Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Nanoparticle के टीकाकरण के बाद के विश्लेषण से प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए पूरे पशु इमेजिंग और प्रवाह cytometric तकनीकों

Published: April 29, 2015 doi: 10.3791/52771
Automatic Translation
1,2, 1,2,3
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Michigan, 2Biointerfaces Institute, University of Michigan, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan

Introduction

पारंपरिक टीका विकास मुख्य रूप से परीक्षण और त्रुटि के अनुभवजन्य दृष्टिकोण कार्यरत है। हालांकि, biomaterials के और प्रतिरक्षा सक्रियण की आणविक निर्धारकों की खोज की एक विस्तृत सरणी के हाल ही के विकास के साथ, यह तर्क से रोगज़नक़ों 1,2 से निकाली गई जैवभौतिक और जैव रासायनिक संकेतों के साथ टीका योगों डिजाइन करने के लिए अब संभव है। विशेष रूप से, विभिन्न कण दवा वितरण प्लेटफार्मों लिम्फ में रहने गिरावट से टीका घटकों की रक्षा, और कोशिकाओं पेश प्रतिजन के लिए (APCs) उनके सह-डिलीवरी बढ़ाने, वे सबयूनिट एंटीजन और immunostimulatory एजेंटों के साथ सह-लोड किया जा सकता है के रूप में वैक्सीन वाहक के रूप में जांच की गई है नोड्स (LNS), इस प्रकार प्रतिरक्षा उत्तेजना और सक्रियण 3-5 अधिकतम। पहले एक शक्तिशाली वैक्सीन platfor के रूप में प्रदर्शित किया गया है, जो इस रिपोर्ट में, हम एक "रोगज़नक़ नकल उतार" nanoparticle प्रणाली के संश्लेषण का वर्णन करार दिया interbilayer-Crosslinked multilamellar पुटिकाओं (ICMVs),मजबूत साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइट (सीटीएल) और प्रणालीगत और श्लैष्मिक ऊतक डिब्बों 6-9 दोनों में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के निकालना के लिए मी। विशेष रूप से, ICMVs साथ टीकाकरण काफी पारंपरिक adjuvants (जैसे, फिटकिरी और Montanide) 7 के साथ टीकाकरण के साथ तुलना में, एक मलेरिया एंटीजन के खिलाफ सीरम आईजीजी का स्तर बढ़ाया और भी ट्यूमर कोशिकाओं और चूहों 9 में वायरल चुनौती मॉडल के खिलाफ प्रबल सीटीएल प्रतिक्रियाएं हासिल हासिल की। इधर, एक मॉडल टीका nanoparticle प्रणाली के रूप में ICMVs का उपयोग करते हुए, हम कण आकार और जीटा संभावित माप और draining LNS के कण की तस्करी की ट्रैकिंग cryosectioned ऊतकों 7 की confocal इमेजिंग के उपयोग (dLNs) सहित टीका नैनो योगों के लक्षण वर्णन के लिए विधियों का वर्णन है। इसके अलावा, हम luciferase व्यक्त प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं 9,10 के दत्तक हस्तांतरण के बाद चूहों में सीटीएल प्रतिक्रियाओं के विस्तार का विश्लेषण करने की एक पूरी पशु इमेजिंग आधारित पद्धति प्रस्तुत करते हैं। अंत में, हम डेनैनोकणों 6,9 के साथ टीका लगाया चूहों में अंतर्जात टी सेल प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य मात्रा का ठहराव के लिए परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) के मुंशी टेट्रामर धुंधला हो जाना।

ICMVs तो रासायनिक dithiol crosslinkers 6 के साथ लिपिड परतों के भीतर पार से जोड़ने maleimide-क्रियाशील फॉस्फोलिपिड सिर समूहों द्वारा स्थिर हो रहे हैं जो multilamellar संरचनाओं में सरल liposomes के नियंत्रित संलयन द्वारा संश्लेषित एक लिपिड आधारित nanoparticle तैयार कर रहे हैं। ICMVs संश्लेषित कर रहे हैं एक बार, नैनोकणों का एक छोटा सा अंश कण आकार और जीटा संभावित एक गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) प्रणाली और एक जीटा संभावित विश्लेषक के साथ (कणों की यानी, सतह प्रभार) निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रसार गुणांक के दृढ़ संकल्प और कणों 11 के हाइड्रोडायनामिक आकार की अनुमति के कण निलंबन में प्रकाश बिखरने में डीएलएस उपायों में बदलाव,। बैच संश्लेषण के लिए बैच से लगातार कण आकार को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैकण आकार के बाद से APCs 12,13 से dLNs और बाद में सेलुलर तेज करने के लिए वैक्सीन कणों की लसीका निकासी को प्रभावित प्रमुख कारकों में से एक है। इसके अलावा, जीटा संभावित कणों और कण सतह चार्ज 11 की electrophoretic गतिशीलता के निर्धारण की अनुमति देता है जो एक विद्युत प्रवाह लागू किया जाता है जब कण वेग, को मापने के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है। कणों की सतह के प्रभारी भंडारण के दौरान और इन विवो प्रशासन 14,15 के बाद कण फैलाव पर सीधा प्रभाव पड़ता है जो कोलाइडयन स्थिरता, निर्धारित करता है के बाद से कणों के अनुरूप जीटा संभावित मूल्यों सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है। DLNs के कण स्थानीयकरण को ट्रैक करने के लिए, ICMVs lipophilic रंगों और covalently टैग एंटीजन सहित वांछित fluorophores के साथ लेबल किया जा सकता है। टीकाकरण के बाद, चूहों, dLNs resected, विभिन्न समय बिंदुओं पर euthanized cryosectioned, और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया जा सकता है। इस तकनीक को लसीका drai के दृश्य की अनुमति देता हैnanoparticle वैक्सीन वाहक और dLNs को प्रतिजन दोनों की निंग। हम पहले 7 से पता चला है के रूप में ऊतक वर्गों साथ ही इस तरह के प्रतिजन और कीटाणु केन्द्रों के गठन के साथ जुड़े कोशिकाओं के प्रकार के रूप में fluorescently लेबल एंटीबॉडी और अधिक जानकारी प्राप्त करने के लिए उपयोग किया, साथ दाग जा सकता है।

कण संश्लेषण अनुकूलित है और dLNs करने की तस्करी की पुष्टि होती है, यह इन विवो सीटीएल विस्तार से निकालना मान्य करने के लिए महत्वपूर्ण है। Nanoparticle के टीकाकरण के जवाब में विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी कोशिकाओं की निकालना का विश्लेषण करने के लिए, हम विस्तृत प्रतिरक्षात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है जो ओवीए 257-264 पेप्टाइड (SIINFEKL) immunodominant CD8 + टी सेल मिलान, साथ, एक मॉडल के प्रतिजन, ovalbumin (ओवीए) का उपयोग किया है प्रारंभिक टीका विकास 16,17 के लिए विशिष्ट प्रतिजन टी सेल प्रतिक्रिया की। विशेष रूप से, विस्तार और प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं के प्रवास की गतिशीलता को पूछताछ के लिए, हम उत्पन्न किया है एकटी सेल रिसेप्टर (एच -2 k बी के सहयोग से) SIINFEKL के लिए विशिष्ट (TCR) के साथ CD8 + टी कोशिकाओं के अधिकारी OT-मैं ट्रांसजेनिक चूहों के साथ ट्रांसजेनिक चूहों (ल्यूक) luciferase व्यक्त जुगनू पार करके डबल ट्रांसजेनिक माउस मॉडल। इन OT-मैं / ल्यूक चूहों से, luciferase व्यक्त, ओटी-मैं CD8 + टी कोशिकाओं को अलग किया जा सकता है और भोले C57BL / 6 चूहों में दत्तक हस्तांतरण के लिए तैयार किया। वरीयता प्राप्त एक बार, ओवीए युक्त नैनोकणों के साथ सफल प्रतिरक्षण एक पूरी पशु इमेजिंग प्रणाली 9,10 साथ bioluminescence संकेत निगरानी से लगाया जा सकता है जो हस्तांतरित टी कोशिकाओं, के विस्तार में परिणाम होगा। इस गैर इनवेसिव पूरे शरीर इमेजिंग तकनीक के लिए एक अनुदैर्ध्य तरीके से परिधीय ऊतकों को टी सेल ल्य्म्फोइड ऊतकों में विस्तार और प्रसार में शामिल प्रक्रियाओं का खुलासा, पिछले 18-20 में अन्य वायरल या ट्यूमर एंटीजन के साथ इस्तेमाल किया गया है।

Adoptively हस्तांतरित प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं का विश्लेषण करने के लिए पूरक, endogenoहमें टी सेल प्रतिक्रिया में कार्यरत है, टीकाकरण चार फ्लोरोफोरे टैग MHC-वर्ग मैं अणुओं से मिलकर एक पेप्टाइड MHC टेट्रामर जटिल, पेप्टाइड epitopes के साथ भरी हुई जिसमें पेप्टाइड प्रमुख उतक अनुरूपता जटिल (MHC) टेट्रामर परख 21, के साथ जांच की जा सकती पोस्ट एक विशिष्ट प्रतिजन ढंग से TCR और लेबल CD8 + टी कोशिकाओं को बाध्य करने के लिए। पेप्टाइड MHC टेट्रामर परख ल्य्म्फोइड और परिधि के ऊतकों में विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी कोशिकाओं की पहचान करने के लिए टर्मिनल शव-परीक्षा पढ़ाई में या धारावाहिक रक्त ड्रॉ से प्राप्त परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) के साथ अनुदैर्ध्य अध्ययन में या तो किया जा सकता है। पेप्टाइड MHC टेट्रामर साथ लिम्फोसाइटों धुंधला के बाद, प्रवाह cytometry विश्लेषण CD8 + टी कोशिकाओं के बीच उनकी आवृत्ति की CTLs के phenotype या मात्रा का ठहराव पर विस्तृत विश्लेषण के लिए किया जाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों की स्थापना की नीतियों और दिशा निर्देशों के अनुसार उपयोग और मिशिगन विश्वविद्यालय में पशुओं की देखभाल (UCUCA) पर विश्वविद्यालय की समिति ने मंजूरी दे दी है और प्रदर्शन किया गया।

1. संश्लेषण और ICMVs की विशेषता प्रोटीन प्रतिजन और सहयोगी अणुओं के साथ सह-भरी

  1. मिक्स 1: 1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (DOPC) और 1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphoethanolamine- एन 1 की दाढ़ अनुपात - [4- (पी -maleimidophenyl) butyramide] क्लोरोफॉर्म में (MPB), प्रति बैच 1.26 μmol में कुल लिपिड राशि रखते हुए (यानी, DOPC के 500 माइक्रोग्राम और MPB के 630 माइक्रोग्राम) एक 20 मिलीलीटर कांच की शीशी (व्यास = 28 मिमी और ऊंचाई = 61 मिमी) में।
  2. वांछित एकाग्रता में लिपिड समाधान करने के लिए, इस तरह के monophosphoryl लिपिड ए (MPLA) या lipophilic रंगों (उदाहरण के लिए, किया था) के रूप में lipophilic दवाओं, जोड़ें। अच्छी तरह से अतिरिक्त ड्राई nitroge साथ purging द्वारा कार्बनिक विलायक हटा देंएन गैस और वैक्यूम हे / एन के तहत नमूने दे।
  3. पानी में घुलनशील दवाओं (जैसे, प्रोटीन एंटीजन) युक्त 10 मिमी बीआईएस Tris प्रोपेन (BTP, पीएच 7.0) के 200 μl जोड़कर लिपिड फिल्म हाइड्रेट। 10 सेकंड आरटी पर 1 घंटे के लिए हर 10 मिनट के लिए भंवर।
  4. कांच से सामग्री, एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में शीशी प्लेस के नमूने एक बर्फ नहाने के पानी में है, और एक 125 डब्ल्यू / 20 किलोहर्ट्ज़ जांच की नोक sonicator पर स्थापित करने के लिए 40% तीव्रता का उपयोग कर 5 मिनट के लिए लगातार sonicate स्थानांतरण।
  5. प्रत्येक बैच (कार्य एकाग्रता 2.4 मिमी), भंवर, और एक tabletop microcentrifuge का उपयोग करते हुए संक्षेप में सेंट्रीफ्यूज के लिए 150 मिमी dithiothreitol (डीटीटी) के 4 μl जोड़ें।
  6. 200 मिमी 2 CaCl के 40 μl जोड़ें और पिपेट (कार्य एकाग्रता 33 मिमी) के साथ मिश्रण। डीटीटी के साथ लिपिड परतों MPB युक्त के crosslinking अनुमति देने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  7. नमूने अपकेंद्रित्र 15 मिनट के लिए 20,000 XG पर, ddiH 2 ओ के 200 μl में सतह पर तैरनेवाला, और resuspend को दूर
  8. दोहराएँ कदम 1.7 और अपकेंद्रित्र फिर दूसरा ddiH 2 हे धोने के बाद सतह पर तैरनेवाला से 2 CaCl, unreacted डीटीटी, और unencapsulated कार्गो सामग्री हटाने के लिए।
  9. DdiH 2 ओ में 2 केडीए पॉलीथीन ग्लाइकोल-thiol (खूंटी-एसएच) के 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर की तैयारी खूंटी एसएच समाधान के 100 μl में प्रत्येक ICMV नमूना Resuspend और 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  10. दो ddiH 2 हे washes (कदम 1.7) प्रदर्शन और 4 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम ICMV पीबीएस में गोली और दुकान resuspend। कणों लंबे समय तक भंडारण के बाद नीचे के लिए व्यवस्थित कर सकते हैं के रूप में पहले, ICMV निलंबन का मिश्रण, उपयोग करने के लिए।
  11. कणों के लक्षण वर्णन के लिए, प्रत्येक बैच से ICMVs के एक छोटे से विभाज्य (~ 10%) को हटाने और ddiH 2 ओ के 1 मिलीलीटर की कुल मात्रा में व्यक्तिगत रूप से पतला एक Zetasizer सेल और उपाय कण आकार, polydispersity सूचकांक, और एक डीएलएस और (निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार) जीटा संभावित माप प्रणाली का उपयोग करते हुए नमूनों की जीटा संभावित में एक भी नमूना रखें।

के लिम्फ नोड draining के 2. परीक्षा confocal माइक्रोस्कोपी के साथ ICMVs प्रतिदीप्ति टैग

  1. ICMVs की तैयारी फ्लोरोफोरे टैग प्रतिजन और lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक के साथ भरी हुई
    1. निर्माता के अनुदेश के अनुसार, ovalbumin एलेक्सा Fluor 555-succinimidyl एस्टर के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त जैसे फ्लोरोफोरे टैग प्रोटीन, तैयार करें।
    2. लिपिड खोल में फ्लोरोफोरे के साथ टैग ICMVs तैयार करते हैं, lipophilic फ्लोरोसेंट रंजक, (उदाहरण के लिए, 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3, '3'-Tetramethylindodicarbocyanine, () किया था) (लिपिड फिल्म की तैयारी के दौरान चरण जोड़ें 1.2) 0.05% दाढ़ लिपिड राशि में। लिपिड फिल्म जलयोजन (1.3 चरण), फ्लोरोफोरे टैग प्रतिजन युक्त उपयोग बफर, और पूरा ICMV संश्लेषण के लिए कदम 1.4-1.11 में बताया गया है।
  2. पूंछ के आधार पर नैनोकणों के चमड़े के नीचे प्रशासन
    1. एक प्रेरण कक्ष यू के साथ सुसज्जित एक नियंत्रित प्रवाह vaporizer का उपयोग माउस anesthetizeएक IACUC के अनुसार 3% isoflurane और ऑक्सीजन का प्रवाह के 1.5 एल / मिनट tilizing पशु प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी। माउस बेहोश हो जाने पर, इंजेक्शन की साइट के लिए इष्टतम उपयोग की अनुमति देने और जानवर के लिए परेशानी को कम करने के लिए बंद पहने संज्ञाहरण करने के लिए जल्दी से पहले निम्न चरणों का प्रदर्शन करते हैं। वैकल्पिक रूप से, संज्ञाहरण बनाए रखने के लिए एक उचित फिटिंग नाक शंकु का उपयोग करें। चूहों से अधिक समय 5 मिनट के लिए anesthetized हैं, तो प्रक्रिया के बाद जलन को कम करने के लिए आवश्यक आंख चिकनाई लागू होते हैं।
    2. साफ करता है और त्वचा के नीचे सुई कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो दिखाई त्वचा, के एक छोटे पैच का पर्दाफाश करने के लिए फर भाग गीले बालों को गीला करने के लिए 70% इथेनॉल के साथ पूंछ के आधार स्प्रे।
    3. वांछित प्रतिजन की राशि और पीबीएस में टीकाकरण खुराक के 100 μl प्रति सहायक युक्त कण इंजेक्शन निलंबन की तैयारी (उदाहरण के लिए, 10 माइक्रोग्राम ओवीए और इंजेक्शन खुराक के 100 μl प्रति 0.3 माइक्रोग्राम MPLA पिछले 6,9 में इस्तेमाल किया गया है)।
    4. कण निलंबन int के ड्राOA एक 27-29 जी सुई के साथ सिरिंज और पूंछ के आधार पर सुई डालने (~ सिर के मध्य से 5 मिमी) उठाव के साथ सामना करना पड़ रहा है और कण निलंबन 22 के 50 μl इंजेक्षन।
    5. अत्यधिक वापस प्रवाह को रोकने और सुई को बाहर खींचने के बराबर करने के लिए दबाव के लिए कुछ ही सेकंड प्रतीक्षा करें। दोनों draining वंक्षण LNS लक्षित करने के लिए पूंछ बेस के दूसरे पक्ष पर इंजेक्शन दोहराएँ।
  3. Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ लिम्फ नोड cryosections की तैयारी और परीक्षा।
    1. एक IACUC पशु प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी के अनुसार प्रेरित वातिलवक्ष द्वारा पीछा सीओ 2 asphyxiation के साथ माउस, euthanize। Bedoya 23 में प्रदर्शन प्रोटोकॉल के अनुसार वंक्षण LNS निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस के 1 मिलीलीटर में ऊतकों रखकर खून बाहर धो लो।
    2. ऊतकों के साथ ऊतकों से पीबीएस को अवशोषित और ऊतक cryomolds में ऊतक जगह (10 एक्स 10 एक्स 5 मिमी) 3 अक्टूबर मध्यम 24 ठंड के साथ शीर्ष पर पहले से भरे। स्नैप आज़ादी फ्रीज30 सेकंड के लिए तरल नाइट्रोजन में ब्लॉक के खिलाफ मुकदमा। वैकल्पिक रूप से, 30 मिनट के लिए सूखी बर्फ पर ऊतक ब्लॉक जगह है। डिग्री सेल्सियस फ्रीजर में -80 जमे हुए ऊतक स्टोर।
    3. -20 डिग्री सेल्सियस से 24 पर सेट एक cryostat में 5-10 माइक्रोन मोटी ऊतक वर्गों में कटौती।
    4. यदि आवश्यक हो, immunofluorescence लेबलिंग करते हैं, और पहले से 24 के रूप में प्रदर्शन confocal माइक्रोस्कोपी के साथ ऊतक की जांच।

विशिष्ट प्रतिजन 3. निगरानी विस्तार, पूरे जानवर इमेजिंग के साथ nanoparticle के टीकाकरण के बाद सीडी 8 + टी कोशिकाओं luciferase व्यक्त

  1. OT-मैं / ल्यूक ट्रांसजेनिक चूहों से ओवीए 257-264 -specific, luciferase व्यक्त CD8 + टी कोशिकाओं का अलगाव
    1. सीओ 2 asphyxiation के साथ एक OT-मैं / ल्यूक ट्रांसजेनिक माउस euthanize और एक IACUC के अनुसार एक वातिलवक्ष पशु प्रोटोकॉल को मंजूरी दे दी प्रेरित। अग्न्याशय 23 से ऊतक detaching ध्यान से पेरिटोनियल गुहा तक पहुँचने और से एक बाँझ ढंग से तिल्ली फसल, औरटिशू कल्चर हुड के स्थानांतरण के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पीबीएस + 2% FBS की 5 मिलीलीटर में जगह।
    2. (एक समय में 3 spleens तक) एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र ट्यूब पर एक 70 माइक्रोन नायलॉन झरनी पर तिल्ली रखें। एक 3 मिलीलीटर सिरिंज से एक सवार का प्रयोग, झरनी के माध्यम से कोशिकाओं को पीस।
    3. सवार और पीबीएस + 2% FBS के साथ झरनी धो लें और त्यागें। 300 x जी पर 10 मिनट के लिए, 10 मिलीग्राम / 50 मिलीलीटर ट्यूब में तिल्ली के लिए कुल मात्रा लाओ एक hemocytometer साथ गिनती करने के लिए सेल निलंबन का एक छोटा सा नमूना लेते हैं, और अपकेंद्रित्र।
    4. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय नकारात्मक चयन किट का प्रयोग, निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए CD8 + टी सेल की आबादी को अलग।
    5. पीबीएस के साथ कोशिकाओं को धोने के बाद, अलग CD8 + टी कोशिकाओं की संख्या गिनती। पृथक CD8 + टी कोशिकाओं की शुद्धता का आकलन करने के लिए, तो αCD8-एपीसी एंटीबॉडी के 20 μl जोड़ने के लिए, 10 मिनट के लिए माउस CD16 / 32 एंटीबॉडी (0.025 मिलीग्राम / एमएल) के 20 μl में ~ 20,000-30,000 कोशिकाओं को सेते (0.005 मिलीग्राम / एमएल) और 30 मिनट के लिए सेते हैं। पेबीएसए वी / डब्ल्यू पीबीएस में 4 डिग्री सेल्सियस पर 1% सभी incubations rform। प्रवाह cytometric विश्लेषण 25 कार्य करें।
  2. उनके विस्तार पद टीकाकरण के दत्तक पृथक CD8 + टी कोशिकाओं के हस्तांतरण और दृश्य
    1. नसों में पूंछ नस इंजेक्शन 22 दिन (-1) के माध्यम से पीबीएस के 200 μl मात्रा में 1-10 × 10 5 कोशिकाओं प्रशासन द्वारा भोले C57BL / 6 चूहों में पृथक OT-मैं / ल्यूक CD8 + टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण प्रदर्शन करते हैं। C57BL / 6 चूहों में है कि फर और काले रंग की त्वचा पैच को ध्यान में रखते bioluminescent संकेत के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, मुंडा सूरजमुखी मनुष्य C57BL / 6 चूहों इन अध्ययनों के लिए आदर्श होते हैं।
    2. पहले से (धारा 2.2) के रूप में वर्णित एक दिन (0 दिन) के बाद, टीका प्रशासन।
    3. Intraperitoneally पीबीएस के 300 μl मात्रा में किग्रा माउस शरीर के वजन के प्रति luciferin की 150 मिलीग्राम प्रशासन। 10 मिनट के बाद, (कदम 2.2.1 के रूप में) isoflurane के साथ चूहों anesthetize और 5-10 मिनट W के लिए bioluminescence संकेत प्राप्त करके OT-मैं / ल्यूक CD8 + टी कोशिकाओं कल्पनाएक पूरी पशु इमेजिंग प्रणाली के ith (IVIS; विस्तृत निर्देश के लिए विल्सन 26 को देखें)। अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए आवश्यक के रूप में दोहराएँ।

के विश्लेषण के लिए PBMCs 4. पेप्टाइड MHC tetramer धुंधला विशिष्ट प्रतिजन सीडी 8 + टी कोशिकाओं

नोट: निम्न प्रोटोकॉल प्रक्रिया adoptively दत्तक हस्तांतरण के बिना ओटी-मैं / ल्यूक CD8 + टी कोशिकाओं या C57BL / 6 चूहों के साथ स्थानांतरित C57BL / 6 चूहों या तो उपयोग किया जा सकता है।

  1. टीकाकरण के बाद एक वांछित समय बिंदु पर, कश्मीर 2 EDTA के साथ लेपित एक ट्यूब में अवअधोहनुज खून बह रहा है तकनीक 27 के माध्यम से चूहों से रक्त के लगभग 100 μl (4-6 बूँदें) को इकट्ठा करने और थक्के रोकने के लिए कई बार पलटना।
  2. एक microcentrifuge ट्यूब के लिए रक्त के 100 μl स्थानांतरण lysis बफर के 1 मिलीलीटर जोड़ने के लिए, और लाल रक्त कोशिकाओं (लाल रक्त कोशिकाओं) को हटाने के क्रम में 2 मिनट से 3 के लिए सेते हैं। नमूने अपकेंद्रित्र 1,500 XG पर 5 मिनट के लिए और सतह पर तैरनेवाला हटा दें। अभी भी एक गोली है(लाल रक्त कोशिकाओं की अधूरी हटाने का संकेत है) लाल ppears, lysis बफर का एक संक्षिप्त ऊष्मायन (<1 मिनट) के साथ सेल कदम दोहराएँ।
  3. 5 मिनट के लिए 1,500 XG पर 1 (/ बीएसए वी डब्ल्यू पीबीएस + 1%) FACS बफर के मिलीग्राम और सेंट्रीफ्यूज के साथ शेष PBMCs धो लें।
  4. महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और बाध्यकारी अविशिष्ट और FCR की मध्यस्थता एंटीबॉडी ब्लॉक करने के लिए माउस CD16 / 32 एंटीबॉडी के 20 μl में नमूना (0.025 मिलीग्राम / एमएल) resuspend। आरटी पर 10 मिनट के लिए सेते हैं।
  5. 4 मिलीलीटर दौर नीचे FACS ट्यूबों में microcentrifuge ट्यूब से कोशिकाओं स्थानांतरण। प्रत्येक नमूने के लिए निर्माता की विशेषताओं के अनुसार ओवीए tetramer-SIINFEKL पीई समाधान बी एच -2 k के 20 μl जोड़ें और बर्फ पर 30 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. एंटीबॉडी कॉकटेल तैयार करें (उदाहरण के लिए, αCD8-एपीसी, αCD44-FITC, और αCD62L-PECy7 एंटीबॉडी (क्रमश: 0,005, 0,005, और 0.002 मिलीग्राम / एमएल एकाग्रता,))। प्रत्येक प्रयोगात्मक नमूने के 20 μl जोड़ें, और बर्फ पर 20 मिनट के लिए सेते हैं। La द्वारा एकल फ्लोरोफोरे नियंत्रण की तैयारीउपर्युक्त एकाग्रता में प्रत्येक फ्लोरोफोरे टैग टेट्रामर या एंटीबॉडी के साथ कोशिकाओं beling।
  7. FACS बफर के साथ 2 बार धोएं और DAPI के 2 माइक्रोग्राम / मिलीलीटर युक्त FACS बफर में अंतिम गोली resuspend। विश्लेषण (विवरण और उदाहरण Scheffold 25 में पाया जा सकता है) cytometry कोशिकाओं को अब प्रवाह के लिए तैयार हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ICMVs के संश्लेषण में शामिल कदम चित्रा 1 6 में सचित्र हैं। संक्षेप में, किसी भी lipophilic दवाओं या फ्लोरोसेंट रंगों से युक्त एक लिपिड फिल्म हाइड्रोफिलिक दवाओं की उपस्थिति में हाइड्रेटेड है। ऐसे सीए 2 + के रूप में द्विसंयोजक फैटायनों, multilamellar vesicles में ऋणात्मक liposomes के संलयन ड्राइव करने के लिए जोड़ रहे हैं। डीटीटी के रूप में इस तरह के, लिपिड परतों apposing, और अंत में बाहरी maleimide समूहों शेष पर "प्रधान" maleimide-क्रियाशील लिपिड में जोड़ा जाता है Dithiol crosslinker, thiolated खूंटी moieties के साथ एक प्रतिक्रिया में बुझती हैं। प्रत्येक बैच का एक छोटा सा अंश आसानी से एक डीएलएस और जीटा संभावित विश्लेषण प्रणाली के साथ कण आकार, polydispersity सूचकांक, और जीटा संभावित निर्धारित करने से गुणवत्ता नियंत्रण माप के अधीन किया जा सकता है। जिसके परिणामस्वरूप कणों ओवीए-encapsulating पी के लिए एक औसत 130 ± 20 एनएम के आकार, 0.22 ± 0.02 की polydispersity सूचकांक, और -54 ± 3 एम वी के जीटा क्षमता के साथ अपेक्षाकृत समरूप हैंलेख (चित्रा 1 बी और 1 सी)। कणों की सूखी वजन में मापा कणों की ठेठ उपज, ~ 50% 6।

ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करना, ICMVs विवो में प्रतिजन और nanoparticle वितरण के दृश्य की अनुमति, फ्लोरोफोरे टैग प्रोटीन प्रतिजन और फ्लोरोसेंट lipophilic डाई के साथ सह-लोड किया जा सकता है। घुलनशील रूप में बनाम ICMVs में प्रतिजन वितरण का पैटर्न की तुलना करने के लिए, C57BL / 6 चूहों 100 या तो घुलनशील या ICMV योगों लेबल किया था, और draining वंक्षण LNS में ओवीए AlexaFluor555 टैग की माइक्रोग्राम विभिन्न पर excised थे साथ पूंछ के आधार पर अनुसूचित जाति दिलाई गई DLN ऊतक क्रायो वर्गों की तैयारी के लिए समय अंक। Confocal माइक्रोस्कोपी के साथ दृश्य घुलनशील प्रतिजन जल्दी से 4 घंटे के भीतर dLNs पर पहुंच गया, लेकिन यह भी 24 घंटा (चित्रा 2) 7 के साथ बहुत तेजी से साफ हो गया था कि संकेत दिया। इसके विपरीत, ओवीए से भरी हुई ICMVs निरंतर संचय के साथ, 24 घंटा से dLNs की परिधि में पाया गयाdLNs में ओवीए-ICMVs की एक बड़ी राशि जमा करने, 4 दिन की जांच के रूप में (चित्रा 2)। Confocal micrographs भी AlexaFluor555 टैग ओवीए के सह स्थानीयकरण दिखाया और ICMVs ICMVs 7 भीतर समझाया प्रोटीन एंटीजन और अन्य immunostimulatory एजेंटों की स्थिर सह-डिलीवरी की अनुमति, सुझाव है कि dLNs भीतर ICMVs लेबल किया था।

OT-मैं / ल्यूक ट्रांसजेनिक माउस से CD8 + टी कोशिकाओं का अलगाव आसानी से 3 चित्रा। ~ 8-12 x 10 6 कोशिकाओं एक माउस तिल्ली प्रति उपज, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध चुंबकीय नकारात्मक चयन किट के साथ प्रदर्शन किया adoptively के साथ स्थानांतरित C57BL / 6 चूहों से पता चलता किया जा सकता है 5 एक्स 10 5 OT-मैं / ल्यूक CD8 + टी दिन -1 पर कोशिकाओं, और 10 ओवीए की माइक्रोग्राम और घुलनशील या ICMV योगों में या तो MPLA के 0.3 माइक्रोग्राम की सुप्रीम कोर्ट प्रशासन के साथ 0 दिन पर प्रतिरक्षित। IVIS साथ Bioluminescence इमेजिंग टीकाकरण न्यूनतम OT-मैं / ल्यूक संकेत दिखाया 0 पहले दिन पर प्रदर्शन किया। हालांकि, दिन 4 पद टीकाकरण से, चूहों प्रतिरक्षितओवीए साथ / MPLA-ICMVs पूंछ आधार क्षेत्र में 28 draining LNS हैं जो वंक्षण LNS, भीतर मजबूत bioluminescence संकेत था। इसके विपरीत, वैक्सीन की घुलनशील रूप से प्रतिरक्षित चूहों वंक्षण dLNs भीतर OT-मैं / ल्यूक CD8 + टी कोशिकाओं की बहुत कम विस्तार से पता चला है।

एक मॉडल प्रतिजन के रूप में ओवीए का प्रयोग immunodominant ओवीए 257-264 पेप्टाइड (SIINFEKL) के लिए विशिष्ट अंतर्जात CD8 + टी कोशिकाओं के विस्तार की निगरानी की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, C57BL / 6 चूहों दिनों 0, 21 पर प्रतिरक्षित किया गया है, और सुप्रीम कोर्ट में 10 माइक्रोग्राम ओवीए के प्रशासन और ICMVs या घुलनशील रूप में या तो 0.3 माइक्रोग्राम MPLA के साथ 35, और PBMCs में CD8 + टी कोशिकाओं के बीच SIINFEKL-विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं की आवृत्तियों SIINFEKL-एच -2 k बी टेट्रामर पीई। चित्रा -4 ए के साथ दाग PBMCs के प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा निर्धारित किया गया है SIINFEKL-एच -2 k बी टेट्रामर दिन 41 6 पर PBMCs में CD8 + टी कोशिकाओं के बीच + कोशिकाओं का बिखराव भूखंडों cytometry के प्रतिनिधि प्रवाह से पता चलता है। Figurई 4 बी SIINFEKL-टेट्रामर + CD8 + टी कोशिकाओं के बीच केंद्रीय स्मृति phenotype के साथ CD62L + CD44 + कोशिकाओं के प्रतिनिधि बिखराव भूखंडों से पता चलता है। चित्रा 4C में दिखाया गया PBMCs की साप्ताहिक निगरानी ICMV टीकाकरण काफी मजबूत CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया हासिल जबकि घुलनशील ओवीए टीका सीडी 8 में एक चोटी पर 28% SIINFEKL-टेट्रामर + टी कोशिकाओं को प्राप्त करने, विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी कोशिकाओं की न्यूनतम विस्तार हासिल संकेत दिया कि + डे द्वारा टी सेल की आबादी 41 6। यहाँ प्रस्तुत टेट्रामर धुंधला प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम अनुपचारित या पीबीएस इलाज पशुओं में (एन = 15) 0.04% ओवीए विशेष टी कोशिकाओं ± 0.11% की पृष्ठभूमि आवृत्ति मनाया, और हम पता लगा सकते हैं (नहीं दिखाया डेटा पी मूल्य <0.005) 0.05% ± 0.46% के रूप में के रूप में कम प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल आवृत्तियों में सांख्यिकीय महत्वपूर्ण वृद्धि हुई है।

चित्र 1
(ए) ICMVs निम्नलिखित 4 चरणों में संश्लेषित कर रहे हैं। (मैं) ऋणात्मक, maleimide-क्रियाशील liposomes सूखे लिपिड फिल्मों से तैयार कर रहे हैं; (Ii) के द्विसंयोजक फैटायनों liposomes का फ्यूजन और multilamellar vesicles के गठन को प्रेरित करने के लिए कहा जाता है; (Iii) की झिल्ली पारगम्य dithiols पुटिका दीवारों में apposed लिपिड bilayers पर maleimide-लिपिड crosslink, जो जोड़ रहे हैं; और (iv) जिसके परिणामस्वरूप लिपिड कणों thiol समाप्त खूंटी के साथ PEGylated कर रहे हैं। (बी) डीएलएस द्वारा विश्लेषण के रूप में प्रतिनिधि कण वितरण दिखाया गया है। (सी) औसत हाइड्रोडायनामिक आकार, polydispersity सूचकांक, और ICMVs की जीटा संभावित ओवीए और MPLA दिखाए जाते हैं के साथ सह-भरा हुआ है। पैनल (ए) चंद्रमा एट अल। 6 से संशोधित किया गया है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
प्रतिजन चित्रा 2. विश्लेषण confocal माइक्रोस्कोपी के साथ लिम्फ नोड्स के लिए draining। C57BL / 6 चूहों या तो समाधान या ICMVs में (नीले रंग में दिखाया गया है) 100 माइक्रोग्राम फ्लोरोफोरे संयुग्मित (लाल रंग में दिखाया गया है) ओवीए और 5 माइक्रोग्राम MPLA साथ प्रतिरक्षित किया गया। Draining वंक्षण लिम्फ नोड्स, संकेत समय बिंदुओं पर excised cryosectioned, और confocal माइक्रोस्कोपी के साथ imaged थे। प्रतिनिधि confocal micrographs दिखाए जाते हैं। गुलाबी संकेतों ओवीए और ICMVs के सह स्थानीयकरण संकेत मिलता है। यह आंकड़ा चंद्रमा एट अल। 7 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. Monitorinटीकाकरण। C57BL / 6 सूरजमुखी मनुष्य चूहों के बाद जी टी सेल विस्तार adoptively दिन -1 पर 5 एक्स 10 5 ल्यूक + OT-मैं CD8 + टी कोशिकाओं के साथ चतुर्थ स्थानांतरित कर दिया गया। 0 दिन पर, पशुओं को 10 ओवीए की माइक्रोग्राम और 0.1 माइक्रोग्राम MPLA के रूप में या तो घुलनशील या ICMV योगों के साथ दिलाई गई। जानवरों isoflurane के साथ anesthetized और (150 मिलीग्राम / किलो, 300 μl इंजेक्शन के आईपी) IVIS के साथ अधिग्रहण कर लिया था ल्यूक + ओटी-1 CD8 + टी कोशिकाओं से, और bioluminescence संकेत luciferin के साथ दिलाई गई। इस का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें आंकड़ा।

चित्रा 4
ICMV टीकाकरण के बाद अंतर्जात ओवीए विशिष्ट CD8 + टी कोशिकाओं की चित्रा 4. विस्तार। C57BL / 6 चूहों मैं या तो 10 ओवीए की माइक्रोग्राम और 0.1 MPLA की माइक्रोग्राम से प्रतिरक्षित किया गयाएन समाधान या दिनों 0, 21 पर ICMVs, और 35 (तीर)। परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear बीच ओवीए विशेष टी कोशिकाओं की आवृत्ति SIINFEKL-MHC-मैं टेट्रामर + CD8 + टी कोशिकाओं के प्रवाह cytometric विश्लेषण द्वारा समय पर मूल्यांकन किया गया था। (ए) के दिन 41 शो SIINFEKL-MHC-मैं टेट्रामर + CD8 + टी कोशिकाओं और (बी) CD62L + CD44 + कोशिकाओं, केंद्रीय स्मृति टी कोशिकाओं की मार्कर पर व्यक्तिगत चूहों से तितर बितर भूखंडों cytometry के प्रतिनिधि प्रवाह। (सी) टी सेल विस्तार और संकुचन के समग्र कैनेटीक्स दिखाया गया है। यह आंकड़ा चंद्रमा एट अल। 6 से संशोधित किया गया है। आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

इस लेख में प्रदान प्रोटोकॉल ICMVs करार दिया संश्लेषण और एक नया लिपिड आधारित nanoparticle प्रणाली के लक्षण, का वर्णन है, और विशिष्ट प्रतिजन CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया प्रेरित करने के लिए nanoparticle आधारित टीका योगों के प्रभाव को मान्य करने की प्रक्रिया प्रदान करता है। ICMV संश्लेषण अक्सर के नुकसान में जिसके परिणामस्वरूप आम तौर पर तैयार करने के लिए कार्बनिक सॉल्वैंट्स की आवश्यकता होती है जो अन्य आमतौर पर इस्तेमाल किया पोलीमेरिक nanoparticle सिस्टम (जैसे, पाली (Lactide-सह-Glycolide) एसिड कणों), के साथ तुलना में एक बड़ा फायदा है जो सभी जलीय हालत में पूरा हो गया है प्रोटीन में प्रतिजनकता 29,30 प्रतिजन। इसके अलावा, व्यापक स्थिरता और क्षमता से ICMVs लाभ इस प्रकार APCs 31,32 के भीतर एक ही इंट्रासेल्युलर कम्पार्टमेंट के लिए लक्षित एंटीजन और adjuvants के सह-वितरण की अनुमति, हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक दोनों अणुओं 6 encapsulate करने के लिए। एक मॉडल टीका nanoparticle के रूप में ICMVs का उपयोग करना है, यहाँ हम प्रक्रियाओं रेखांकित किया है(1) nanoparticle के संश्लेषण और लक्षण, dLNs को nanoparticle के जल निकासी की (2) सत्यापन, और प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के निकालना की परीक्षा (3) एक गैर इनवेसिव bioluminescence इमेजिंग तकनीक और (4) पेप्टाइड MHC का उपयोग करने के लिए PBMCs पर टेट्रामर धुंधला परख।

यह वे बहुत लसीका निकासी प्रभावित करते हैं और इन विवो प्रशासन पर APCs द्वारा तेज कर सकते हैं के रूप में विशेष रूप से कण आकार और सतह चार्ज करने के लिए, बैच बैच से nanoparticle के संश्लेषण में एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण है। डीएलएस और जीटा संभावित विश्लेषण कण आकार और सतह के आरोप पर गुणवत्ता की जांच के त्वरित तरीके प्रदान। व्यक्तिगत कणों की आकृति विज्ञान पर और अधिक विस्तृत विश्लेषण के लिए, इन तकनीकों ऐसे vitrified जलीय परत 6,33,34 में "सॉफ्ट" कणों की आकृति विज्ञान को बरकरार रखता है कि क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) के रूप में, उच्च संकल्प इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ पूरक किया जा सकता है । एंटीजन और adjuv के encapsulation दक्षताचींटियों भी निर्धारित किया है और संश्लेषण के बीच एक समान रखा जाना चाहिए। प्रोटीन एंटीजन बैंड तीव्रता के आधार पर absorbance- और प्रतिदीप्ति आधारित प्रोटीन मात्रा का ठहराव किट का उपयोग मात्रा, या 36 धुंधला एसडीएस पृष्ठ 35 और Coomassie या चांदी के उपयोग का विश्लेषण किया है, और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है जबकि इस तरह के MPLA के रूप में adjuvants, एक फ्लोरोफोरे 6 के साथ टैग किया जा सकता है । इष्टतम जेट पूरा संश्लेषण के लिए आवश्यक है के रूप में कण तैयारी में विसंगतियां, समाप्त हो गई है या खराब संग्रहीत अभिकर्मकों से हो सकता है। यह अंत करने के लिए, maleimide- और thiol- क्रियाशील अभिकर्मकों लगातार फ्रीज पिघलना चक्र के बिना -80 डिग्री सेल्सियस पर छोटे aliquots में रखा जाना चाहिए।

छोटे से अधिक 100 एनएम आम तौर पर प्रभावी ढंग से बड़े कणों (500-2,000 एनएम) है, जबकि dLNs से 13 लसीका वाहिकाओं और यातायात दर्ज करने के लिए लगा रहे हैं कण ऊतक निवासी DCs 12,37 से सक्रिय परिवहन की आवश्यकता होती है। हमारे हाथ में, 150-2 लेकर हाइड्रोडायनामिक आकार के साथ ICMVs50 कुशलता से स्थानीय और व्यापक सीटीएल और humoral प्रतिक्रियाओं 6,7, जिसके परिणामस्वरूप DLN में कायम एनएम। प्रशासन के 24 घंटे के भीतर, ICMVs dLNs में subcapsular साइनस मैक्रोफेज के साथ जुड़े थे, और प्रवाह cytometric दिनों 1 पर प्रदर्शन विश्लेषण करती है और 4 dLNs के भीतर सबसे ICMVs लैंगरहैंस के साथ जुड़े कणों के केवल एक छोटे से हिस्से के साथ एलएन वासी APCs द्वारा लिया गया कि संकेत दिया और चमड़े का DCs 7। इन परिणामों के निष्क्रिय परिवहन dLNs को ICMV तस्करी के प्रमुख विधा है कि संकेत दिया। इन अध्ययनों dLNs में उनके स्थानीयकरण और वितरण पैटर्न चित्रित करने के लिए फ्लोरोफोरे टैग नैनोकणों और प्रोटीन एंटीजन का उपयोग किया है। Cryosectioned dLNs के confocal माइक्रोस्कोपी एलएन संरचनाओं की पहचान के लिए अतिरिक्त इम्यूनोफ्लोरेसेंस ऊतकरसायनविज्ञान की अनुमति देता है (उदाहरण के लिए, जीएल-7 कीटाणु केन्द्रों में अभिव्यक्ति) और निर्माण घटकों (जैसे, DCS साथ बातचीत के दौरान कोशिकाओं - CD11c, मैक्रोफेज - F4 / 80, CD169, और बी कोशिकाओं & #8211; B220) 7,9। इस तकनीक 7,9 तेज कण के लिए जिम्मेदार APCs के सबसेट चित्रित करने के लिए dLNs से काटा कोशिकाओं का विश्लेषण प्रवाह cytometry के साथ समानांतर में प्रदर्शन किया जा सकता है या पूरे पशु इमेजिंग के साथ फ्लोरोसेंट संकेतों मजबूत कर रहे हैं और ऊतक autofluorescence संकेतों के साथ हस्तक्षेप नहीं करता है, बशर्ते कि dLNs 38,39 करने के लिए इंजेक्शन साइट से वैक्सीन वितरण quantitate करने के लिए।

प्रभावी टीकाकरण मजबूत सक्रियण और टीकाकरण के द्वारा पीछा bioluminescent, विशिष्ट प्रतिजन ट्रांसजेनिक टी कोशिकाओं के दत्तक हस्तांतरण के बाद पूरे शरीर bioluminescence इमेजिंग से लगाया जा सकता है जो विशिष्ट प्रतिजन साइटोटोक्सिक टी कोशिकाओं, के विस्तार की आवश्यकता है। इस विधि का जोड़ा लाभ इस प्रकार प्रतिरक्षात्मक विश्लेषण के लिए आवश्यक जानवरों की संख्या कम करने और श्रमसाध्य सेल अलगाव procedur के प्रयोग से परहेज, एक विस्तारित अवधि के लिए एक ही पशुओं में सीटीएल की तस्करी के दोहराया दृश्य के लिए संभावित हैते। इस इमेजिंग तकनीक का उपयोग करना, हम हाल ही में ICMVs के फेफड़े प्रशासन प्रोटीन प्रतिजन और एक immunostimulatory एजेंट के साथ सह-लोडेड प्रदर्शन किया है कि फेफड़ों में प्रतिजन विशेष CD8 + टी कोशिकाओं और mediastinal LNS और बाहर का श्लैष्मिक ऊतकों को CTLs के बाद के प्रचार-प्रसार के प्रबल निकालना के लिए नेतृत्व किया , Peyer पैच, अंधान्त्र, और योनि मार्ग 9 भी शामिल है। प्रवाह cytometric इन नए विस्तार CD8 + टी कोशिकाओं 4 β 7 + Integrin अभिव्यक्ति और श्लैष्मिक वायरल चुनौती 9 के खिलाफ मध्यस्थता रक्षात्मक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया α द्वारा विशेषता "श्लैष्मिक-घर वापस आना" phenotype के साथ अंकित किया गया पता चला है कि विश्लेषण करती है। bioluminescent CD8 + टी कोशिकाओं की पूरी-पशु इमेजिंग भी हाल ही में Hailemicheal एट अल।, ट्यूमर प्रतिजन पेप्टाइड अधूरा Freund के सहायक तैयार में प्रदर्शन किया है कि जो द्वारा उपयोग किया गया था (यूके, तेल-इन-पानी पायस) साइट पर टी कोशिकाओं की ज़ब्ती के परिणामस्वरूप इंजेक्शन कीदूर ट्यूमर जनता से टीका "डिपो" के साथ, टी सेल में शिथिलता और विलोपन 40 के लिए अग्रणी।

Tetramer धुंधला विभिन्न टीका योगों 21 से उत्पन्न अंतर्जात सीटीएल प्रतिक्रियाओं का स्तर यों के लिए अतीत में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया गया है। इस तकनीक को भी प्रासंगिक है और आमतौर पर विशिष्ट ट्यूमर जुड़े एंटीजन 41,42 करने के लिए सीटीएल प्रतिक्रियाएं पुष्टि करने के लिए जल्दी मानव कैंसर प्रतिरक्षा चिकित्सा नैदानिक ​​परीक्षण में उपयोग किया जाता है। PBMCs आसानी से चूहों से एकत्र की है और फ्लो के लिए तैयार किया जा सकता है; इस प्रकार अधिक व्यापक विश्लेषण की आवश्यकता होती है, पहले या कैंसर मॉडल में ट्यूमर के भीतर के रूप में उल्लेख हालांकि, यह कारण डिपो के गठन के टीके के लिए सेल स्थानीयकरण करने के लिए टी-सेल विस्तार की पूर्ण सीमा तक खुलासा नहीं हो सकता है। फ्लो के साथ इस पद्धति का संगतता स्मृति मार्कर (CD44, CD62L, CD127, बीसीएल -2, और KLRG-1) के साथ प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं के निर्धारण के प्रेरक, केंद्रीय स्मृति, और प्रेरक स्मृति सीई भेद करने के लिए अनुमति देता है(हाल ही में समीक्षा 46,47 में संक्षेप के रूप में) टेट्रामर + टी कोशिकाओं को 43 या लंबे समय से स्थायी ऊतक निवासी CTLs 44,45 के बीच LLS। अत्यधिक विस्तार प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं प्रतिरक्षा थकावट 48,49 के संकेत प्रदर्शित कर सकते हैं हालांकि, बाद से टेट्रामर धुंधला परख सीटीएल प्रतिक्रियाओं की केवल प्रारंभिक आकलन प्रदान करता है। सीटीएल प्रतिक्रियाओं के कार्यात्मक मूल्यांकन न्यूनतम epitopes साथ लिम्फोसाइटों के पूर्व vivo उत्तेजना के बाद एंजाइम जुड़ा हुआ immunospot (ELISPOT) 50 या intracellular साइटोकाइन धुंधला 51 के साथ के रूप में अच्छी तरह से perforin और granzyme बी 52 और बाह्य के intracellular के स्तर को मापने के द्वारा की जांच साइटोकाइन रिहाई के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है degranulation 53 पर CD107a और CD107b की अभिव्यक्ति है। इसके अलावा, CTLs के cytolytic समारोह सीधे इन विट्रो में या विवो 54-56 में प्रदर्शन सीटीएल cytotoxicity assays के साथ मूल्यांकन किया जा सकता है।

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्रेरणnanoparticle के टीकाकरण CD8 + टी सेल के साथ समानांतर में अध्ययन किया जा सकता है के बाद यहाँ प्रस्तुत विश्लेषण करती है। एंटीबॉडी आत्मीयता और मिलान मान्यता की चौड़ाई chaotropic एजेंट के उपयोग के साथ एलिसा प्रोटोकॉल को संशोधित करने से मूल्यांकन किया जा सकता है, जबकि एंटीबॉडी titers के एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) की पारंपरिक विधि से विश्लेषण किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, यूरिया) प्रतिरक्षी के दौरान करने के लिए बाध्य सब्सट्रेट और substrates, क्रमशः 7 के रूप में एंटीजन के भीतर उप डोमेन का उपयोग करें। शक्तिशाली humoral प्रतिक्रियाओं का निकालना कूपिक सहायक सीडी 4+ टी कोशिकाओं के विस्तार (टी एफ एच) 57 की आवश्यकता है। कण टीकाकरण के जवाब में टी एफ एच कोशिकाओं के विस्तार की जांच करने के लिए, यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल आसानी से भोले प्राप्तकर्ता चूहों में दत्तक सेल हस्तांतरण द्वारा पीछा OT-द्वितीय ट्रांसजेनिक चूहों से विशिष्ट प्रतिजन सीडी 4+ टी कोशिकाओं के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। टीकाकरण के बाद, ल्य्म्फोइड ऊतकों काटा जा सकता है और प्रवाह cytometric के साथ विश्लेषण रोकते का विश्लेषण करती है(उनकी सीडी 4 + CXCR5 + पीडी -1 + फेनोटाइप द्वारा की पहचान) प्रतिजन विशेष टी एफ एच कोशिकाओं की खदान विस्तार 7।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Perkin एल्मर इस लेख के प्रकाशन के दौरान खर्च की उत्पादन लागत प्रदान की है।

Acknowledgments

इस अध्ययन के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान 1K22AI097291-01 अनुदान द्वारा समर्थित और पुरस्कार नंबर UL1TR000433 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के translational विज्ञान आगे बढ़ाने के लिए राष्ट्रीय केन्द्र द्वारा किया गया था। हम यह भी टीका नैनोकणों और ओटी-मैं / ल्यूक ट्रांसजेनिक चूहों पर प्रारंभिक काम पर उनके योगदान के लिए फ्रेड हचिंसन कैंसर सेंटर में एमआईटी और प्रो मथायस स्टीफ़न पर प्रो डेरेल इरविन को स्वीकार करते हैं।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) Avanti Polar Lipids, INC. 870012
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) Avanti Polar Lipids, INC. 850375
Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) Avanti Polar Lipids, INC. 699800
20 ml glass vials Wheaton 0334125D
Symphny Vacuum Oven VWR 414004-580
Ovalbumin (OVA) Worthington 3054
Bis-Tris Propane (BTP) Fisher BP2943
Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) Qsonica Q125-110
Dithiothreitol (DTT) Fisher BP172
2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) Laysan Bio MPEG-SH-2000-1g
Malvern ZetaSizer Nano ZSP  Malvern
ZetaSizer Cuvettes Malvern DTS1070
2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy
1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) Life Technologies D-7757
Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) Life Technologies A37571
Tissue-Tek OCT freezing medium  VWR 25608-930
Tissue Cryomolds VWR 25608-922
3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging
C57BL/6 mice Jackson 000664
Albino C57BL/6 mice Jackson 000058
OT-1 C57BL/6 mice Jackson 003831
70 μm nylon strainer BD 352350
EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit StemCell 19853
IVIS® whole animal imaging system Perkin Elmer
4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells
K2EDTA tubes BD 365974
ACK lysis buffer Life Technologies A10492-01 
Anti-CD16/32 Fc Block Ebioscience 14-0161-86
H-2Kb OVA Tetramer MBL TS-5001-1C
Anti-CD8-APC BD 553031
Anti-CD44-FITC BD 553133
Anti-CD62L-PECy7 Ebioscience 25-0621-82
4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) SIGMA D8417-10MG
CyAn Flow Cytometer Beckman Coulter
FlowJo Software FlowJo

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
  2. Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
  3. Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
  4. Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
  5. Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
  6. Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
  7. Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
  8. DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
  9. Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
  10. Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
  11. Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
  12. Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
  13. Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
  14. Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
  15. Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
  16. Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
  17. Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
  18. Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
  19. Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
  20. Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
  21. Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
  22. Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
  23. Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
  24. Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
  25. Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
  26. Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
  27. Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
  28. Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
  29. Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
  30. Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
  31. Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
  32. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  33. Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
  34. Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
  35. Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
  36. Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
  37. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
  38. Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
  39. Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
  40. Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
  41. Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
  42. Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
  43. Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
  44. Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
  45. Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
  46. Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
  47. Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
  48. Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
  49. Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
  50. Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
  51. Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
  52. Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
  53. Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
  54. Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
  55. Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
  56. Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
  57. Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).

Tags

इम्यूनोलॉजी अंक 98 nanoparticle टीका biomaterial सबयूनिट प्रतिजन सहायक साइटोटोक्सिक CD8 + टी लिम्फोसाइट पूरे जानवर इमेजिंग टेट्रामर धुंधला हो जाना और लिम्फ नोड
Nanoparticle के टीकाकरण के बाद के विश्लेषण से प्रतिजन विशेष CD8 + टी सेल प्रतिक्रिया के लिए पूरे पशु इमेजिंग और प्रवाह cytometric तकनीकों
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ochyl, L. J., Moon, J. J.… More

Ochyl, L. J., Moon, J. J. Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination. J. Vis. Exp. (98), e52771, doi:10.3791/52771 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter