, growth & differentiation. 55 (4), 563-578 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature methods. 10 (6), 508-5013 (2013).
- Lenz, P. Fluorescence measurement in thick tissue layers by linear or nonlinear long-wavelength excitation. Applied. 38 (16), 3662-3669 (1999).
