Introduction
Sviluppo di un vaccino tradizionale è principalmente impiegato l'approccio empirico di tentativi ed errori. Tuttavia, con il recente sviluppo di una vasta gamma di biomateriali e scoperta di determinanti molecolari di attivazione immunitaria, è ora possibile progettare razionalmente formulazioni di vaccino con spunti biofisici e biochimici derivati da agenti patogeni 1,2. In particolare, diverse piattaforme di distribuzione di droga di particolato sono stati esaminati come portatori di vaccini in quanto possono essere co-caricati con antigeni subunità e agenti immunostimolanti, proteggere i componenti del vaccino dal degrado, e migliorare la loro co-consegna all'antigene cellule presentanti (APC) residente in linfa nodi (LNS), massimizzando in tal modo la stimolazione immunitaria e l'attivazione 3-5. In questo rapporto, descriviamo la sintesi di un sistema di nanoparticelle "-patogeno imitando", chiamato interbilayer reticolato vescicole multilamellari (ICMVs), che sono stati precedentemente dimostrato come platfor potente vaccinom per lo scatenamento di robusta linfociti T citotossici (CTL) e le risposte immunitarie umorali in entrambi i compartimenti sistemiche e delle mucose 6-9. In particolare, la vaccinazione con ICMVs ottenuti in sostanzialmente migliorata livelli di IgG sieriche contro un antigene della malaria, in confronto con la vaccinazione con adiuvanti convenzionali (ad esempio, allume e Montanide) 7 e anche suscitato risposte CTL potenti contro le cellule tumorali e modelli sfida virali nei topi 9. Qui, utilizzando ICMVs come sistema di nanoparticelle modello di vaccino, si descrivono i metodi per la caratterizzazione di vaccini nano-formulazioni, tra cui le dimensioni delle particelle e le misure di potenziale zeta e il monitoraggio del traffico di particelle per LNs drenanti (dLNs) utilizzando confocale dei tessuti cryosectioned 7. Inoltre, vi presentiamo un metodo basato imaging intero animale di analizzare l'espansione delle risposte CTL nei topi dopo il trasferimento adottivo di antigene-specifiche cellule T CD8 +-luciferasi che esprimono 9,10. Infine, describa tetramero colorazione delle cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) per la quantificazione longitudinale risposte delle cellule T endogene nei topi vaccinati con nanoparticelle 6,9.
ICMVs sono una formulazione di nanoparticelle a base lipidica sintetizzata da fusione controllata di liposomi multilamellari semplici in strutture, che vengono poi stabilizzati chimicamente mediante gruppi di testa di fosfolipidi maleimmide-funzionalizzati reticolanti all'interno di strati lipidici con ditiolo reticolanti 6. Una volta che sono sintetizzati ICMVs, una piccola frazione di nanoparticelle può essere utilizzata per determinare la dimensione delle particelle e il potenziale zeta (cioè, carica superficiale di particelle) con un sistema di dispersione dinamica della luce (DLS) e un analizzatore di potenziale zeta. DLS misura le variazioni nella diffusione della luce in sospensioni di particelle, permettendo la determinazione del coefficiente di diffusione e la dimensione idrodinamica delle particelle 11. Il raggiungimento di dimensioni coerente delle particelle da lotto a lotto sintesi è fondamentaledal momento che la dimensione delle particelle è uno dei principali fattori che influenzano drenaggio linfatico di particelle di vaccini per dLNs e la successiva captazione cellulare da APC 12,13. Inoltre, il potenziale zeta può essere ottenuto misurando la velocità della particella quando viene applicata una corrente elettrica, che permette di determinare la mobilità elettroforetica di particelle e superficie delle particelle di carica 11. Assicurare coerenti valori di potenziale zeta delle particelle è importante poiché carica superficiale delle particelle determina stabilità colloidale, che ha un impatto diretto sulla dispersione di particelle durante la conservazione e dopo somministrazione in vivo 14,15. Al fine di monitorare la localizzazione delle particelle di dLNs, ICMVs possono essere etichettati con fluorofori desiderati incluse tinture lipofile e antigeni covalente-tag. A seguito di vaccinazione, i topi possono essere sacrificati in vari momenti, dLNs asportato, cryosectioned, e analizzati con microscopia confocale. Questa tecnica permette la visualizzazione di Drai linfaticaning di entrambi i vettori di vaccino nanoparticelle e antigene dLNs. Le sezioni di tessuto possono inoltre essere marcate con fluorescenza etichettati anticorpi e utilizzati per ottenere ulteriori informazioni, come i tipi di cellule associate con l'antigene e formazione di centri germinali come abbiamo mostrato in precedenza 7.
Una volta che la sintesi delle particelle è ottimizzata e la tratta ai dLNs è confermato, è importante per convalidare elicitation in vivo espansione CTL. Al fine di analizzare scatenamento di cellule antigene-specifiche T CD8 + in risposta alla vaccinazione delle nanoparticelle, abbiamo utilizzato un modello di antigene ovalbumina (OVA), con OVA 257-264 peptide (SIINFEKL) immunodominante epitopi delle cellule T CD8 +, che permette analisi dettagliate immunologici di risposte delle cellule T antigene-specifiche per iniziale 16,17 lo sviluppo di vaccini. In particolare, per interrogare le dinamiche di espansione e la migrazione delle cellule antigene-specifiche CD8 + T, abbiamo generato undoppio modello di topo transgenico incrociando lucciola luciferasi che esprimono topi transgenici (Luc) con OT-I topi transgenici che possiedono le cellule CD8 + T con recettore delle cellule T (TCR) specifico per SIINFEKL (in associazione con H-2K b). Da questi topi OT-I / Luc, luciferasi che esprimono, le cellule OT-I T CD8 + possono essere isolati e preparati per il trasferimento adottivo in naïve topi C57BL / 6. Una volta seminato, l'immunizzazione con successo nanoparticelle-OVA contenente comporterà l'espansione delle cellule T trasferiti che possono essere monitorati dal monitoraggio del segnale bioluminescenza con un intero sistema di imaging 9,10 animale. Questa tecnica di imaging corpo intero non invasiva è stato usato con altri antigeni virali o tumorali in passato 18-20, processi di espansione delle cellule T nei tessuti linfoidi e diffusione ai tessuti periferici in modo longitudinale rivelare.
Complementare all'analisi di adoptively cellule T CD8 + antigene-specifici trasferiti, endogenole risposte delle cellule T a noi dopo la vaccinazione può essere esaminata con il complesso peptide-maggiore di istocompatibilità (MHC) test tetramero 21, in cui un complesso tetramero peptide-MHC, composta da quattro MHC di classe fluoroforo-tagged molecole I caricato con epitopi peptidici, è impiegato di legare TCR ed etichettare le cellule T CD8 + in modo antigene-specifica. Il test tetramero peptide-MHC può essere effettuata sia in studi della necroscopia terminali per identificare le cellule CD8 + T antigene-specifiche in linfoidi e tessuti periferici o in studi longitudinali con le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) ottenuti da sangue di serie pareggi. Dopo la colorazione linfociti con peptide-MHC tetramero, citofluorimetria analisi viene eseguita per analisi dettagliate sul fenotipo di CTL o la quantificazione della loro frequenza tra cellule T CD8 +.
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Protocol
Tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato Università sull'uso e la custodia degli animali (UCUCA) presso l'Università del Michigan ed eseguito secondo le politiche e le linee guida stabilite.
1. Sintesi e caratterizzazione di ICMVs Co-caricato con proteine antigene e adiuvante Molecole
- Mescolare 1: 1 rapporto molare di 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramide] (MPB) in cloroformio, mantenendo la quantità totale di lipidi a 1,26 mmol per batch (cioè, 500 mg di DOPC e 630 pg di MPB) in una fiala di vetro da 20 ml (diametro = 28 mm e altezza = 61 mm).
- Aggiungere farmaci lipofili, come monofosforil lipide A (MPLA) o coloranti lipofili (ad esempio, DID), alla soluzione lipidica a concentrazione desiderata. Rimuovere accuratamente il solvente organico da spurgo con nitroge extra dryn gas e ponendo i campioni sotto vuoto O / N.
- Idratare il film lipidico aggiungendo 200 ml di 10 mM bis-tris propano (BTP, pH 7.0) contenente idrosolubili farmaci (ad esempio, antigeni proteici). Vortex per 10 sec ogni 10 min per 1 ora a RT.
- Trasferire il contenuto della fiala di vetro in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga, posto i campioni in un bagno di acqua e ghiaccio, e sonicare continuamente per 5 minuti con l'impostazione su una 125 W / 20 kHz sonda punta sonicatore intensità del 40%.
- Aggiungere 4 ml di ditiotreitolo 150 mm (DTT) per ogni lotto (Concentrazione di impiego 2,4 mm), vortex e centrifugare brevemente con una microcentrifuga da tavolo.
- Aggiungere 40 ml di 200 mM CaCl 2 e mescolare con la pipetta (Concentrazione di impiego 33 mm). Incubare i campioni a 37 ° C per 1 ora per permettere la reticolazione di MPB contenenti strati lipidici con DTT.
- Campioni centrifugare a 20.000 g per 15 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere in 200 ml di ddiH 2 O.
- Ripetere il passaggio 1.7 e centrifugare di nuovo dopo il secondo ddiH 2 O lavaggio per rimuovere CaCl 2, che non ha reagito DTT, e materiali di carico non incapsulate dal surnatante.
- Preparare 10 mg / ml di 2 kDa polietilenglicole-tiolo (PEG-SH) in ddiH 2 O. Risospendere ogni campione ICMV in 100 ml di soluzione di PEG-SH e incubare a 37 ° C per 30 min.
- Eseguire due ddiH 2 O lavaggi (passo 1,7) e risospendere il pellet ICMV finale in PBS e conservare a 4 ° C. Prima dell'uso, mescolare la sospensione ICMV, come particelle possono depositarsi sul fondo dopo una conservazione prolungata.
- Per la caratterizzazione di particelle, rimuovere una piccola aliquota (~ 10%) di ICMVs da ogni lotto e diluire singolarmente in un volume totale di 1 ml di ddiH 2 O. Mettere un unico campione in una dimensione Zetasizer cellulare e misura delle particelle, indice di polidispersità, e il potenziale zeta dei campioni con un sistema di misura e DLS potenziale zeta (secondo il protocollo del produttore).
2. Esame del linfonodo drenante di ICMVs fluorescenza-etichettato con Microscopia confocale
- Preparazione di ICMVs caricato con l'antigene fluoroforo marcatura ed colorante fluorescente lipofile
- Preparare proteina fluoroforo-tag, come ovalbumina reagito con Alexa Fluor 555-succinimidile estere, seguendo le istruzioni del produttore.
- Per preparare ICMVs taggati con fluoroforo nella shell di lipidi, aggiungere colorante fluorescente lipofile, (ad esempio, 1,1'-diottadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) durante la preparazione del film lipidico (Step 1.2) al 0,05% dell'importo di lipidi molare. Per lipidi idratazione pellicola (Step 1.3), tampone uso contenente antigene fluoroforo-tag, e completa la sintesi ICMV come indicato dal passo 1,4-1,11.
- La somministrazione sottocutanea di nanoparticelle a base di coda
- Anestetizzare mouse usando un vaporizzatore flusso controllato dotato di una camera di induzione urazie 3% isoflurano e 1.5 L / min di flusso di ossigeno secondo un protocollo approvato IACUC animale. Una volta che il mouse è inconscia, effettuare le seguenti operazioni rapidamente prima dell'anestesia indossa off per consentire l'accesso ottimale al sito di iniezione e minimizzare il disagio per l'animale. In alternativa, utilizzare un adeguato cono adatto per mantenere l'anestesia. Se i topi vengono anestetizzati per più di 5 minuti, applicare lubrificante necessario per ridurre al minimo l'irritazione degli occhi dopo la procedura.
- Spruzzare la base della coda con il 70% di etanolo per disinfettare e bagnare la parte pelliccia capelli bagnati evidenziare una piccola zona di pelle visibile, che può essere usato per visualizzare l'ago sotto la pelle.
- Preparare sospensione iniettabile contenente particelle desiderata quantità di antigene e adiuvante per 100 ml di dose vaccinale in PBS (es, 10 mg e 0,3 mg OVA MPLA per 100 ml di dosaggio di iniezione è stato utilizzato in passato 6,9).
- Disegnare il int sospensione di particellesiringa oa con un ago G 27-29 e inserire l'ago alla base della coda (~ 5 mm dalla linea sottile) con lo smusso rivolto verso l'alto e iniettare 50 ml di sospensione di particelle 22.
- Attendere qualche secondo per la pressione di pareggiare per evitare un eccessivo riflusso ed estrarre l'ago. Ripetere l'iniezione sul lato opposto della base della coda di indirizzare entrambi drenanti LNs inguinali.
- Preparazione di criosezioni linfonodali e l'esame con la microscopia confocale.
- Euthanize il mouse con CO 2 asfissia seguita da pneumotorace indotta secondo un protocollo approvato IACUC animale. Estrarre LNs inguinali secondo il protocollo dimostrato in Bedoya 23 e lavare il sangue ponendo i tessuti in 1 ml di 4 ° C PBS.
- Assorbire il PBS dai tessuti con i tessuti e posizionare il tessuto in cryomolds tessuto (10 x 10 x 5 mm 3) pre-riempita fino all'orlo con ottobre congelamento media 24. Snap congelare il tiscitare blocco in azoto liquido per 30 sec. In alternativa, posizionare blocco tessuto in ghiaccio secco per 30 min. Conservare tessuti congelati in -80 ° C freezer.
- Tagliare sezioni di tessuto di spessore 5-10 micron di un criostato fissato a -20 ° C 24.
- Se necessario, eseguire l'etichettatura immunofluorescenza, ed esaminare il tessuto con la microscopia confocale come precedentemente dimostrato 24.
3. Monitoraggio espansione di antigene-specifica, luciferasi che esprimono CD8 + cellule T dopo nanoparticelle vaccinazione con Whole Animal Imaging
- Isolamento di OVA 257-264 -specific, le cellule-luciferasi che esprimono CD8 + T da OT-I / Luc topi transgenici
- Eutanasia di un topo transgenico OT-I / Luc con CO 2 asfissia e indurre un pneumotorace secondo un protocollo approvato IACUC animale. Raccolto milza in modo sterile accedendo cavità peritoneale e staccare il tessuto dal pancreas 23 accuratamente, eposto in 5 ml di 4 ° C PBS + 2% FBS per trasferimento a cappa coltura tissutale.
- Posizionare la milza su un nylon colino 70 micron su un 50 ml conica tubo da centrifuga (fino a 3 milze alla volta). Utilizzando un pistone da una siringa da 3 ml, macinare le cellule attraverso il filtro.
- Lavare il pistone e il filtro con PBS + 2% FBS e scartare. Portare il volume totale di 10 ml / milza nel tubo 50 ml, prelevare un piccolo campione della sospensione cellulare a contare con un emocitometro e centrifugare per 10 min a 300 x g.
- Utilizzando un kit magnetico selezione negativa in commercio, isolare la popolazione di cellule T CD8 +, seguendo le istruzioni del produttore.
- Dopo aver lavato le cellule con PBS, contare il numero di isolate cellule T CD8 +. Per valutare la purezza delle isolate cellule T CD8 +, incubare ~ 20.000-30.000 cellule in 20 ml di topo CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) per 10 minuti, quindi aggiungere 20 ml di anticorpi αCD8-APC (0,005 mg / ml) e incubare per 30 min. Perform tutte le incubazioni a 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Eseguire l'analisi di citometria di flusso 25.
- Trasferimento adottivo di isolate cellule T CD8 + e la visualizzazione della loro vaccinazione posto espansione
- Eseguire trasferimento adottivo di cellule isolate OT-I / Luc CD8 + T in naive C57BL / 6 topi somministrando 1-10 × 10 5 cellule in un volume di 200 microlitri di PBS via endovenosa coda vena 22 (giorno -1). Considerando che in pelliccia e pelle nera patch in topi C57BL / 6 può interferire con il segnale bioluminescente, albini rasato C57BL / 6 topi sono l'ideale per questi studi.
- Dopo una giornata (giorno 0), somministrare il vaccino, come descritto in precedenza (paragrafo 2.2).
- Somministrare 150 mg di luciferina per kg di peso corporeo per via intraperitoneale topo in un volume di 300 ml di PBS. Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con isoflurano (come al punto 2.2.1) e visualizzare le cellule OT-I / Luc CD8 + T con l'acquisizione del segnale di bioluminescenza per 5-10 min wesimo un intero sistema di imaging animale (IVIS, fare riferimento a Wilson 26 per istruzioni dettagliate). Ripetere se necessario per studi longitudinali.
4. Peptide-MHC Tetramero colorazione di PBMC per l'analisi di Antigen-specific cellule T CD8 +
Nota: La seguente procedura di protocollo può essere effettuata sia utilizzando i topi C57BL / 6 adoptively trasferiti con cellule OT-I / Luc CD8 + T o C57BL / 6 topi senza il trasferimento adottivo.
- In un punto di tempo desiderato dopo la vaccinazione, raccogliere circa 100 ml di sangue (4-6 gocce) di topi tramite sottomandibolare tecnica sanguinamento 27 in un tubo rivestito di K 2 EDTA e capovolgere più volte per impedire la coagulazione.
- Trasferire 100 ml di sangue in una provetta, aggiungere 1 ml di tampone di lisi, e incubare per 2-3 minuti per rimuovere i globuli rossi (RBC). Campioni di centrifugazione per 5 min a 1500 xg e rimuovere il surnatante. Se il pellet ancorappears rossi (che indicano la rimozione incompleta di globuli rossi), ripetere il passo lisi con una breve incubazione (<1 min) di tampone di lisi.
- Lavare le rimanenti PBMC con 1 ml di tampone FACS (PBS + 1% w / v BSA) e centrifugare a 1500 xg per 5 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere il campione in 20 ml di topo CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) per bloccare il legame degli anticorpi specifici e FCR-mediata. Incubare per 10 minuti a temperatura ambiente.
- Trasferire le cellule da microprovette in 4 ml tubi FACS con fondo arrotondato. Aggiungere 20 ml di H-2K b soluzione OVA Tetramero-SIINFEKL-PE secondo le specifiche del costruttore per ogni campione e incubare per 30 minuti in ghiaccio.
- Preparare il cocktail di anticorpi (ad esempio, αCD8-APC, αCD44-FITC e αCD62L-PECy7 anticorpi (0.005, 0.005, e 0.002 mg / ml di concentrazione, rispettivamente)). Aggiungere 20 microlitri di ciascun campione sperimentale, e incubare per 20 min in ghiaccio. Preparare controlli singoli fluorofori per labeling cellule con ogni tetramero fluoroforo-tag o anticorpi alla concentrazione sopra indicato.
- Lavare 2 volte con tampone FACS e risospendere il pellet finale in tampone FACS contenente 2 mg / ml di DAPI. Le cellule sono ora pronti per citometria a flusso di analisi (dettagli ed esempi possono essere trovati in Scheffold 25).
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Representative Results
I passi necessari per la sintesi di ICMVs sono illustrati in Figura 1 6. In breve, un film lipidico contenenti farmaci lipofili o coloranti fluorescenti è idratata in presenza di farmaci idrofili. Cationi divalenti, quali Ca 2+, si aggiungono a guidare fusione dei liposomi anionici in vescicole multilamellari. Ditiolo crosslinker, come DTT, è aggiunto il "fiocco" lipidi maleimmide-funzionalizzati su apposing strati lipidici, e, infine, rimanendo gruppi maleimmide esterne sono spenta in una reazione con tiolati-PEG frazioni. Una piccola frazione di ciascun lotto può essere facilmente sottoposta a misure di controllo di qualità per la determinazione della dimensione delle particelle, indice di polidispersità, e il potenziale zeta con DLS e potenziale zeta sistema di analisi. Le particelle risultanti sono relativamente omogenei con una dimensione media di 130 ± 20 nm, indice di polidispersità di 0,22 ± 0,02, e il potenziale zeta di -54 ± 3 mV per-OVA incapsulare particoli (Figura 1B e 1C). Tipico resa di particelle, misurate in peso secco di particelle, è ~ 50% 6.
Utilizzando il protocollo sopra descritto, ICMVs può essere co-caricato con fluoroforo-tagged proteine antigene e colorante fluorescente lipofila, consentendo la visualizzazione di antigene e nanoparticelle consegna in vivo. Per confrontare i modelli di fornitura dell'antigene in forma solubile rispetto a ICMVs, C57BL / 6 topi sono stati somministrati sc alla base della coda con 100 mg di AlexaFluor555-tagged OVA sia in LNs inguinali solubili o DID-etichettati formulazioni ICMV, e drenanti venivano asportate a vari punti di tempo per la preparazione del DLN tessuto crio-sezioni. Visualizzazione con microscopia confocale ha indicato che l'antigene solubile raggiunta rapidamente le dLNs entro 4 ore, ma è stato anche cancellato molto rapidamente con 24 ore (Figura 2) 7. Al contrario, ICMVs OVA-caricati sono stati rilevati alla periferia di dLNs da 24 ore, con continuo accumulocome esaminato il giorno 4, depositando una grande quantità di OVA-ICMVs in dLNs (Figura 2). Microscopio confocale hanno dimostrato anche co-localizzazione di AlexaFluor555-tagged OVA e ICMVs all'interno dLNs DID-etichettati, suggerendo che ICMVs permettono stabile co-fornitura di antigeni proteici e di altri agenti immunostimolante incapsulate all'interno ICMVs 7.
Isolamento di cellule CD8 + T da OT-I / Luc topo transgenico può essere facilmente eseguita con il kit magnetica selezione negativa commercialmente disponibile, cedendo ~ 8-12 x 10 6 cellule per milza mouse. Figura 3 mostra C57BL / 6 topi adoptively trasferiti con 5 x 10 5 cellule OT-I / Luc CD8 + T il giorno -1, e vaccinati al giorno 0 con la somministrazione sottocutanea di 10 mg di OVA e 0,3 mg di MPLA sia nelle formulazioni solubili o ICMV. Bioluminescenza con IVIS eseguita al giorno 0 prima della vaccinazione ha dimostrato il minimo segnale OT-I / Luc. Tuttavia, il giorno 4 dopo la vaccinazione, i topi immunizzaticon OVA / MPLA-ICMVs aveva segnale bioluminescenza robusto all'interno LNs inguinali, che sono LNs drenaggio della regione di base coda 28. In contrasto, topi immunizzati con la forma solubile del vaccino mostrato molto ridotta espansione delle cellule OT-I / Luc CD8 + T entro dLNs inguinali.
Usando OVA come modello antigene permette il monitoraggio di espansione endogene cellule T CD8 + specifiche per immunodominante OVA 257-264 peptide (SIINFEKL). Ad esempio, C57BL / 6 topi sono stati immunizzati ai giorni 0, 21, e 35 con la somministrazione sottocutanea di 10 mg OVA e 0,3 mg MPLA sia ICMVs o forma solubile, e frequenze di SIINFEKL-specifiche cellule T CD8 + tra le cellule T CD8 + in PBMCs sono stati determinati dal flusso citometria di PBMC colorati con SIINFEKL-H-2K b tetramero-PE. figura 4A mostra flusso rappresentante citometria grafici a dispersione di SIINFEKL-H-2K b tetramero + cellule tra le cellule T CD8 + in PBMC il giorno 41 6. Figure 4B mostra appezzamenti rappresentativi dispersione di cellule CD44 + CD62L + con fenotipo centrale memoria tra cellule T CD8 + SIINFEKL-tetramero +. Controllo settimanale PBMC mostrato nella Figura 4C ha indicato che il vaccino solubile OVA suscitato minima espansione delle cellule antigene-specifiche T CD8 +, che la vaccinazione ICMV suscitato significativamente più forte le risposte delle cellule T CD8 +, il raggiungimento di un cellule T picco del 28% SIINFEKL-tetramero + nel CD8 + popolazione di cellule T di giorno 41 6. Utilizzando il protocollo di colorazione tetramero presentato qui, abbiamo osservato la frequenza di 0,11% sfondo ± cellule T specifiche per OVA 0,04% (N = 15) in animali non trattati o trattati con PBS, e possiamo rilevare aumento statisticamente significativo frequenze cellule CD8 + T antigene-specifiche a partire da 0,46% ± 0,05% (p-value <0,005, dati non mostrati).
Figura 2. Analisi di antigene ai linfonodi drenanti con microscopia confocale. C57BL / 6 topi sono stati immunizzati con 100 mg fluoroforo coniugato OVA (mostrato in rosso) e 5 mg MPLA sia in soluzione che ICMVs (in blu). Drenante linfonodi inguinali sono stati asportati in momenti indicati, cryosectioned, e ripreso con microscopia confocale. Sono mostrati micrografie confocale Rappresentante. Segnali rosa indicano co-localizzazione di OVA e ICMVs. Questo dato è stato modificato da Moon et al. 7. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 3. Verifica e Controlespansione delle cellule g T dopo la vaccinazione. C57Bl / 6 topi albini sono stati trasferiti adoptively iv di 5 x 10 5 cellule Luc + OT-I T CD8 + il giorno -1. Il giorno 0, gli animali sono stati somministrati con 10 mcg di OVA e 0,1 mg di MPLA sia come formulazioni solubili o ICMV. Gli animali sono stati anestetizzati con isoflurano e somministrati con luciferina (150 mg / kg, 300 ml ip iniettato), e il segnale di bioluminescenza da cellule Luc + OT-1 T CD8 + è stata acquisita con IVIS. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questo figura. 
Figura 4. Ampliamento delle cellule endogene specifiche per OVA CD8 + T dopo la vaccinazione ICMV. C57BL / 6 topi sono stati immunizzati con 10 mcg di OVA e 0,1 mg di MPLA entrambi isoluzione n o ICMVs nei giorni 0, 21, e 35 (frecce). Frequenza di cellule T specifiche per OVA tra cellule mononucleari del sangue periferico è stata valutata nel corso del tempo attraverso l'analisi di citometria di flusso di SIINFEKL-MHC-I tetramero + cellule T CD8 +. (A) Flusso Rappresentante citometria grafici a dispersione di topi individuo al giorno 41 mostra SIINFEKL-MHC-I tetramero + cellule T CD8 + e (B), le cellule CD44 + + CD62L, marcatore di cellule T di memoria centrale. (C) La cinetica complessiva di espansione delle cellule T e contrazione è mostrato. Questo dato è stato modificato da Moon et al. 6. Clicca qui per vedere una versione più grande della figura.
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Discussion
Il protocollo fornito in questo articolo descrive la sintesi e la caratterizzazione di un nuovo sistema di nanoparticelle a base lipidica, chiamato ICMVs, e fornisce il processo di convalida dell'efficacia delle formulazioni di vaccino a base di nanoparticelle di indurre risposte delle cellule CD8 + T antigene-specifiche. Sintesi ICMV si completa in tutte le condizioni acquosa, che è un importante vantaggio rispetto ad altri sistemi comunemente utilizzati polimerici nanoparticelle (ad esempio, poli (lattide-co-glicolico) particelle acide), che tipicamente richiedono solventi organici per la preparazione, spesso con conseguente perdita di antigenicità di proteine antigeni 29,30. Inoltre, ICMVs beneficiare di ampia stabilità e la capacità di incapsulare le molecole sia idrofobe e idrofile 6, permettendo così co-fornitura di antigeni e adiuvanti mirati allo stesso compartimento intracellulare all'interno APC 31,32. Usando ICMVs come una nanoparticella modello di vaccino, qui abbiamo delineato le procedureper (1) la sintesi di nanoparticelle e caratterizzazione, (2) la convalida di nanoparticelle drenaggio per dLNs, e l'esame di elicitazione di risposte delle cellule CD8 + T antigene-specifici utilizzando (3) una tecnica di imaging bioluminescenza non-invasivo e (4) il peptide-MHC tetramero colorazione test su PBMC.
E 'fondamentale per garantire l'uniformità nella sintesi di nanoparticelle da lotto a lotto, soprattutto per la dimensione delle particelle e la carica superficiale in quanto possono influenzare notevolmente drenaggio linfatico e assorbimento da APC al momento in vivo amministrazione. DLS e analisi potenziale zeta forniscono metodi rapidi di controllo di qualità sulle dimensioni delle particelle e carica superficiale. Per analisi più dettagliate sulla morfologia delle singole particelle, queste tecniche possono essere integrate ad alta risoluzione microscopia elettronica, come ad esempio la microscopia crioelettronica (Cryo-EM) che conserva la morfologia delle particelle "soft" in fase acquosa vetrificata 6,33,34 . Efficienza incapsulamento di antigeni e adjuvformiche devono essere determinati e tenuti uniforme fra sintesi. Gli adiuvanti, come MPLA, possono essere etichettati con un fluoroforo 6 mentre antigeni proteici possono essere quantificati utilizzando kit proteina quantificazione absorbance- e basate sulla fluorescenza, o analizzati utilizzando SDS-PAGE 35 e Coomassie o argento colorazione 36, e quantificati sulla base di intensità della banda . Incongruenze in preparazione delle particelle possono derivare da reagenti scaduti o mal conservati, come reattività ottimale è necessario per la sintesi completa. A tal fine, maleimide- e thiol- reagenti funzionalizzati dovrebbero essere tenuti in piccole aliquote a -80 ° C senza frequenti cicli di gelo-disgelo.
Le particelle inferiori a 100 nm sono generalmente pensato di inserire efficacemente i vasi linfatici e il traffico di dLNs 13, mentre le particelle più grandi (500-2.000 nm) richiedono trasporto attivo dalle DC tissutali residenti 12,37. Nelle nostre mani, ICMVs con la dimensione idrodinamica vanno 150-250 Nm in modo efficiente localizzato e persisteva nel DLN, con conseguente ampia CTL e risposte umorali 6,7. Entro 24 ore di somministrazione, ICMVs sono stati associati con i macrofagi subcapsular seno in dLNs, e citometria a flusso analisi eseguite nei giorni 1 e 4, hanno indicato che la maggior parte ICMVs all'interno dLNs furono riprese da APC LN residenti con solo una piccola parte di particelle associate con Langerhans e DC dermici 7. Questi risultati hanno indicato che il trasporto passivo è la principale modalità di ICMV traffico a dLNs. Questi studi hanno utilizzato nanoparticelle fluoroforo-tag e gli antigeni proteici di delineare i loro modelli di localizzazione e distribuzione in dLNs. La microscopia confocale di dLNs cryosectioned permette istochimica immunofluorescenza supplementari per l'identificazione di strutture LN (ad esempio, GL-7 espressione nei centri germinali) e le cellule interagiscono con i componenti della formulazione (ad esempio, DC - CD11c, macrofagi - F4 / 80, CD169, e B- cellule & #8211; B220) 7,9. Questa tecnica può essere eseguita in parallelo con citometria a flusso analisi di cellule raccolte da dLNs per delineare i sottoinsiemi di APC responsabili particelle assorbimento 7,9 o con l'imaging intero animale per quantificare la distribuzione del vaccino dal sito di iniezione a dLNs 38,39, a condizione che i segnali fluorescenti sono forti e autofluorescenza tessuto non interferisca con i segnali.
Immunizzazione efficace richiede robusta attivazione e l'espansione delle cellule T citotossiche antigene-specifiche, che possono essere monitorati da tutto il corpo di imaging bioluminescenza dopo il trasferimento adottivo di bioluminescente, le cellule T transgeniche antigene-specifiche, seguito da vaccinazione. Il vantaggio di questo metodo è il potenziale per la visualizzazione ripetuta di traffico CTL negli stessi animali per un periodo prolungato, riducendo così il numero di animali necessari per le analisi immunologiche e di evitare l'uso di laboriosa isolamento delle cellule immissioes. Utilizzando questa tecnica di imaging, abbiamo recentemente dimostrato che la somministrazione polmonare di ICMVs co-caricato con antigene proteico e un agente immunostimolante portato alla potente scatenamento di cellule antigene-specifiche CD8 + T a livello polmonare e LNs mediastiniche e successiva diffusione di CTL a mucose distali , comprese le placche di Peyer, cieco, e tratto vaginale 9. Citometria di flusso analisi ha mostrato che queste cellule T CD8 + recentemente ampliato sono stati impressi con un fenotipo "mucosa-homing", caratterizzata da α 4 β 7 + espressione delle integrine e risposte immunitarie protettive mediate contro mucosa sfida virale 9. Imaging intero animale di cellule CD8 + T bioluminescenti è stato recentemente utilizzato da Hailemicheal et al., Che ha dimostrato che l'antigene tumorale peptide formulato in adiuvante incompleto di Freund (IFA, olio-in-acqua emulsione) provocato sequestro di cellule T nel sito dell'iniezionecon vaccino "deposito" lontano dalle masse tumorali, con conseguente disfunzione delle cellule T e la cancellazione di 40.
Tetramero di colorazione è stato ampiamente utilizzato in passato per quantificare il livello di risposte CTL endogeni derivanti da varie formulazioni di vaccino 21. Questa tecnica è anche rilevante e comunemente utilizzato negli studi primi umani immunoterapia del cancro cliniche per confermare le risposte CTL a specifici antigeni associati al tumore 41,42. PBMC possono essere facilmente raccolti da topi e preparati per citometria a flusso; tuttavia, non può misurare l'entità di espansione delle cellule T a causa di localizzazione cellulare ai vaccini depot formanti come menzionato prima o all'interno del tumore in modelli di cancro, richiedendo così un'analisi più ampia. La compatibilità di questo metodo con citometria a flusso per il calcolo di cellule T antigene-specifiche con i marcatori di memoria (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, e KLRG-1) per distinguere effettrici, memoria centrale, e la memoria ce effettorills tra tetramero + cellule T 43 o tessuti CTL di lunga durata residenti 44,45 (come riassunte in recensioni 46,47). Tuttavia, il test tetramero colorazione prevede solo la valutazione iniziale delle risposte CTL da cellule T antigene-specifiche altamente espansi possono mostrare segni di esaurimento immunitario 48,49. Valutazione funzionale delle risposte CTL può essere effettuata esaminando rilascio di citochine con enzyme linked immunospot (ELISpot) 50 o intracellulare di citochine colorazione 51 dopo ex vivo stimolazione dei linfociti con epitopi minime nonché misurando i livelli intracellulari di perforina e granzima B 52 e extracellulare espressione di CD107a e CD107b su degranulazione 53. Inoltre, la funzione citolitica dei CTL può essere valutata direttamente con dosaggi CTL citotossicità condotti in vitro o in vivo 54-56.
Induzione delle risposte immunitarie umoralidopo la vaccinazione nanoparticella può essere studiato in parallelo con la cellula CD8 + T analisi qui presentata. Titoli anticorpali possono essere analizzati con il metodo tradizionale di enzima-saggio di immunoassorbimento (ELISA) mentre affinità anticorpale e ampiezza di riconoscimento epitopo può essere valutata mediante la modifica del protocollo ELISA con l'uso di agenti caotropici (ad esempio, urea) durante legame dell'anticorpo alla substrato e l'uso di sottodomini all'interno antigeni come substrati, rispettivamente 7. Elicitation delle risposte umorali potenti richiede l'espansione di helper follicolare cellule CD4 + T (T FH) 57. Per studiare l'espansione delle cellule T FH in risposta alla vaccinazione delle particelle, il protocollo presentato qui può essere facilmente adattato per l'isolamento delle cellule CD4 + T antigene-specifiche da OT-II topi transgenici, seguita da trasferimento di cellule adottiva in topi riceventi naive. Dopo la vaccinazione, tessuti linfoidi possono essere raccolti e analizzati con analisi di citometria di flusso per scoraggiareespansione miniera di cellule T antigene-specifiche FH (identificato dal loro CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenotipo) 7.
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Disclosures
Perkin Elmer a condizione che il costo di produzione sostenuti durante la pubblicazione di questo articolo.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dal National Institute of Health concedere 1K22AI097291-01 e dal Centro Nazionale per l'avanzamento delle Scienze di traslazione del National Institutes of Health sotto Premio Numero UL1TR000433. Riconosciamo inoltre Prof. Darrell Irvine al MIT e il Prof. Matthias Stephan Fred Hutchinson Cancer Center per il loro contributo al lavoro iniziale sulle nanoparticelle vaccino e OT-I / Luc topi transgenici.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
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