Introduction
Geleneksel aşı geliştirme ağırlıklı deneme-yanılma ampirik bir yaklaşım uygulamaktadır. Ancak, biyomalzeme ve immün aktivasyon moleküler belirleyicileri keşif geniş bir yelpazeye son gelişme ile, bu rasyonel patojenlerin 1,2 türetilen biyofiziksel ve biyokimyasal ipuçları ile aşı formülasyonları tasarlamak artık mümkün. Özellikle, çeşitli parçacık halinde ilaç iletim platformları, lenf içinde bulunan bozunmadan, aşı bileşenleri korumak ve antijen sağlayan hücrelere (APC) kendi eş sevkini iyileştirmek, bu alt birim antijen ve immünostimülatör maddelerle birlikte yüklenebilecek aşı taşıyıcıları olarak incelenmiştir düğümler (LN), böylece bağışıklık uyarımı ve aktivasyonunu 3-5 maksimize. Daha önce güçlü bir aşı platfor olarak gösterilmiştir, bu yazıda, bir "patojen taklit eden" nanopartikül sisteminin sentezini tarif adlandırılan interbilayer-çapraz bağlanmış çok-lamelli veziküller (ICMVs),Sağlam sitotoksik T lenfosit (CTL) ve sistemik ve mukoza dokusu bölümlerinde 6-9 hem de humoral bağışıklık karşılıklarının ortaya çıkartıldığını m. Özellikle, ICMVs ile aşılama büyük oranda geleneksel yardımcı maddeler (örneğin, şap ve Montanide) 7 ile aşılama ile karşılaştırıldığında, bir sıtma antijene karşı serum IgG düzeyleri gelişmiş ve aynı zamanda tümör hücreleri ve fareler 9 viral meydan modellerine karşı güçlü CTL yanıtları ortaya başararak. Burada bir model aşı nanoparçacık sistemi olarak ICMVs kullanarak, biz partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli ölçümleri ve boşaltma LN parçacık ticareti izleme cryosectioned dokuların 7 konfokal görüntüleme kullanan (dLNs dahil) aşı nano-formülasyonlar karakterizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır. Buna ek olarak, lusiferaz sentezleyen bir antijen-özgül CD8 + T hücrelerinin 9,10 adoptif nakli sonrasında farelerde CTL yanıtlarının genişleme analiz bir bütün hayvan görüntüleme tabanlı bir yöntem sunulmaktadır. Son olarak biz denanopartiküller 6,9 ile aşılanmış farelerde endojen T hücresi tepkilerinin uzunlamasına ölçümü için periferal kan tek-çekirdekli hücreleri (PBMC), çizici tetramer boyaması.
ICMVs daha sonra kimyasal olarak çapraz bağlayıcı ditiyol 6 lipid tabakaları içinde çapraz bağlama maleimid-işlevselleştirilmiş fosfolipid baş grupları tarafından stabilize edilir çok katmanlı yapılar, içine basit lipozomlar kontrol füzyon tarafından sentezlenen bir lipid bazlı nanopartikül formülasyonu vardır. ICMVs sentez edildikten sonra, nano partiküllerin küçük bir kısmı parçacık boyutuna ve zeta potansiyeli, dinamik ışık saçılımı (DLS) sistemi ve zeta potansiyeli analizcisi ile (parçacıkların, yani, yüzey yükü) belirlemek için kullanılabilir. Difüzyon katsayısı belirlenmesi ve parçacıkların 11 hidrodinamik boyutu izin parçacık süspansiyonları ışık saçılması DLS ölçer değişiklikler. Toplu sentezine toplu tutarlı parçacık büyüklüğü sağlanması önemlidirparçacık boyutu yana APCler 12,13 tarafından dLNs ve daha sonra hücre içine kabul edilmesine aşı parçacıkların lenf boşaltma etkileyen ana faktörlerden biridir. Buna ek olarak, zeta potansiyeli partikülleri ve partikül yüzey yükünün 11 elektroforetik hareketlilik belirlenmesini sağlayan bir elektrik akımı uygulanır parçacık hızını ölçerek elde edilebilir. Parçacıkların yüzey yükü depolama sırasında ve in vivo uygulama 14,15 sonra parçacık dağılım üzerinde doğrudan etkisi vardır koloidal istikrarı belirler çünkü parçacıkların tutarlı zeta potansiyeli değerlerin sağlanmasında çok önemlidir. DLNs partikül yerelleştirme izlemek amacıyla, ICMVs lipofilik boyalar ve kovalent etiketli antijenler de dahil olmak üzere istenilen floroforlar ile etiketli olabilir. Aşılamadan sonra, fareler, dLNs rezeke, çeşitli zaman noktalarında ötenazi cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile analiz edilebilir. Bu teknik lenfatik DraI görselleştirme sağlarnanoparçacık aşı taşıyıcıları ve dLNs antijenin hem eğirme. Daha önce 7 gösterildiği gibi doku bölümleri ilave olarak antijen ve germinal merkezlerin oluşumu ile bağlantılı hücre türleri gibi floresan etiketli antikorlar ve daha fazla bilgi elde etmek için kullanılan ile boyanmış olabilir.
Parçacık sentezi optimize edilmiştir ve dLNs insan ticareti onaylandıktan sonra, in vivo CTL genişleme aydınlatılması doğrulamak için önemlidir. Nanoparçacık aşılamaya verdikleri yanıt olarak antijene özgü CD8 + T hücrelerinin ortaya konmasını analiz etmek amacıyla, detaylı bir immünolojik analizler sağlar OVA 257-264 peptit (SIINFEKL) immünodominant CD8 + T hücre epitopu ile bir model antijen, ovalbümin (OVA) kullanmıştır Başlangıç aşı geliştirme 16,17 için antijen-spesifik T hücresi tepkilerinin. Özel olarak, genleşme ve antijene özgü CD8 + T hücrelerinin göç dinamiklerini sorgulamak için, biz oluşturulan adresT-hücresi reseptörü (H-2K ile birlikte b) SIINFEKL için spesifik (TCR) ile CD8 + T hücreleri sahip OT-I transgenik farelerin transgenik fareler (Luc), lusiferaz sentezleyen ateşböceği geçerek çift transgenik fare modeli. Bu OT-I / Luc Farelerden, lusiferaz sentezleyen, OT-I, CD8 + T hücreleri, izole edilebilir ve saf C57BL / 6 farelerine adoptif transfer için hazırlanmıştır. Tohumlanmış sonra, OVA-içeren nanopartiküller ile başarılı bir aşı, bir bütün hayvan görüntüleme sistemi 9,10 ile biyoışıldama sinyalinin izlenmesi ile takip edilebilir şekilde nakledilen T hücrelerinin genişlemesine neden olur. Bu non-invazif tüm vücut görüntüleme tekniği uzunlamasına bir şekilde periferal dokularda T hücresi lenfoid dokularda genişleme ve yayılması ilgili işlemleri ifşa son 18-20 diğer viral veya tümör antijenleri ile kullanılmıştır.
Adoptif transfer antijene özgü CD8 + T hücre analizi, tamamlayıcı, endogenoBize T hücresi tepkileri kullanıldığında, aşılama dört florofor ile işaretlenmiş MHC-sınıf I molekülleri içeren bir peptit-MHC kompleksi tetramer, peptit epitopları ile yüklü olan peptid ana histokompatibilite kompleksi (MHC) tetramer denemesi 21 ile incelenebilir yayınlamak bir antijen-spesifik bir şekilde, TCR ve etiket, CD8 + T hücrelerini bağlamak için. peptid-MHC tetramer denemesi lenfoid ve periferik dokularda antijen spesifik CD8 + T hücrelerini teşhis etmek için, terminal Otopsi çalışmaları ya da seri kan çekilir elde edilen periferal kan mononükleer hücreleri (PBMC) ile uzunlamasına çalışmalarda da gerçekleştirilebilir. Peptid-MHC tetrameri ile lenfositlerin boyama sonra, akış sitometri analizine CD8 + T-hücreleri arasında kendi frekans CTL'lerin fenotipinde veya nicelenmesine detaylı analizler için gerçekleştirilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol açıklanan tüm deneyler belirlenen politika ve kurallarına göre Kullanımı ve Michigan Üniversitesi'nde Hayvanlarının Bakımı (UCUCA) Üniversite Komitesi tarafından onaylandı ve yapıldı.
1. Sentezi ve Karakterizasyonu Protein ICMVs Antijen ve Adjuvan Moleküller ile Co-yüklü
- Karışım 1: 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-fosfokolin (DOPC) ve 1,2-dioleoil-sn--glisero-3-phosphoethanolamine- N 1 mol oranı - [4- (p -maleimidophenyl) bütiramit] kloroform (MPB), yığın başına 1.26 umol toplam lipit miktarı tutulması (örneğin, DOPC, 500 ug ve MPB 630 ug) 20 ml bir cam şişe (çap = 28 mm, yükseklik = 61 mm).
- Istenilen konsantrasyonda lipit solüsyonuna, örneğin monofosforil lipid A (MPLA) ya da lipofilik boyalar (örneğin, yaptığımız) gibi lipofilik ilaçlar, ekleyin. İyice ekstra kuru nitroge ile tasfiye ederek organik çözücü kaldırmakn gaz ve vakum O / N altında örnekler yerleştirerek.
- Suda çözünür ilaçlar (örneğin, protein antijenleri) ihtiva eden 10 mM Bis-Tris propan (BTP, pH 7.0), 200 ul ekleyerek lipid filminin hidratı. 10 saniye oda sıcaklığında 1 saat süre ile, her 10 dakika vorteksleyin.
- Cam içeriği, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içine ufak şişe yer örnekleri, bir buz-su banyosu içinde, 125 W / 20 kHz prob ucu sonikatör ayarı% 40 yoğunluk kullanılarak 5 dakika boyunca sürekli olarak sonikasyon aktarın.
- Her parti (çalışma konsantrasyonu 2.4 mM), girdap ve masa mikro santrifüj kullanılarak kısa bir süre santrifüje 150 mM ditiyotreitol (DTT), 4 ul ekle.
- 200 mM CaCI2 40 ul ekleyin ve pipet (çalışma konsantrasyonu 33 mM) ile karıştırın. DTT ile lipit katman MPB-ihtiva eden çapraz bağlanmasını sağlamak için 1 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- Santrifüj numuneleri 15 dakika için 20,000 x g'de, ddiH 2 O 200 ul supernatant, ve tekrar süspansiyon kaldırma
- Adımı yineleyin 1.7 ve santrifüj yeniden ikinci ddiH 2 O yıkamadan sonra süpernatanından CaCl 2, reaksiyona girmemiş DTT ve kapsüllenmemiş kargo malzemelerini çıkarmak için.
- DdiH 2 O 2 kDa polietilen glikol-tiol (PEG-SH), 10 mg / ml hazırlayın PEG-SH çözeltisi 100 ul her bir ICMV örnek yeniden süspanse edin ve 30 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
- İki ddiH 2 O yıkar (adım 1.7) gerçekleştirin ve 4 ° C'de son ICMV PBS pelet ve mağaza tekrar süspansiyon. Parçacıklar uzun süreli depolamadan sonra dibe olabilir önce ICMV süspansiyonu karıştırmak, kullanmak için.
- Partiküllerin karakterizasyonu için, her partiden ICMVs küçük bir kısım (~% 10) kaldırıp ddiH 2 O, 1 ml bir toplam hacim içinde ayrı ayrı seyreltik Bir Zetasizer hücresi ve ölçü parçacık boyutu, polidispersite indeksi ve DLS ve (imalatçının protokolüne göre) zeta potansiyeli ölçüm sistemi kullanılarak numunelerin zeta potansiyeli tek bir örnek yerleştirin.
Ve Lenf Nodu Boşaltma 2. Sınav Konfokal Mikroskopi ile ICMVs Floresan-etiketli
- ICMVs hazırlanması florofor-etiketli antijen ve lipofilik bir floresan boya ile yüklenir
- Üreticinin talimatlarına uygun olarak, ovalbümin Alexa Fluor 555-süksinimidil ester ile reaksiyona sokulmaktadır gibi florofor-etiketli protein, hazırlayın.
- Lipid kabuk fluorofor ile etiketlenmiş ICMVs hazırlamak için, lipofilik floresan boya (örneğin, 1,1-dioktadesil-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, () yaptı) (lipit filmin hazırlanması sırasında Adım ekleme 1.2)% 0.05 molar lipid miktarda. Lipid filmi hidrasyon (Basamak 1.3), florofor etiketli antijen ihtiva eden kullanımı tamponu ve tam ICMV sentezi için adımlar 1,4-1,11 belirtildiği gibi.
- Kuyruk dibinde nanopartiküllerin deri altı uygulama
- Indüksiyon odasında u ile donatılmış kontrollü bir akış buharlaştırıcı kullanılarak fare anestezisiIACUC göre% 3 izofluran ve oksijen akışının 1.5 L / dak tilizing hayvan protokolü onayladı. Fare bilinçsiz sonra, enjeksiyon yerinde optimal erişime izin ve hayvan rahatsızlığı en aza indirmek için kapalı giyen anestezi hızlı bir şekilde önce aşağıdaki adımları uygulayın. Alternatif olarak, anestezi korumak için uygun bir uydurma burun konisi kullanın. Farenin uzunluğu 5 dakika için anestezi uygulanır ise, işlemden sonra tahrişi en aza indirgemek için gerekli olan göz madeni uygulanır.
- Sterilize ve deri altına iğne görselleştirmek için kullanılabilir görebilir deri, küçük bir yama ortaya çıkarmak için kürk Bölüm ıslak saç ıslak% 70 etanol ile kuyruğun tabanına püskürtün.
- Istenen antijen miktarı ve PBS içinde aşı dozu, 100 ul başına yardımcı madde ihtiva eden parçacık püskürtme süspansiyonu hazırlayın (örneğin, 10 ug OVA ve enjeksiyon doz 100 ul başına 0,3 ug MPLA son 6,9 kullanılmıştır).
- Parçacık süspansiyon int Beraberlikoa bir 27-29 G iğne ile şırınga ve kuyruk dibinde iğneyi (~ çizgisi 5 mm) eğim ile yukarı bakacak ve partikül süspansiyonu 22 50 ul enjekte edilir.
- Aşırı geri akışı önlemek ve iğneyi çekin eşitlemek için baskı için birkaç saniye bekleyin. Her iki drenaj kasık LN hedef kuyruk tabanının diğer tarafta enjeksiyon tekrarlayın.
- Konfokal mikroskobu ile lenf nodu cryosections hazırlanması ve incelenmesi.
- Bir IACUC hayvan protokolü onayladı göre uyarılan pnömotoraks ardından CO 2 boğulma ile fare, Euthanize. Bedoya 23 gösterilen protokole uygun olarak kasık lenf nodları ekstrakte edin ve 4 ° C'de PBS içinde 1 ml dokuları yerleştirerek kan yıkayın.
- Dokularıyla dokulardan PBS emilmesini ve doku cryomolds doku yer (10 x 10 x 5 mm3) Ekim ortamı 24 donan üstüne önceden doldurulmuş. Yapış tis dondurmak30 saniye için sıvı azot içinde blok dava. Seçenek olarak ise, 30 dakika boyunca kuru buz üzerinde doku bloğu yerleştirin. ° C derin dondurucuda -80 dondurulmuş doku saklayın.
- -20 ° C'de 24 ayarlanmış bir kriyostat 5-10 mikron kalınlığında doku bölümleri kesin.
- Gerekirse, immunofloresan etiketleme gerçekleştirmek ve daha önce 24 gösterildiği gibi konfokal mikroskobu ile doku inceleyin.
Antijen-spesifik 3. İzleme Genişleme, Tüm Hayvan Görüntüleme ile Nanopartikül Aşı sonrası CD8 + T Hücreleri Lusiferaz-ifade
- OT-I / Luc transgenik farelerden OVA257-264-spesifik, lusiferaz sentezleyen CD8 + T hücrelerinin izolasyonu
- CO 2 boğulma ile bir OT-I / Luc transgenik fare Euthanize ve bir IACUC göre pnömotoraks hayvan protokolü onayladı neden olur. Pankreas 23 doku ayrılmakta dikkatle periton boşluğuna erişim ve steril bir şekilde dalak Hasat vedoku kültürü kaputu transferi için 4 ° C PBS +% 2 FBS içinde 5 ml bir yer.
- (Bir seferde 3 dalak kadar) 50 ml konik santrifüj tüpü üzerinde 70 mikron naylon süzgeç üzerinde dalak yerleştirin. 3 ml şırınga bir dalgıç kullanarak, süzgeç vasıtasıyla hücrelere eziyet.
- Piston ve PBS +% 2 FBS ile süzgeç yıkayın ve atın. 300 x g, 10 dakika boyunca, 10 ml / 50 ml tüp içinde dalak toplam hacmi getirmek hemositometre ile saymak için hücre süspansiyonu küçük bir örnek alır ve santrifüjlenir.
- Ticari olarak mevcut olan manyetik negatif seçim seti kullanılarak, imalatçının talimatları izlenerek CD8 + T hücre popülasyonu izole eder.
- Hücrelerin PBS ile yıkandıktan sonra, izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin sayısı. Izole edilmiş CD8 + T hücrelerinin saflığını değerlendirmek için, daha sonra αCD8 APC antikorun 20 ul, 10 dakika süre ile, fare CD16 / 32 antikoru (0.025 mg / ml) 20 ul ~ 20.000-30.000 hücrelerin inkübe (0.005 mg / ml) ve 30 dakika boyunca inkübe edin. PeBSA a / h PBS içinde 4 ° C'de +% 1 Bütün inkübasyonlar, rform. Akım sitometri analizi 25 gerçekleştirin.
- Genişleme sonrası aşılama evlatlık izole CD8 + T hücrelerinin transferi ve görselleştirme
- Intravenöz kuyruk damarından 22 (gün -1) ile PBS içinde 200 ul hacim içinde 1-10 x 10 5 hücre uygulanmasıyla saf C57BL / 6 farelerine izole OT-I / Luc CD8 + T hücrelerinin adoptif transferini gerçekleştirir. C57BL / 6 farelerde bu kürk ve siyah deri yamaları dikkate alındığında bioluminescent sinyal engel olabilir, traş albino C57BL / 6 fareler bu çalışmalar için idealdir.
- Daha önce (bölüm 2.2) açıklandığı gibi bir gün (gün 0) sonra aşı yönetmek.
- Intraperitonal PBS 300 ul hacim içinde kg fare vücut ağırlığı başına luciferase 150 mg uygulayın. 10 dakika sonra, (aşama 2.2.1 gibi) izofluran fareler anestezi ve 5-10 dakika w biyoışıldama sinyali alarak OT-I / Luc CD8 + T hücreleri görselleştirmekBir bütün hayvan görüntüleme sistemi i (IVIS, detaylı talimat Wilson 26 bakınız). Uzunlamasına çalışmalar için gerekli tekrarlayın.
Analiz PBMC'ler 4. Peptid-MHC tetramer boyama antijene özgü CD8 + T hücreleri,
Not: Aşağıdaki protokol prosedürü adoptif adoptif transfer olmadan OT-I / Luc CD8 + T hücreleri ya da C57BL / 6 fareler ile transfer C57BL / 6 fareleri kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Aşılamadan sonra, arzu edilen bir zaman noktasında, K 2 EDTA ile kaplanmış bir tüp içine submandibuler kanama tekniği 27 vasıtasıyla farelerden kan yaklaşık 100 ul (4-6 damla) toplamak ve pıhtılaşmayı önlemek için birkaç kez ters çevirin.
- Bir mikrosantrifüj tüpüne kan 100 ul aktarma liziz tamponu için 1 ml ekleyin ve kırmızı kan hücrelerini (RBC) ortadan kaldırmak amacıyla 2 dakika ila 3 inkübe edin. Santrifüj örnekleri 1,500 xg'de 5 dakika boyunca ve supernatant çıkarın. Yine de pelet halinde(RBCs eksik kaldırılmasını belirtir) kırmızı ppears, lizis tamponu kısa bir inkübasyon (<1 dakika) ile parçalama adımı tekrarlayın.
- 5 dakika boyunca 1,500 x g'de 1 (/ hac BSA, PBS +% 1) FACS tamponu ilave edildi ve santrifüj ile geriye kalan PBMC'ler yıkayın.
- Aspire süpernatan ve spesifik olmayan ve FcR aracılı antikor engellemek için fare CD16 / 32 antikorunun 20 ul örnek (0.025 mg / ml) yeniden süspanse edin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.
- 4 ml yuvarlak dipli FACS tüpler içine mikrosantrifüj tüpler hücreleri aktarın. Her bir örnek için, üreticinin spesifikasyonlarına göre OVA Tetramer-SIINFEKL-PE çözelti B, H-2K 20 ul eklenir ve buz üzerinde 30 dakika inkübe edilir.
- Antikor kokteyli hazırlayın (örneğin, αCD8-APC, αCD44-FITC ve αCD62L-PECy7 antikorlar (sırasıyla 0.005, 0.005, ve 0.002 mg / ml konsantrasyon)). Her bir deney örneği 20 ul ekleyin ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir. La tarafından tek fluorofor kontrolleri hazırlayınYukarıda belirtilen konsantrasyonda her florofor ile işaretlenmiş tetramer veya antikor ile hücreler Beling.
- FACS tamponu ile 2 kez yıkanır ve DAPI 2 ug / ml ihtiva eden FACS tamponu nihai pelletini. analizi (ayrıntılar ve örnekler Scheffold 25 bulunabilir) sitometri hücreleri artık akışı için hazırız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ICMVs sentezinde yer alan basamaklar, Şekil 1 '6'da tasvir edilmiştir. Kısaca, bir lipofilik ilaçlar ya da floresan boyalar ihtiva eden bir lipid filmi hidrofilik ilaçların mevcudiyetinde hidratlanır. Örneğin Ca2 + gibi iki değerli katyonlar, çok katmanlı vezikülleri içine anyonik lipozomların füzyon sürmek için ilave edilir. DTT gibi, yağ katmanları apposing, ve son olarak, dış maleimid grupları, kalan "elyaf" maleimid işlevselleştirilmiş lipidlere eklenir ditiyol çapraz bağlayıcı, tiollenmiş-PEG parça ile bir reaksiyon söndürülür. Her bir yığının küçük bir kısmı hali hazırda DLS ve zeta potansiyeli analiz sistemi ile parçacık boyutuna, polidispersite endeksi, ve zeta potansiyeli belirlenerek kalite kontrol ölçümlere tabi tutulabilir. Elde edilen tanecikler, OVA'ya kapsülleyici p için ortalama 130 ± 20 nm büyüklüğü, 0.22 ± 0.02 polidispersite indeksi ve -54 ± 3 mV zeta potansiyeline sahip oldukça homojen olanürünleri (Şekil 1B ve 1C). Parçacıkların kuru ağırlığa göre ölçülen parçacıkların tipik verim, ~ 50% 6'dır.
Yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak, ICMVs in vivo olarak, antijen ve nanoparçacık teslimat canlandırılmasına olanak tanıyan bir florofor-etiketli protein antijeninin ve flüoresan lipofilik boya ile birlikte yerleştirilebilir. Çözünür biçimde karşı ICMVs antijen teslimat kalıplarını karşılaştırmak için, C57BL / 6 fareleri 100 ya da çözülebilir ya da ICMV formülasyonları etiketli mi, ve boşaltma kasık LN OVA AlexaFluor555-etiketli ug çeşitli eksize edildi kuyruk tabanında sc uygulanmıştır DLN doku cryo-bölümlerin hazırlanması için zaman noktaları. Konfokal mikroskobu ile görselleştirme çözünür antijen hızlı bir şekilde 4 saat içerisinde dLNs ulaşılabilir değil, aynı zamanda 24 saat (Şekil 2), 7 ile çok hızlı bir şekilde temizlenir olduğunu göstermiştir. Bunun aksine, OVA yüklenmiş ICMVs devamı birikimi ile, 24 saat ile dLNs periferinde saptandıdLNs OVA-ICMVs büyük miktarda biriktirilmesi, 4. günde incelenmiştir (Şekil 2). Konfokal mikrograflar aynı zamanda AlexaFluor555 etiketli OVA ko-lokalizasyonunu göstermiştir ve ICMVs ICMVs 7 içinde kapalı tutulan protein antijenleri ve diğer immün sistemi uyarıcı maddeler kararlı ko-iletilmesinin mümkün olduğunu düşündürmektedir dLNs olan ICMVs etiketli yaptı.
OT-I / Luc transgenik fare CD8 + T hücrelerinin izolasyonu hali hazırda Şekil 3. ~ 8-12 x 10 6 hücre, bir fare dalak başına sonuçta, ticari olarak mevcut olan manyetik negatif seçim kiti ile yapıldı adoptif transfer edilen C57BL / 6 fareleri göstermektedir edilebilir 5 x 10 5 OT-I / Luc CD8 + T gün -1 'de hücreler ve 10 ug OVA ve çözünür ya da ICMV formülasyonlar ya MPLA 0.3 ug sc verilmesi ile 0. günde bağışıklaştırılmış. IVIS ile Biyoparlaklık görüntüleme aşılama az OT-I / Luc sinyalini gösterdi 0 önce günde gerçekleştirdi. Ancak, gün 4 sonrası aşılama yoluyla, fareler bağışıklıOVA / MPLA-ICMVs kuyruk baz bölgesini 28 drenaj LN olan inguinal LN, içinde sağlam biyoparlaklık sinyal vardı. Bunun aksine, aşı çözünebilir formu ile bağışıklık kazandırılmış farelerde inguinal dLNs olan OT-I / Luc CD8 + T hücrelerinin çok düşük genişleme göstermiştir.
Model antijen olarak OVA kullanılması immünodominant OVA257-264 peptidi (SIINFEKL) için belirli bir endojen CD8 + T hücrelerinin genişletilmesi ve izlenmesine olanak sağlar. Örneğin, C57BL / 6 fareleri 0, 21 aşılanmıştır, ve SK 10 ug OVA yönetim ve ICMVs ya da çözünür formda ya da 0.3 ug MPLA 35 ve PBMC CD8 + T-hücreleri arasında SIINFEKL-özgül CD8 + T hücrelerinin frekansı SIINFEKL-lH-2K B tetramer-PE. Şekil 4A ile boyanmış PBMC'lerin akış sitometrik analizi ile tespit edilmiştir SIINFEKL-lH-2K B tetramer gün 41 6 PBMC'ler CD8 + T-hücreleri arasında + hücrelerinin saçılım sitometri Örnek akışını göstermektedir. Figüre 4B SIINFEKL-tetramer +, CD8 + T-hücreleri arasında merkezi bellek fenotip ile CD62L + CD44 + hücreleri için temsili dağılım grafiklerini gösterir. Şekil 4C'de gösterilen PBMC'ler haftalık izleme ICMV aşısı önemli ölçüde daha güçlü bir CD8 + T hücresi tepkilerini ortaya ise eriyebilen OVA aşısı CD8 bir zirve% 28 SIINFEKL-tetramer + T hücrelerini elde etmek, antijene özgü CD8 + T hücrelerinin çok az genişlemesini ortaya çıkardığım göstermektedir + gün ile T hücre popülasyonu 41 6. Burada sunulan tetramer boyama protokolü kullanılarak, muamele edilmemiş veya PBS ile tedavi edilmiş hayvanlarda (n = 15),% 0.04 OVA-spesifik T hücrelerinin ± 0.11% GEÇMİŞİ sıklığı gözlenmiştir, ve algılayabilir (veriler gösterilmemiştir p-değeri <0.005)% 0.05 ±% 0.46 kadar düşük bir antijene özgü CD8 + T hücresi frekanslarda istatistiksel olarak önemli bir artış.
Antijenin Şekil 2. Analiz konfokal mikroskobu ile lenf düğümlerine drene. C57BL / 6 fareleri, ya çözelti ya da ICMVs (mavi renkli gösterilmiştir) 100 ug florofor ile konjüge edilmiş (kırmızı ile gösterilmiştir) OVA ve 5 mg MPLA ile immünize edildi. Drenaj kasık lenf nodları, belirtilen zaman noktalarında çıkarıldı cryosectioned ve konfokal mikroskobu ile görüntülendi. Temsilci konfokal mikrograflan gösterilir. Pembe sinyaller OVA ve ICMVs eş-lokalizasyonu gösterir. Bu rakam Ay ve ark. 7 den modifiye edilmiştir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. 
Şekil 3. monitorinAşı. C57BL / 6 albino fareler sonra gr T hücre artışı adoptif gün -1 'de 5 x 10 5 Luc + OT-I, CD8 + T hücreleri ile iv transfer edilmiştir. 0. günde, hayvanlar 10 OVA ug ve 0.1 ug MPLA biri gibi çözülebilir veya ICMV formülasyonları ile tatbik edilmiştir. hayvanlar izofluran ile anestezi ve (150 mg / kg, 300 ul enjekte ip) IVIS ile satın alınmıştır Luc + OT-1 CD8 + T hücrelerinden ve biyoışıldama sinyal luciferase ile uygulandı. Bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam. 
ICMV aşılamadan sonra endojen OVA-spesıfik CD8 + T hücrelerinin Şekil 4. Genişletme. C57BL / 6 fareleri, i, ya 10 ug OVA ve 0.1 MPLA ug ile aşılanmıştırn, çözelti ya da 0, 21 ICMVs ve 35 (oklar) görülmektedir. Periferik kan mononükleer hücreler arasında OVA-spesifik T hücrelerinin frekansı SIINFEKL-MHC-I tetramer + CD8 + T hücrelerinin akış sitometrik analizi ile, zaman içinde değerlendirildi. (A) gün 41 göster SIINFEKL-MHC-I tetramer +, CD8 + T hücreleri ve (B) 'CD62L + CD44 + hücreleri, merkezi bellek T-hücreleri arasında işaretleyici bireysel farelerden saçılım sitometri Örnek akışı. (C), T hücresi genişleme ve daralma genel kinetiği gösterilmiştir. Bu rakam Ay ve ark. 6 modifiye edilmiştir. rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu makalede sağlanan protokol ICMVs olarak adlandırılan sentezi ve yeni bir lipid bazlı nanopartikül sisteminin karakterizasyonu açıklanmaktadır, ve antijene spesifik CD8 + T hücresi tepkilerini indükleme nanopartikül bazlı aşı formülasyonlarının etkinliğinin doğrulanması için bir işlem sağlar. ICMV sentezi genellikle kaybı ile sonuçlanan, tipik olarak hazırlanması için, organik çözücüler gerektiren diğer yaygın olarak kullanılan polimer nano partikül sistemleri (örneğin, poli (laktid-ko-glikolit) asit parçacıkları) ile karşılaştırıldığında önemli bir avantaj, tüm sulu bir durumda, içinde tamamlanır protein antijenikliği 29,30 antijenleri. Buna ek olarak, geniş bir stabilite ve kabiliyeti ICMVs yarar, böylece APC '31,32 içinde aynı hücre içi bölüm için hedeflenen antijen ve yardımcı maddeler eş teslim izin veren hidrofobik ve hidrofilik hem de moleküller 6 kapsüllemek için. Bir örnek aşı nanopartikülün olarak ICMVs kullanarak, burada prosedürleri belirttiğimiz(1) nanoparçacık sentezi ve karakterizasyonu, dLNs için nanopartikül drenaj (2) doğrulama ve antijene özgü CD8 + T hücre karşılıklarının ortaya çıkartıldığını incelenmesi (3) invazif olmayan bir biyoışıldama görüntüleme tekniği ve (4) peptid-MHC kullanılarak PBMC'lerden üzerinde tetramer boyama deneyi.
Onlar büyük ölçüde lenfatik boşalmasını etkileyen ve in vivo uygulanması üzerine APC'lerin tarafından alımı gibi özellikle parçacık boyutu ve yüzey ücret, partiden partiye nanoparçacık sentezinde bütünlüğü sağlamak için önemlidir. DLS ve zeta potansiyeli analiz parçacık boyutu ve yüzey yükü kalite kontrol hızlı yöntemler sağlar. Bireysel partiküllerin morfolojisi hakkında daha ayrıntılı analizler için, bu teknikler gibi vitrifiye sulu tabaka 6,33,34 yılında "yumuşak" parçacıkların morfolojisini koruyan cryo-elektron mikroskobu (cryo-EM) olarak, yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu ile tamamlanabilir . Antijen ve adjuv kapsülleme verimliliğikarıncalar belirlenmiş ve sentezler arasında düzgün tutulmalıdır. Protein antijenleri bant yoğunluğuna dayalı absorbance- ve floresan bazlı protein miktar kitleri kullanılarak ölçülebilir ya da 36 boyama, SDS-PAGE ve Coomassie 35 veya gümüş kullanılarak analiz edildi ve sayısal olabilir, oysa bu MPLA gibi yardımcı maddeler, bir fluorofor 6 ile etiketlendi edilebilir . Optimal reaktivite tam sentezi için gerekli olan parçacık hazırlık tutarsızlıklar, süresi dolmuş veya kötü depolanan reaktifler kaynaklanabilir. Bu amaçla, maleimide- ve tiyol-işlevselleştirilmiş reaktifler sık dondurma-eritme çevrimleri olmayan -80 ° C'de, küçük parçalar halinde tutulmalıdır.
100'den küçük nm genellikle etkili bir büyük parçacıklar (yani 500-2.000 nm) ise, dLNs 13 lenf damarlarına ve trafik girmek için düşünülen partiküller doku yerleşik DC'lerin 12,37 aktif taşıma gerektirir. Bizim ellerde, 150-2 arasında değişen hidrodinamik boyutu ile ICMVs50 verimli lokalize ve kapsamlı CTL ve hümoral tepkiler 6,7 sonuçlanan DLN kalıcı nm. İdari 24 saat içinde, ICMVs dLNs bölgesindeki subkapsüler sinüs makrofajlar ile ilişkiliydi ve akış sitometrik gün 1 üzerinde yapılan analizler, 4 dLNs içindeki en ICMVs Langerhans ile ilişkili parçacıkların sadece küçük bir kısmı olan LN yerleşik APC 'ler tarafından alındığını göstermiştir ve dermal DC'ler 7. Bu sonuçlar, pasif taşıma dLNs için ICMV ticareti önemli modu olduğunu göstermiştir. Bu çalışmalar dLNs kendi yerelleştirme ve dağıtım modellerini tanımlamak için fluorofor etiketli nanopartiküller ve protein antijenleri kullanmışlardır. Cryosectioned dLNs mikroskopisi LN yapılarının belirlenmesi için ek immunofloresan histokimya veriyor (örneğin, GL-7 germinal merkezlerde ifade) ve formülasyon bileşenlerinin (örneğin, DCler ile etkileşim hücreler - CD11c, makrofajlar - F4 / 80, CD169 ve B- hücreler #8211; B220) 7,9. Bu teknik, 7,9 alımı parçacık sorumlu APC 'lerin alt kümelerini belirginleştiren dLNs hasat hücre analizleri akış sitometrisi ile paralel olarak gerçekleştirilebilir ya da tüm hayvan görüntüleme floresan sinyalleri güçlü ve doku otofloresansı sinyalleri müdahale etmemesi koşuluyla, dLNs 38,39 enjeksiyon sitesinden aşı teslim ölçmek için.
Etkin aşılama sağlam bir aktivasyon ve aşılama, ardından Bioluminescent antijen-spesifik transgenik T hücrelerinin adoptif nakli sonrasında tüm vücut biyoluminesans görüntüleme ile takip edilebilir antijen-spesifik sitotoksik T hücrelerinin, bir genişleme gerektirir. Bu yöntemin bir yararı, böylece imünolojik analizler için gerekli hayvan sayısını azaltmak ve zahmetli hücre izolasyon prosedüründe kullanımını önler, uzun bir süre için aynı hayvanlarda CTL ticareti tekrar görselleştirilmesi için potansiyeles. Bu görüntüleme tekniği kullanarak, son zamanlarda ICMVs pulmoner yönetim protein antijen ve immünostimülatör ajan ile birlikte yüklü olduğunu göstermiştir akciğer antijene özgü CD8 + T hücreleri ve mediastinal LN ve uzak mukozal dokulara CTL sonraki yayma güçlü ortaya çıkarma yol açmıştır , Peyer yamaları, çekum ve vajinal yolları 9 olmak üzere. Akış sitometrik bu yeni genişletilmiş CD8 + T hücreleri, 4 β 7 + integrin ekspresyonu ve mukozal viral yüklemeye 9 karşı aracılı koruyucu bağışıklık tepkiler α ile karakterize edilen bir "mukoza homing" fenotipi ile kazındı olduğunu göstermiştir. Bio-ışıldar CD8 + T hücrelerinin tamamı hayvan görüntüleme yakın zamanda Hailemicheal ve diğ., tümör antijeni peptid eksik Freund katkı maddesi içinde formüle edilmiş olduğu gösterilmiştir ile kullanılmıştır (İFA, yağ-içinde-su emülsiyonu) yerinde T hücrelerinin sekestrasyon sonuçlandı Enjeksiyonuzakta tümör kitleler aşı "depo" ile, T hücre disfonksiyonu ve silme 40 yol açar.
Tetramer boyanması, çeşitli aşı formülasyonlarının 21 de elde edilen endojen CTL yanıtlarının seviyesini ölçmek için geçmişte yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu teknik aynı zamanda uygun ve genel olarak özel olarak tümör ile ilgili özel antigenlere 41,42 CTL yanıtları teyit etmek için erken insan kanser immünoterapisi klinik deneylerde kullanılmaktadır. PBMC'ler kolay farelerden toplandı ve akış sitometrisi için hazırlanabilir; Bu şekilde daha geniş analiz gerektiren, önce ya da kanser modellerinde tümörleri olan belirtildiği gibi, ancak, bunun nedeni depo oluşturucu aşılar, hücre lokalizasyonu, T-hücre genişlemesi tam kapsamını ortaya çıkarmak olmayabilir. Akış sitometrisi ile bu yöntemin uyumluluk bellek işaretleri (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2 ve KLRG-1) antijen-spesifik T hücrelerinin saptanması efektör, merkezi bellek ve efektör bellek ce ayırt edilmelerine olanak(son değerlendirme 46,47 özetlendiği gibi) tetrameri + T hücrelerinin 43 veya uzun ömürlü doku ikamet CTLlerin 44,45 arasında lls. Yüksek genişletilmiş antijene spesifik T hücreleri, bağışıklık tükenme 48,49 belirtileri sergileyebilir Bununla birlikte, tetramer boyama tahlili, CTL yanıtlarının sadece ilk değerlendirmesini sağlar. CTL karşılıklarının Fonksiyonel değerlendirme az epitopları ile lenfositlerin ex vivo stimülasyonu sonrasında enzim bağlantılı immünospot (ELISPOT) 50 ya da hücre içi sitokin boyama 51 ve perforin ve granzim B 52 ve hücre dışı ve hücre içi seviyelerini ölçerek muayene sitokin salınımı ile gerçekleştirilebilir Degranülasyon 53 üzerine CD 107a ve CD107b sentezlenmesi. Buna ek olarak, CTL sitolitik fonksiyonu, in vitro veya in vivo 54-56 yapılan CTL sitotoksisite deneyleri ile değerlendirilebilir.
Hümoral immün tepkilerinin indüklenmesinenanoparçacık aşısı, CD8 + T hücresi paralel olarak incelenebilir sonra burada sunulan analiz yapılmıştır. Antikor afinite ve epitop tanımanın genişliği kaotropik madde kullanımı ile ELISA protokolü değiştirerek değerlendirilebilir ise antikor titerleri, enzim-bağlı immünosorbent deneyi (ELISA), geleneksel bir yöntem ile analiz edilebilir (örneğin, üre), antikorun sırasında bağlanabilen Yüzey ve yüzeylerde, sırasıyla 7 olarak antijenlerin içinde alt alanların kullanımı. Güçlü bir humoral karşılıklarının ortaya çıkartıldığını foliküler yardımcı CD4 + T hücrelerinin genişlemesini (T FH) 57 gerektirir. Parçacık bir aşılamaya verdikleri yanıt olarak T fh hücrelerinin büyümesini incelemek için, Burada sunulan protokol kolaylıkla saf alıcı farelere adoptif hücre transferi ve ardından OT-II transgenik farelerden antijene özgü CD4 + T-hücreleri, izole edilmesi için adapte edilebilir. Aşılamadan sonra, lenfoid dokular hasat edilebilir ve akış sitometrik analiz caydırmak için analiz(kendi CD4 + CXCR5 + PD-1 + fenotip tarafından tanımlanan) antijen-spesifik T hücrelerinin fh maden genişleme 7..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Perkin Elmer, bu makalenin yayınlanması sırasında katlanılan üretim maliyeti sağladı.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüsü 1K22AI097291-01 hibe tarafından desteklenen ve Ödül Numarası UL1TR000433 altında Ulusal Sağlık Enstitüleri Translasyonel Bilimler ilerlemek için Ulusal Merkezi tarafından yapıldı. Biz de aşı nanopartiküller ve OT-I / Luc transgenik fareler üzerinde ilk çalışmaları katkılarından dolayı Fred Hutchinson Kanser Merkezi'nde MİT ve Prof. Matthias Stephan Prof. Darrell Irvine kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
References
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
- Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
- Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
- Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
- Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
- Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
- DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
- Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
- Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
- Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
- Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
- Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
- Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
- Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
- Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
- Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
- Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
- Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
- Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
- Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
- Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
- Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
- Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
- Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
- Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
- Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).
