Introduction
Desenvolvimento tradicional vacina tem utilizado, principalmente, a abordagem empírica de tentativa-e-erro. No entanto, com o recente desenvolvimento de uma grande variedade de biomateriais e descoberta de determinantes moleculares de activação imunitária, é agora possível conceber racionalmente formulações de vacinas com pistas biofísicas e bioquímicas derivados de patogénios 1,2. Em particular, várias plataformas de entrega de droga de partículas foram examinados como transportadores de vacinas uma vez que podem ser co-carregadas com antigénios de subunidade e agentes imunoestimulantes, proteger os componentes da vacina contra a degradação, e aumentar a sua co-entrega a células apresentadoras de antigénio (APCs), residente em linfa nodos (LNs), maximizando assim a estimulação e activação imunitária 3-5. Neste relatório, descreve-se a síntese de um sistema de nanopartículas "-imitando agente patogénico", denominados interbilayer reticulado vesículas multilamelares (ICMVs), que tenham sido previamente demonstrado como uma vacina potente Platform para elicitação de robusto de linfócitos T citotóxicos (CTL) e respostas imunitárias humorais em ambos os compartimentos dos tecidos das mucosas e sistémicas 6-9. Em particular, a vacinação com ICMVs alcançado substancialmente melhorada níveis de IgG no soro contra um antigénio da malária, em comparação com a vacinação com adjuvantes convencionais (por exemplo, alúmen e Montanide 7) e também induziu respostas CTL potentes contra células tumorais e modelos de desafio virais em ratinhos 9. Aqui, usando ICMVs como um sistema de nanopartículas vacina modelo, descrevem métodos para caracterização de nano-vacinais formulações, incluindo tamanho de partícula e medições de potencial zeta e monitoramento do tráfico de partículas para linfonodos drenantes (dLNs) utilizando confocal imagem de tecidos criosseccionada 7. Além disso, apresenta-se um método baseado no de imagem inteira em animais de análise de expansão de respostas por CTL em ratinhos após a transferência adoptiva de células específicas para o antigénio T CD8 + que expressam luciferase 9,10. Finalmente, deescriba tetrâmero coloração de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) para quantificação longitudinal de respostas de células T endógenas em ratinhos vacinados com nanopartículas 6,9.
ICMVs são uma formulação de nanopartículas à base de lípidos sintetizados por fusão controlada de lipossomas simples em estruturas multilamelares, que são então estabilizadas quimicamente por grupos de cabeça de fosfolípidos de reticulação funcionalizado com maleimida dentro camadas lipídicas com ditiol reticuladores 6. Uma vez ICMVs são sintetizados, uma pequena fracção de nanopartículas podem ser usadas para determinar o tamanho de partícula e potencial zeta (isto é, carga de superfície das partículas), com um sistema de dispersão de luz dinâmica (DLS), e um analisador de potencial zeta. DLS medidas de mudanças na dispersão de luz em suspensões de partículas, permitindo a determinação do coeficiente de difusão e o tamanho hidrodinâmico de partículas 11. Atingir o tamanho de partícula consistente de lote para lote é crítica sínteseuma vez que o tamanho de partícula é um dos principais factores que influenciam a drenagem linfática das partículas de vacinas para dLNs e subsequente absorção celular por APCs 12,13. Além disso, o potencial zeta pode ser obtido por medição da velocidade das partículas, quando uma corrente eléctrica é aplicada, o que permite a determinação da mobilidade electroforética das partículas e superfície das partículas de carga 11. Assegurar valores de potencial zeta consistentes de partículas é importante uma vez que a carga superficial das partículas determina a estabilidade coloidal, o que tem um impacto directo sobre a dispersão das partículas durante o armazenamento e após a administração in vivo 14,15. A fim de controlar a localização das partículas para dLNs, ICMVs pode ser marcado com fluoróforos desejados, incluindo corantes lipofílicos e antigénios covalentemente marcados. A seguir à imunização, os ratos podem ser sacrificados em vários pontos temporais, dLNs ressecado, criosseccionada, e analisados com microscopia confocal. Esta técnica permite a visualização de drai linfáticoNing de ambos os veículos de vacina para antigénio de nanopartículas e dLNs. As secções de tecido podem ser adicionalmente coradas com anticorpos marcado por fluorescência e utilizada para obter mais informação, tais como tipos de células associadas com o antigénio e a formação de centros germinais como mostrámos anteriormente 7.
Uma vez que a síntese de partículas é optimizada e tráfico para os dLNs é confirmada, é importante para validar elicitação de expansão de CTL in vivo. A fim de analisar a elicitação de células específicas para o antigénio T CD8 + em resposta à vacinação de nanopartículas, nós utilizamos um modelo de antigénio, ovalbumina (OVA), 257-264 péptido com OVA (SIINFEKL) epítopo imunodominante de células T CD8 +, o que permite que as análises imunológicas detalhados de respostas de células T específicas para o antigénio para o desenvolvimento de vacinas inicial 16,17. Em particular, para interrogar a dinâmica de expansão e migração de células específicas para o antigénio T CD8 +, que geraram ummodelo de ratinho transgénico duplo da luciferase do pirilampo por cruzamento de ratinhos transgénicos que expressam (Luc) com OT-I ratinhos transgénicos que possuem células T CD8 + com o receptor de células T (TCR) específico para SIINFEKL (em associação com H-2K b). A partir destes ratinhos OT-I / Luc, que expressam luciferase, as células AT-I T CD8 + pode ser isolado e preparado para transferência adoptiva para naive C57BL / 6. Uma vez semeadas, a imunização bem sucedida com nanopartículas contendo OVA resultará na expansão das células T transferidas, que podem ser controladas através da monitorização do sinal de bioluminescência com um sistema de imagem de animais 9,10 todo. Esta técnica de imagem não invasiva de corpo inteiro foi usado com outros antigénios virais ou tumorais no passado 18-20, processos envolvidos na expansão das células T em tecidos linfóides e difusão para os tecidos periféricos de um modo longitudinal revelando.
Complementar para análise de adoptivamente células específicas de antigénio transferidos T CD8 +, endógenoas respostas das células T após vacinação nos pode ser examinado com o complexo de péptido-histocompatibilidade principal (MHC) de ensaio de tetrâmero 21, em que um complexo péptido-MHC de tetrâmero, que consiste de quatro marcado com fluoróforo do MHC de classe I de moléculas carregadas com epítopos de péptidos, é empregue TCR se ligar e marcar as células T CD8 + de um modo específico do antigénio. O ensaio de tetrâmero de péptido-MHC pode ser realizada tanto em estudos de necropsia terminais para identificar as células T CD8 + específicas para o antigénio em linfóides e tecidos periféricos ou em estudos longitudinais com células mononucleares do sangue periférico (PBMC) obtidas a partir de sangue em série chama. Após a coloração de linfócitos com péptido-MHC de tetrâmero, análise de citometria de fluxo é realizada por análises detalhadas sobre o fenótipo dos CTL ou quantificação da sua frequência entre as células T CD8 +.
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Protocol
Todas as experiências descritas neste protocolo foi aprovado pelo Comitê Universidade de uso e cuidados dos Animais (UCUCA) na Universidade de Michigan e realizado de acordo com as políticas e diretrizes estabelecidas.
1. Síntese e Caracterização de ICMVs Co-carregado com proteína Antígeno e Adjuvante Moléculas
- Mistura 1: 1 de razão molar de 1,2-dioleoyl- sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoyl--sn-glicero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butiramida] (MPB) em clorofórmio, mantendo-se a quantidade total de lípidos em 1,26 umol por lote (isto é, 500 jig de DOPC e 630 ug de MPB) em um frasco de vidro de 20 ml (diâmetro = 28 mm e altura = 61 mm).
- Adicionar fármacos lipofílicos, tais como monofosforil lípido A (MPLA) ou corantes lipofílicos (por exemplo, fez), para a solução de lípido na concentração desejada. Cuidadosamente remover o solvente orgânico por purga com nitroge extra-secon gás e colocando as amostras sob vácuo O / N.
- Hidratar a película de lípidos pela adição de 200 ul de 10 mM de bis-Tris propano (BTP, pH 7,0) contendo fármacos solúveis em água (por exemplo, antigénios de proteína). Vortex durante 10 segundos cada 10 minutos durante 1 h à TA.
- Transferir o conteúdo do frasco de vidro para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as amostras lugar num banho de gelo-água, e sonicar continuamente durante 5 min, utilizando a intensidade de 40% em uma configuração de 125 W / 20 kHz sonda de sonicador de ponta.
- Adicionar 4 mL de 150 mM de ditiotreitol (DTT) para cada lote (concentração de trabalho de 2,4 mM), vortex, e centrifuga-se brevemente utilizando um tampo de microcentrífuga.
- Adicionar 40 ul de 200 mM CaCl 2 e misturar-se com a pipeta (concentração de trabalho de 33 mM). Incubar as amostras a 37 ° C durante 1 hora para permitir a reticulação da MPB contendo camadas lipídicas com DTT.
- Centrifugar as amostras a 20.000 xg durante 15 min, remover o sobrenadante e ressuspender em 200 ul de ddiH 2 O.
- Repetir o passo de 1,7 e centrifuga-se novamente após a segunda ddiH 2 O lavagem para remover de CaCl2, que não reagiu, DTT, não encapsulados e materiais de carga a partir do sobrenadante.
- Prepare a 10 mg / ml de 2 kDa polietileno glicol-tiol (PEG-SH) em ddiH 2 O. Ressuspender cada amostra ICMV em 100 ul de solução de PEG-SH e incubar a 37 ° C durante 30 min.
- Execute duas ddiH 2 O lavagens (passo 1.7) e ressuspender o sedimento ICMV final em PBS e armazenar a 4 ° C. Antes de usar, misturar a suspensão ICMV, como partículas podem assentar no fundo após um armazenamento prolongado.
- Para a caracterização de partículas, remover uma pequena alíquota (~ 10%) de ICMVs de cada lote individualmente e diluir num volume total de 1 ml de ddiH 2 O. Colocar uma única amostra num Zetasizer tamanho celular e medida da partícula, o índice de polidispersidade, e potencial zeta das amostras usando um sistema de medição de DLS e potencial zeta (de acordo com o protocolo do fabricante).
2. O exame do Linfonodo Drenagem de ICMVs Fluorescência-marcado com microscopia confocal
- Preparação de ICMVs carregado com antigénio marcado com fluoróforo e corante fluorescente lipof ílico
- Prepare a proteína marcada com fluororo, tal como ovalbumina feito reagir com éster de Alexa Fluor 555-succinimidilo, de acordo com as instruções do fabricante.
- Para preparar ICMVs marcados com fluoróforo no invólucro lipídico, adicionar corante fluorescente lipof ílico, (por exemplo, 1,1'-dioctadecil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) durante a preparação da película de lípido (Passo 1.2) na quantidade de 0,05% molar de lípido. Para a hidratação do lípido filme (Passo 1,3), tampão de utilização contendo o antigénio marcado com fluoróforo, e a síntese completa ICMV como descrito nas etapas 1,4-1,11.
- A administração subcutânea de nanoparticulas na base da cauda
- Anestesiar rato usando um vaporizador fluxo controlado equipado com uma câmara de indução utilizing 3% de isoflurano e 1,5 L / min de fluxo de oxigênio de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Uma vez que o mouse estiver inconsciente, execute os seguintes passos rapidamente antes da anestesia desgastar fora para permitir o acesso ideal para o local da injeção e minimizar o desconforto para o animal. Como alternativa, use um bom encaixe cone do nariz para manter a anestesia. Se os ratos são anestesiados por mais de 5 minutos, aplicar lubrificante ocular necessário para minimizar a irritação após o procedimento.
- Pulveriza-se a base da cauda com etanol a 70% para higienizar e molhar a pele Parte o cabelo molhado para expor um pequeno pedaço de pele visível, que pode ser usado para visualizar a agulha sob a pele.
- Prepare a suspensão de injecção de partículas, contendo a quantidade desejada de antigénio e adjuvante por 100 ul de dose de vacinação em PBS (por exemplo, 10 ug de OVA e 0,3 ug MPLA por 100 ul de dose injectada foi usado no passado 6,9).
- Desenhe a suspensão de partículas intOA seringa com uma agulha de 27-29 G e inserir a agulha na base da cauda (~ 5 mm da linha fina) com o chanfro voltado para cima e injectar 50 ul da suspensão de partículas 22.
- Aguarde alguns segundos para que a pressão para igualar para evitar back-fluxo excessivo e retire a agulha. Repetir a injecção do outro lado da base da cauda, para atingir ambos os linfonodos de drenagem inguinais.
- Preparação de criosecções nódulos linfáticos e análise com microscopia confocal.
- Eutanásia o rato com asfixia com CO 2, seguida por pneumotórax produzido de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Extrair LNs inguinais acordo com o protocolo demonstrada em Bedoya 23 e lavar o sangue, colocando os tecidos em 1 mL de PBS a 4 ° C.
- Absorve o PBS a partir dos tecidos com os tecidos e colocar o tecido no cryomolds tecido (10 x 10 x 5 mm3) pré-cheia para o topo com meio de congelação 24 de outubro. Snap congelar a tissue bloco em nitrogênio líquido por 30 s. Alternativamente, coloque bloco de tecido em gelo seco durante 30 minutos. Armazenar tecido congelado em freezer -80 ° C.
- Os cortes de tecido de 5-10 mm de espessura num crióstato fixada em -20 ° C 24.
- Se necessário, execute rotulagem de imunofluorescência, e examinar o tecido com microscopia confocal como demonstrado anteriormente 24.
3. Monitoração de Expansão de antígeno específico da, luciferase expressando células T CD8 + após Nanoparticle vacinação com Whole animal de imagem
- Isolamento de OVA 257-264 -específica, células que expressam luciferase T CD8 + a partir de ratinhos transgénicos OT-I / Luc
- Euthanize um rato transgénico OT-I / Luc com asfixia com CO2 e induzir um pneumotórax de acordo com um protocolo aprovado do IACUC animal. Colher o baço de forma estéril através do acesso a cavidade peritoneal e separar cuidadosamente o tecido do pâncreas 23, elugar em 5 ml de PBS a 4 ° C + 2% FBS para a transferência de capuz de cultura de tecidos.
- Inserir o baço sobre um filtro de nylon de 70? M ao longo de um tubo de centrífuga cónico de 50 ml (até 3 baços de cada vez). Utilizando um êmbolo de uma seringa de 3 ml, moer as células através do filtro.
- Lavar o êmbolo e o filtro com PBS + 2% FBS e descartar. Levar o volume total a 10 ml / baço no tubo de 50 ml, levar uma pequena amostra da suspensão de células para contagem com um hemocitómetro, e centrifuga-se durante 10 min a 300 x g.
- Utilizando um kit de selecção negativa magnética comercialmente disponível, isolar a população de células T CD8 +, seguindo as instruções do fabricante.
- Depois de lavar as células com PBS, contar o número de células T CD8 + isoladas. Para avaliar a pureza das células T CD8 + isoladas, incubar ~ 20.000-30.000 células em 20 ul de rato CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) durante 10 min, em seguida, adicionar 20 ul de anticorpo αCD8-APC (0,005 mg / ml) e incubar durante 30 min. Perform todas as incubações a 4 ° C em PBS + 1% w / v BSA. Realizar análise de citometria de fluxo 25.
- A transferência adoptiva de células T CD8 + isoladas e visualização da sua vacinação pós expansão
- Realizar a transferência adoptiva de células isolado OT-I / Luc T CD8 + em naïve C57BL / 6 ratos por administração de 1-10 x 10 5 células em um volume de 200 ul de PBS por via de injecção intravenosa na veia da cauda 22 (dia -1). Considerando que as manchas da pele e da pele preta em camundongos C57BL / 6 podem interferir com o sinal bioluminescente, albinos raspada camundongos C57BL / 6 são ideais para esses estudos.
- Depois de um dia (dia 0), administrar a vacina como previamente descrito (secção 2.2).
- Administrar 150 mg de luciferina por kg de peso corporal do ratinho por via intraperitoneal num volume de 300 ul de PBS. Após 10 min, anestesiar os ratos com isoflurano (como no passo 2.2.1) e visualizar as células AT-I / Luc T CD8 + através da aquisição do sinal de bioluminescência durante 5-10 min wom um sistema de imagem animal inteiro (IVIS; referem-se a Wilson 26 para instruções detalhadas). Repita conforme necessário para os estudos longitudinais.
As células T CD8 + 4. péptido-MHC Tetrâmero Coloração de PBMC para análise do antigénio específico da-
Nota: O procedimento seguinte protocolo pode ser realizada utilizando tanto ratinhos C57BL / 6 com células transferidas adoptivamente OT-I / Luc T CD8 + ou ratinhos C57BL / 6, sem a transferência adoptiva.
- Num ponto de tempo desejado após a vacinação, recolher aproximadamente 100 mL de sangue (4-6 gotas) a partir de ratinhos por sangramento submandibular técnica 27 dentro de um tubo revestido com K2EDTA e gire várias vezes para evitar a coagulação.
- Transferir 100 uL de sangue para um tubo de microcentrífuga, adicionar 1 ml de tampão de lise, e incubar durante 2 a 3 minutos, a fim de remover as células vermelhas do sangue (RBC). Centrifugar as amostras durante 5 min a 1500 x g e eliminar o sobrenadante. Se o sedimento ainda umppears vermelho (indicando remoção incompleta de hemácias), repita o passo de lise com uma breve incubação (<1 min) de lise.
- Lavam-se as PBMC restantes com 1 ml de tampão de FACS (PBS + 1% p / v de BSA) e centrifugar a 1500 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender a amostra em 20 ul de rato CD16 / 32 anticorpo (0,025 mg / ml) para bloquear o anticorpo não específico e FcR-mediada de ligação. Incubar durante 10 min à TA.
- Células transferir de microtubos em 4 ml tubos de FACS de fundo redondo. Adicionar 20 ul de H-2K b solução de OVA SIINFEKL Tetrâmero-PE de acordo com as especificações do fabricante para cada amostra e incubar durante 30 min em gelo.
- Preparar a mistura de anticorpos (por exemplo, αCD8-APC, αCD44-FITC, e αCD62L-PECy7 anticorpos (0,005, 0,005, e 0,002 mg / ml de concentração, respectivamente)). Adicionar 20 ul de cada amostra experimental, e incubar durante 20 min em gelo. Preparar controlos fluoróforo individuais por labeling células com cada tetrâmero marcado com fluoróforo ou o anticorpo na concentração indicada acima.
- Lavar duas vezes com tampão FACS e ressuspender o sedimento final em tampão FACS contendo 2 mg / ml de DAPI. As células são agora pronto para a análise de citometria de fluxo (detalhes e exemplos podem ser encontrados em Scheffold 25).
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Representative Results
Os passos envolvidos na síntese de ICMVs estão ilustrados na Figura 1 6. Resumidamente, uma película de lípido contendo quaisquer fármacos lipofílicos ou corantes fluorescentes é hidratado na presença de drogas hidrofílicas. Os catiões divalentes, tais como Ca 2+, são adicionados à unidade de fusão de lipossomas aniónicos em vesículas multilamelares. Ditiol agente de reticulação, tal como DTT, é adicionado a "staple" lípidos funcionalizado com maleimida na apposing camadas lipídicas, e finalmente restantes grupos maleimida externos são temperada numa reacção com porções de PEG-tiolados. Uma pequena fração de cada lote pode ser prontamente submetido a medidas de controlo de qualidade por meio da determinação de tamanho de partícula, índice de polidispersão, e potencial zeta com um DLS e zeta sistema de análise de potencial. As partículas resultantes são relativamente homogéneos com um tamanho médio de 130 ± 20 nm, de índice de polidispersão de 0,22 ± 0,02, e o potencial zeta de -54 ± 3 mV para encapsular OVA-partigos (Figura 1B e 1C). O rendimento típico de partículas, medida em peso seco de partículas, é de ~ 50% 6.
Usando o protocolo acima descrito, ICMVs pode ser co-carregado com antigénio de proteínas marcadas com fluoróforo e corante lipofílico fluorescente, permitindo a visualização de entrega de antigénio e de nanopartículas in vivo. Para comparar os padrões de prestação de antígeno na forma solúvel em contra ICMVs, camundongos C57BL / 6 foram administrados sc na base da cauda com 100 ug de AlexaFluor555 marcada com OVA ou em linfonodos inguinais solúveis ou fez-rotulados formulações ICMV e drenagem foram excisadas em vários pontos de tempo para preparação de DLN tecido crio seções. A visualização por microscopia confocal indicaram que o antigénio solúvel rapidamente atingido os dLNs dentro de 4 horas, mas também foi muito rapidamente eliminado com 24 horas (Figura 2) 7. Em contraste, ICMVs carregado-OVA foram detectadas na periferia de dLNs por 24 h, com acumulação continuadacomo examinado no dia 4, a deposição de um grande quantidade de OVA-ICMVs em dLNs (Figura 2). Micrografia confocal mostrou também co-localização de AlexaFluor555 marcada com OVA e ICMVs dentro dLNs fez-rotulado, sugerindo que ICMVs permitir co-delivery estável de antígenos de proteína e outros agentes imunoestimulantes encapsulados dentro ICMVs 7.
Isolamento de células T CD8 + a partir de AT-I / Luc ratinho transgénico pode ser facilmente realizado com o kit de selecção negativa magnética comercialmente disponível, produzindo 8-12 x 10 ~ 6 células por um baço de ratinho. A figura 3 mostra ratinhos C57BL / 6 adoptivamente transferidos com 5 x 10 5 OT-I / Luc células T CD8 + no dia -1, e imunizados no dia 0 com a administração subcutânea de 10 ug de OVA e 0,3 ug de MPLA, quer em formulações solúveis ou ICMV. A bioluminescência imagiologia IVIS com realizada no dia 0 antes da vacinação mostrou sinal mínimo OT-I / Luc. No entanto, no dia 4 após a vacinação, os ratos imunizadoscom OVA / MPLA-ICMVs tinha sinal de bioluminescência robusta dentro de linfonodos inguinais, que são linfonodos que drenam a região da base da cauda 28. Em contraste, os ratinhos imunizados com a forma solúvel da vacina mostrou muito reduzida expansão de células AT-I / Luc T CD8 + dentro dLNs inguinais.
Usando OVA como um antigénio modelo permite a monitorização de expansão de células endógenas T CD8 + específicas para o péptido 257-264 imunodominante OVA (SIINFEKL). Por exemplo, ratinhos C57BL / 6 foram imunizados nos dias 0, 21, e 35 com a administração subcutânea de 10 ug de OVA e 0,3 ug MPLA em qualquer ICMVs ou forma solúvel, e frequências de células T CD8 + SIINFEKL específicos de entre as células T CD8 + em PBMC foram determinadas por análise citométrica de fluxo de PBMCs coradas com SIINFEKL-H-2K b tetrâmero-PE. A Figura 4A mostra o fluxo representativo citometria de diagramas de dispersão de SIINFEKL-H-2K b tetrâmero + células entre as células T CD8 + em PBMC no dia 41 6. Figure 4B mostra gráficos representativos de dispersão de células CD62L + CD44 + com fenótipo de memória central entre as células T CD8 + SIINFEKL-tetrâmero +. Avaliação semanal de PBMC mostrados na Figura 4C indicaram que a vacina OVA solúvel induziu a expansão mínima de células específicas para o antigénio T CD8 +, enquanto que a vacinação ICMV provocou significativamente as respostas de células T CD8 + fortes, conseguindo um células T pico 28% SIINFEKL-tetrâmero + na CD8 + população de células T por 41 dia 6. Usando o protocolo de coloração tetrâmero aqui apresentado, observou-se a frequência de 0,11% ± 0,04% fundo células T específicas de OVA (N = 15) em animais não tratados ou tratados com PBS, e que pode detectar aumento estatisticamente significativo na frequência de células T CD8 + específicas de antigénio tão baixas quanto 0,46% ± 0,05% (valor de p <0,005, dados não mostrados).
Figura 2. Análise do antigénio para os gânglios linfáticos de drenagem com microscopia confocal. Ratinhos C57BL / 6 foram imunizados com 100 ug MPLA fluororo conjugado com OVA (mostrado a vermelho) e 5 ug em solução ou ICMVs (mostrados a azul). Drenagem gânglios linfáticos inguinais foram excisadas em pontos de tempo indicados, criosseccionada, e fotografada com microscopia confocal. Micrografias confocal representativos são mostrados. Sinais de rosa indicam co-localização de OVA e ICMVs. Este valor foi modificado a partir Moon et al. 7. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3. Monitorina expansão das células T após vacinação g. C57BL / 6 ratos albinos foram transferidos adoptivamente IV com 5 x 10 5 células Luc + OT I-T CD8 + no dia -1. No dia 0, os animais foram administrados com 10 ug de OVA e 0,1 ug de MPLA, quer como formulações solúveis ou ICMV. Os animais foram anestesiados com isoflurano e administrado com luciferina (150 mg / kg, 300 l ip injetado), e sinal de bioluminescência a partir de células Luc + OT-1 T CD8 + foi adquirido com IVIS. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 4. Expansão de células específicas de OVA endógenos T CD8 + após a vacinação ICMV. Ratinhos C57BL / 6 foram imunizados com 10 ug de OVA e 0,1 ug de MPLA ou isolução de n ou ICMVs nos dias 0, 21 e 35 (setas). Frequência de células T específicas de OVA entre as células mononucleares de sangue periférico foi avaliado ao longo do tempo por meio de análise de citometria de fluxo de SIINFEKL-MHC-I tetrâmero + células T CD8 +. (A) Representante fluxo citometria de gráficos de dispersão de ratos indivíduo no dia 41 mostra SIINFEKL-MHC-I tetrâmero + células T CD8 + e (B) células CD62L + CD44 +, marcador de células T de memória central. (C), a cinética total de expansão de células T e a contracção é mostrado. Este valor foi modificado a partir Moon et al. 6. Por favor clique aqui para ver uma versão ampliada da figura.
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Discussion
O protocolo fornecido neste artigo descreve a síntese e caracterização de um novo sistema de nanopartículas à base de lípidos, denominado ICMVs, e fornece o processo de validação da eficácia de formulações de vacinas à base de nanopartículas para induzir respostas de CD8 +, células T específicas de antigénio. ICMV síntese é completada em todas as condições aquosa, o que é uma grande vantagem em comparação com outros sistemas habitualmente utilizados nanopartículas poliméricas (por exemplo, poli (lactido-co-glicolido) partículas de ácido), os quais tipicamente requerem solventes orgânicos para a preparação, muitas vezes resultando em perda de antigenicidade em proteínas antígenos 29,30. Além disso, ICMVs benefício de grande estabilidade e capacidade de encapsular moléculas tanto hidrofóbicos e hidrofílicos 6, permitindo assim a co-produção de antigénios e adjuvantes orientadas para o mesmo compartimento intracelular dentro APCs 31,32. Usando ICMVs como uma nanopartícula vacina modelo, aqui nós descrevemos os procedimentospara (1) síntese de nanopartículas e caracterização, (2) de validação de nanopartículas de drenagem para dLNs, e exame de elicitação de CD8 + respostas de células T específicas de antigénio usando (3) uma técnica de imagiologia de bioluminescência não-invasivo e (4) o péptido-MHC ensaio de coloração tetrâmero em PBMC.
É crítico para assegurar uniformidade na síntese de nanopartículas de lote para lote, em especial para o tamanho de partícula e carga de superfície uma vez que podem afectar grandemente drenagem linfática e absorção pelas APCs da administração in vivo. DLS e análise de potencial zeta fornecer métodos rápidos de verificação de qualidade no tamanho de partícula e carga de superfície. Para análises mais detalhadas sobre a morfologia das partículas individuais, estas técnicas podem ser complementadas com microscopia eletrônica de alta resolução, tais como microscopia crio-eletrônica (Cryo-EM) que preserva a morfologia das partículas "soft" na camada aquosa vitrificados 6,33,34 . Eficiência de encapsulação de antigénios e adjuvformigas também deve ser determinado e mantidos uniforme entre sínteses. Os adjuvantes, tais como MPLA, pode ser marcado com um fluoróforo 6 enquanto que antigenes de proteínas pode ser quantificada utilizando kits de quantificação de proteína absorbance- e baseados em fluorescência, ou analisada utilizando SDS-PAGE a 35 e de Coomassie ou prata coloração 36, e quantificada com base na intensidade da banda . Inconsistências na preparação de partículas pode resultar de reagentes expirados ou mal armazenados, como a reactividade óptima é necessário para a síntese completa. Para este fim, maleimide- tiol e reagentes funcionalizados devem ser mantidos em pequenas alíquotas a -80 ° C sem os ciclos de congelação-descongelação frequentes.
Partículas menores do que 100 nm são geralmente pensados para entrar efetivamente os vasos linfáticos e tráfego para dLNs 13, enquanto que as partículas maiores (500-2.000 nm) exigem transporte ativo por DCs tecido residente 12,37. Nas nossas mãos, ICMVs com o tamanho hidrodinâmico variando 150-250 nm eficiência localizada e persistiu na DLN, resultando em extensa CTL e respostas humoral 6,7. Dentro de 24 horas da administração, ICMVs foram associados com macrófagos subcapsular sinus em dLNs, e as análises de citometria de fluxo realizada nos dias 1 e 4 indicam que a maioria dos ICMVs dentro dLNs foram tomados por APCs residentes LN com apenas uma pequena porção de partículas associadas com Langerhans e DCs dérmicos 7. Estes resultados indicaram que o transporte passivo é o principal modo de tráfico ICMV para dLNs. Estes estudos têm utilizado nanopartículas marcado com fluoróforo e antígenos proteicos para delinear seus padrões de localização e distribuição em dLNs. A microscopia confocal de dLNs criosseccionada histoquímica permite imunofluorescência adicional para identificação de estruturas LN (por exemplo, GL-7 expressão nos centros germinativos) e células que interagem com os componentes da formulação (por exemplo, as DCs - CD11c, macrófagos - F4 / 80, CD169, e B- células & #8211; B220) 7,9. Esta técnica pode ser realizada em paralelo com as análises de citometria de fluxo de células colhidas a partir de dLNs para delinear os subconjuntos de APCs responsáveis pela absorção de partícula 7,9 ou com imagiologia de todo o animal para quantificar a distribuição da vacina no local da injecção a partir de dLNs 38,39, desde que os sinais fluorescentes são fortes e autofluorescência tecido não interfere com os sinais.
A imunização eficaz requer a activação robusto e expansão de células T citotóxicas específicas para o antigénio, que podem ser rastreados por bioluminescência de imagem de corpo inteiro após a transferência adoptiva de bioluminescente, células T específicas de antigénio transgénicos, seguido por vacinação. A vantagem deste método é o potencial para a visualização repetida de tráfico de CTL nos mesmos animais durante um período prolongado, reduzindo, assim, o número de animais necessários para análises imunológicas e evitando o uso de procedur laborioso isolamento de célulases. Usando esta técnica de imagiologia, demonstramos recentemente que a administração pulmonar de ICMVs co-carregado com antigénio proteico e um agente imunoestimulador levou a potente elicitação de células específicas para o antigénio T CD8 + no pulmão e LNs mediastino e a subsequente disseminação de CTLs para os tecidos das mucosas distais , incluindo as placas de Peyer, ceco e do trato vaginal 9. As análises de citometria de fluxo mostrou que estas células T CD8 + recentemente expandidos foram impressas com um fenótipo "mucoso-homing" caracterizado por α 4 β 7 + expressão integrina e respostas imunitárias protectoras contra a mucosa mediadas desafio viral 9. A imagiologia de todo o dos animais de células T CD8 + bioluminescentes também foi recentemente utilizado por Hailemicheal et ai., Que demonstram que o péptido antigénio tumoral formulada em adjuvante de Freund incompleto (IFA, emulsão de óleo-em-água) resulta no sequestro de células T no local da injecçãocom a vacina "depot" longe das massas tumorais, levando à disfunção de células T e eliminação 40.
Coloração tetrâmero tem sido amplamente utilizado no passado para quantificar o nível de respostas de CTL endógenos resultantes de várias formulações de vacina de 21. Esta técnica também é relevante e vulgarmente utilizada em ensaios clínicos de imunoterapia de cancro humano iniciais para confirmar as respostas de CTL contra antigénios associados a tumores específicos 41,42. PBMC podem ser facilmente recolhidos a partir de ratinhos e preparada para citometria de fluxo; no entanto, pode não revelar a extensão completa da expansão de células T, devido à localização da célula para vacinas que formam depot, como mencionado antes ou dentro dos tumores em modelos de cancro, exigindo, assim, uma análise mais extensa. Compatibilidade com este método de citometria de fluxo permite a determinação de células T específicas do antigénio com marcadores de memória (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, e KLRG-1) para distinguir efectora, a memória central, e efectora ce memórialls entre os tetrâmero + T células 43 ou tecido CTLs residentes de longa duração (44,45 resumidas na comentários recentes 46,47). No entanto, o ensaio de coloração tetrâmero prevê apenas a avaliação inicial das respostas CTL vez que as células específicas do antigénio altamente expandidos T podem apresentar sinais de esgotamento imunológico 48,49. A avaliação funcional de respostas de CTL pode ser realizada através da análise de libertação de citoquinas com enzima ligada immunospot (ELISpot) 50 ou citocina coloração intracelular após 51 ex vivo estimulação de linfócitos com epitopos mínimos, bem como através da medição dos níveis intracelulares de perforina e granzima B 52 e extracelular expressão de CD107a e CD107b sobre degranulation 53. Além disso, a função citolítica de CTL pode ser avaliada directamente com os ensaios de citotoxicidade de CTL realizados in vitro ou in vivo 54-56.
A indução de respostas imunes humoraisapós a vacinação de nanopartículas podem ser estudados em paralelo com a célula T CD8 + análises apresentadas aqui. Os títulos de anticorpos podem ser analisadas pelo método tradicional de enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), enquanto que a afinidade do anticorpo e da largura de reconhecimento de epítopo pode ser avaliada através da modificação do protocolo de ELISA com a utilização de um agente caotrópico (por exemplo, ureia) durante a ligação do anticorpo ao substrato e o uso de subdomínios dentro de antigénios como substratos, respectivamente 7. Elicitação das respostas humorais potentes requer expansão do ajudante folicular de células T CD4 + (T fh) 57. Para investigar a expansão de células T fh em resposta à vacinação de partícula, o protocolo aqui apresentado pode ser prontamente adaptado para o isolamento de células T CD4 + específicas para o antigénio de ratinhos transgénicos OT-II, seguindo-se a transferência adoptiva de células em ratinhos receptores sem tratamento prévio. Após vacinação, os tecidos linfóides podem ser colhidas e analisadas com citometria de fluxo de análise para dissuadirmina de expansão de células T específicas de antigénio fh (identificados pela sua CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenótipo) 7.
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Disclosures
Perkin Elmer, desde que o custo de produção incorridos durante a publicação deste artigo.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional de Saúde conceder 1K22AI097291-01 e pelo Centro Nacional para a Promoção da Ciência Translational dos Institutos Nacionais de Saúde sob Award Número UL1TR000433. Nós também reconhecemos Prof. Darrell Irvine no MIT e Prof. Matthias Stephan no Fred Hutchinson Cancer Center por sua contribuição no trabalho inicial sobre as nanopartículas de vacinas e camundongos transgênicos OT-I / Luc.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
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