Introduction
Traditionel vaccine udvikling har primært ansat den empiriske tilgang trial-and-error. , Med den seneste udvikling i en bred vifte af biomaterialer og opdagelsen af molekylære determinanter for immun aktivering, er det nu muligt at rationelt designe vaccineformuleringer med biofysiske og biokemiske signaler afledt af patogener 1,2. Især har forskellige partikelformige drug delivery platforme blevet undersøgt som vaccine-bærere, som de kan co-loaded med subunit-antigener og immunstimulerende midler, beskytte vaccinekomponenter mod nedbrydning, og øge deres co-levering til antigenpræsenterende celler (APC'er) bopæl i lymfeknuder knuder (LNS), dermed maksimere immun stimulering og aktivering 3-5. I denne rapport beskriver vi syntesen af en "patogen-efterligne" nanopartikel-system, betegnes interbilayer-tværbundet multilamellare vesikler (ICMVs), som tidligere er blevet påvist som en potent vaccine platform;m for fremkaldelse af robust cytotoksisk T-lymfocyt (CTL) og humorale immunresponser i både systemiske og mucosale vævsrum 6-9. Især opnåede vaccination med ICMVs væsentligt forbedret serum IgG-niveauer mod en malaria-antigen, sammenlignet med vaccination med konventionelle adjuvanser (fx alun og Montanide) 7 og også fremkaldte kraftige CTL-responser mod tumorceller og viral challenge-modeller i mus 9. Her, ved hjælp ICMVs som model vaccine nanopartikel-system beskriver vi metoder til karakterisering af vaccine nano-formuleringer, herunder partikelstørrelse og zeta potentielle målinger og sporing af partikel menneskehandel til drænende LN (DLN'er) udnytte konfokal billeddannelse af cryosectioned væv 7. Derudover præsenterer vi en hel-dyr imaging-baseret fremgangsmåde til analyse af udvidelse af CTL-responser i mus efter adoptiv overførsel af luciferase-udtrykkende antigen-specifikke CD8 + T-celler 9,10. Endelig har vi deSkriveren tetramerfarvning af perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) for langsgående kvantificering af endogene T-celle-reaktioner i mus vaccineret med nanopartikler 6,9.
ICMVs er et lipid-baserede nanopartikel formulering syntetiseret ved kontrolleret fusion af simple liposomer i multilamellære strukturer, som derefter kemisk stabiliseret ved tværbinding maleimid-funktionaliseret phospholipid hovedgrupper inden lipidlag med dithiol tværbindere 6. Når ICMVs syntetiseres, kan en lille brøkdel af nanopartikler anvendes til at bestemme partikelstørrelse og zeta-potentialet (dvs. overfladeladningen af partikler) med en (DLS) systemet dynamisk lysspredning og et zeta-potentialet analysator. DLS måler ændringer i lysspredning i partikel suspensioner, der tillader bestemmelse af diffusionskoefficienten og den hydrodynamiske størrelse af partikler 11. Opnåelse konsekvent partikelstørrelse fra parti til parti-syntese er kritiskeftersom partikelstørrelsen er en af de vigtigste faktorer, der påvirker lymfe dræning af vaccine partikler DLN'er og efterfølgende cellulær optagelse af APC'er 12,13. Derudover kan zetapotentialet opnås ved måling partikelhastigheden når der påføres en elektrisk strøm, hvilket muliggør bestemmelse af den elektroforetiske mobilitet af partikler og partikel overfladeladning 11. Er vigtigt at sikre konsistente Zetapotential værdier for partikler, da overfladeladning af partikler bestemmer kolloid stabilitet, som har direkte indvirkning på partikeldispersion under opbevaring og efter in vivo administration 14,15. For at spore partiklen lokalisering til DLN'er, kan ICMVs mærkes med ønskede fluoroforer herunder lipofile farvestoffer og kovalent mærkede antigener. Efter immunisering kan mus aflives på forskellige tidspunkter, DLN'er resekteret, cryosectioned og analyseret med konfokal mikroskopi. Denne teknik muliggør visualisering af lymfatisk Dralning af begge nanopartikel vaccine luftfartsselskaber og antigen til DLN'er. Vævssnittene kan yderligere farvet med fluorescensmærkede antistoffer og anvendes til at opnå mere information, såsom typer af celler associeret med antigenet og dannelse af kimcentre som vi har vist tidligere 7.
Når partiklen syntese er optimeret og handel til DLN'er bekræftes, er det vigtigt at validere fremkaldelse af in vivo CTL ekspansion. For at analysere fremkaldelse af antigenspecifikke CD8 + -T-celler som respons på vaccination nanopartikel, har vi udnyttet en model antigen, ovalbumin (OVA), med OVA 257-264 peptid (SIINFEKL) immundominerende CD8 + T-celleepitop, som giver detaljerede immunologiske analyser af antigenspecifikke T celleresponser for den første vaccineudvikling 16,17. Navnlig at udspørge dynamikken i ekspansion og migration af antigenspecifikke CD8 + -T-celler, har vi skabt endobbelt-transgen musemodel ved at krydse ildflue luciferase-udtrykkende transgene mus (Luc) med OT-I transgene mus, som besidder CD8 + T-celler med T-celle receptor (TCR) specifik for SIINFEKL (i association med H-2K b). Fra disse OT-I / Luc-mus, luciferase-udtrykkende, OT-I CD8 + -T-celler kan isoleres og forberedes til adoptiv overførsel til naive C57BL / 6-mus. Når seeded vil vellykket immunisering med OVA-indeholdende nanopartikler resultere i udvidelse af de overførte T-celler, som kan spores ved overvågning af bioluminescens signal med et helt dyr imaging system 9,10. Denne ikke-invasive hele kroppen imaging teknik har været anvendt med andre virale eller tumorantigener i fortiden 18-20, afslører processer involveret i T-celle-ekspansion i lymfevæv og formidling til perifere væv i en langsgående måde.
Komplementær til analyse af adoptivt overført antigenspecifikke CD8 + -T-celler, endogenoos T-cellereaktioner efter vaccination kan undersøges med peptidet-major histocompatibility complex (MHC) tetramer assay 21, hvori en peptid-MHC tetramer-kompleks, bestående af fire fluorofor-mærkede MHC klasse I molekyler fyldt med peptid-epitoper, anvendes at binde TCR og label CD8 + T-celler i en antigen-specifik måde. Peptid-MHC tetramer-assay kan udføres enten i terminale nekropsi undersøgelser for at identificere antigenspecifikke CD8 + T-celler i lymfoide og perifere væv eller i langsgående undersøgelser med perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) opnået fra seriel blod trækker. Efter farvning lymfocytter med peptid-MHC tetramer, flowcytometri analyse udføres for detaljerede analyser af fænotypen af CTL'er eller kvantificering af deres hyppighed blandt CD8 + T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg er beskrevet i denne protokol, blev godkendt af University Udvalg for Anvendelse og pleje af dyr (UCUCA) ved University of Michigan og udført i overensstemmelse med de fastlagte politikker og retningslinjer.
1. Syntese og karakterisering af ICMVs Co-loaded med proteinantigen og adjuvansmolekyler
- Bland 1: 1 molært forhold af 1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) og 1,2-dioleoyl--sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p -maleimidophenyl) butyramid] (MPB) i chloroform, holde det samlede lipid beløb på 1,26 pmol pr batch (dvs. 500 ug DOPC og 630 ug MPB) i et 20 ml hætteglas (diameter = 28 mm og højde = 61 mm).
- Tilføj lipofile lægemidler, såsom monophosphoryllipid A (MPLA) eller lipofile farvestoffer (fx gjorde), til lipid- opløsningen ved ønskede koncentration. Grundigt at fjerne det organiske opløsningsmiddel ved rensning med ekstra tør nitrogen gas og anbringelse af prøverne under vakuum O / N.
- Hydrat lipidfilm ved tilsætning af 200 pi 10 mM bis-tris propan (BTP, pH 7,0) indeholdende vandopløselige lægemidler (f.eks proteinantigener). Vortex i 10 sek hver 10 min i 1 time ved stuetemperatur.
- Overfør indholdet mod glasset anbringes i et 1,5 ml mikrocentrifugerør, place prøver i et is-vandbad, og sonikeres kontinuerligt i 5 minutter under anvendelse af 40% intensitet omgivelser på 125 W / 20 kHz probe-tip-sonikator.
- Tilføj 4 pi 150 mM dithiothreitol (DTT) til hvert parti (arbejder koncentration 2,4 mM), vortex, og kort centrifuge ved hjælp af en bordplade mikrocentrifuge.
- Tilføje 40 pi 200 mM CaCl2 og blandes med pipetten (arbejdskoncentration 33 mM). Inkuber prøver ved 37 ° C i 1 time for at tillade tværbinding af MPB-holdige lipidlag med DTT.
- Centrifugér prøver ved 20.000 xg i 15 min, supernatanten fjernes, og resuspender i 200 pi ddiH 2 O.
- Gentag trin 1.7 og centrifuger igen efter den anden ddiH 2 O vask til fjernelse CaCl2, uomsat DTT og uindkapslede fragt materialer fra supernatanten.
- Forbered 10 mg / ml 2 kDa polyethylenglycol-thiol (PEG-SH) i ddiH 2 O. Resuspender hver ICMV prøve i 100 pi PEG-SH-opløsning og inkuberes ved 37 ° C i 30 minutter.
- Udfør to ddiH 2 O vaske (trin 1.7) og resuspender endelige ICMV pellet i PBS og opbevares ved 4 ° C. Inden anvendelse blande ICMV suspensionen, som partikler kan sedimentere til bunden efter længere tids opbevaring.
- Til karakterisering af partikler, fjerne en lille portion (~ 10%) af ICMVs fra hvert parti og fortyndes individuelt i en samlet volumen på 1 ml ddiH 2 O. Placer en enkelt prøve i en Zetasizer partikel celle og måle størrelse, polydispersitetsindeks, og zetapotentialet af prøverne under anvendelse af et DLS og zeta-potentialet målesystem (ifølge producentens protokol).
2. Undersøgelse af lymfeknuder Tømning af fluorescens-mærkede ICMVs med konfokal mikroskopi
- Fremstilling af ICMVs ladet med fluorofor-mærket antigen og lipofile fluorescerende farvestof
- Forbered fluorofor-mærkede protein, såsom ovalbumin omsat med Alexa Fluor 555-succinimidylester, ifølge producentens anvisninger.
- At forberede ICMVs mærket med fluorofor i lipid-shell, tilføje lipofile fluorescerende farvestof, (f.eks 1,1'-dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) under fremstillingen af lipidfilmen (trin 1.2) på 0,05% molær lipid beløb. For lipid film hydrering (trin 1.3), brug buffer indeholdende fluorophor-mærket antigen, og komplet ICMV syntese som beskrevet i trin 1,4-1,11.
- Subkutan administration af nanopartikler ved haleroden
- Bedøver mus under anvendelse af en kontrolleret strøm fordamper udstyret med en induktion kammer utilizing 3% isofluran og 1,5 l / minut oxygen flow ifølge en IACUC godkendt animalsk protokol. Når musen er bevidstløs, skal du udføre følgende trin hurtigt forud for anæstesi iført ud for at give optimal adgang til injektionsstedet og minimere ubehag for dyret. Alternativt kan du bruge en ordentlig montering næse kegle for at opretholde anæstesi. Hvis mus bedøves i mere end 5 min, gælder øjet lube nødvendigt for at minimere irritation efter proceduren.
- Spray haleroden med 70% ethanol for at rense og fugte pelsen delen det våde hår at blotlægge en lille plaster på synlig hud, som kan anvendes til at visualisere nålen under huden.
- Forbered partikelinjektion suspension indeholdende den ønskede mængde antigen og adjuvans pr 100 pi vaccination dosis i PBS (f.eks, 10 ug OVA og 0,3 ug MPLA pr 100 pi dosis injektion er blevet anvendt tidligere 6,9).
- Trække partikelsuspensionen intoa sprøjte med en 27-29 G nål og stik nålen ved haleroden (~ 5 mm fra hårgrænsen) med facet opad og injicere 50 ul af partikelsuspensionen 22.
- Vent et par sekunder for pres for at udligne at forhindre overdreven back-flow og træk nålen ud. Gentag injektionen på den anden side af halen base for at målrette både dræner lyskelymfeknuder LN.
- Udarbejdelse af lymfeknude kryosnit og undersøgelse med konfokal mikroskopi.
- Aflive musen med CO2-kvælning, efterfulgt af induceret pneumothorax ifølge en IACUC godkendt animalsk protokol. Uddrag lysken LN i overensstemmelse med forskrift demonstreret i Bedoya 23 og udvaske blodet ved at placere vævene i 1 ml 4 ° C PBS.
- Absorbere PBS fra væv med væv og placere væv i vævs- cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) fyldt til toppen med oktober frysemedium 24. Snap fryse tissue blokeret flydende nitrogen i 30 sek. Alternativt placere vævsblok på tøris i 30 minutter. Opbevar frosne væv i -80 ° C fryser.
- Skær vævssnit 5-10 um i en kryostat indstillet til -20 ° C 24.
- Hvis det er nødvendigt, udføre immunfluorescens mærkning, og undersøge vævet med konfokal mikroskopi som tidligere demonstreret 24.
3. Overvågning Udvidelse af antigenspecifikke, Luciferase-udtrykkende CD8 + T-celler efter Nanopartikel Vaccination med hele dyret Imaging
- Isolering af OVA 257-264-specifikke, luciferase-udtrykkende CD8 + T-celler fra OT-I / Luc transgene mus
- Aflive en OT-I / Luc transgene mus med CO2 kvælning og inducere en pneumothorax ifølge en IACUC godkendt animalsk protokol. Høste milten på steril måde ved at åbne bughulen og omhyggeligt afmonterer væv fra pancreas 23, ogsted i 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS for overførsel til vævskultur hætte.
- Placer milten på en 70 um nylon si over en 50 ml konisk centrifugerør (op til 3 milte ad gangen). Anvendelse af et stempel fra en 3 ml sprøjte, slibe cellerne gennem sien.
- Vask stemplet og sien med PBS + 2% FBS og kassér. Bring det samlede volumen til 10 ml / milt i 50 ml rør, tage en lille prøve af cellesuspensionen at tælle med et hæmocytometer, og centrifugeres i 10 minutter ved 300 x g.
- Under anvendelse af et kommercielt tilgængeligt magnetisk negativ udvælgelse kit, isolere CD8 + T-celle population ved at følge producentens instruktioner.
- Efter vask cellerne med PBS, tælle antallet af isolerede CD8 + T-celler. For at vurdere renheden af de isolerede CD8 + -T-celler, inkuberes ~ 20.000-30.000 celler i 20 pi muse CD16 / 32 antistof (0,025 mg / ml) i 10 minutter, hvorefter der tilsættes 20 ul αCD8-APC-antistof (0,005 mg / ml) og inkuberes i 30 min. Perform alle inkubationer ved 4 ° C i PBS + 1% vægt / volumen BSA. Udføre flowcytometrisk analyse 25.
- Adoptiv overførsel af isolerede CD8 + -T-celler og visualisering af deres ekspansion efter vaccination
- Udfør adoptiv overførsel af isoleret OT-I / Luc CD8 + T-celler til naive C57BL / 6-mus ved indgivelse 1-10 x 10 5-celler i et 200 pi volumen af PBS via intravenøs injektion i halevenen 22 (dag -1). I betragtning af, at pels og sort hud pletter i C57BL / 6 mus kan forstyrre bioluminiscerende signal, glatbarberet albino C57BL / 6 mus er ideelle til disse undersøgelser.
- Efter en dag (dag 0), administrere vaccinen som tidligere beskrevet (afsnit 2.2).
- Administrere 150 mg luciferin pr kg legemsvægt mus intraperitonealt i en 300 pi volumen af PBS. Efter 10 minutter, bedøver de mus med isofluran (som i trin 2.2.1) og visualisere OT-I / Luc CD8 + T-celler ved at erhverve bioluminescens signal i 5-10 min wed et helt dyr imaging system (IVIS; se Wilson 26 for nærmere instruktion). Gentag efter behov for longitudinelle studier.
4. Peptid-MHC tetramerfarvning af PBMC'er til analyse af antigenspecifikke CD8 + -T-celler
Bemærk: Den følgende protokol indgrebet kan foretages under anvendelse af enten C57BL / 6-mus adoptivt overført med OT-I / Luc CD8 + T-celler eller C57BL / 6-mus uden adoptiv overførsel.
- På et ønsket tidspunkt efter vaccination, indsamle ca. 100 pi blod (4-6 dråber) fra mus via submandibulære blødning teknik 27 i et rør belagt med K2EDTA og vend adskillige gange for at forhindre koagulation.
- Overføre 100 pi blod til et mikrocentrifugerør, der tilsættes 1 ml lysisbuffer, og der inkuberes i 2 til 3 minutter for at fjerne røde blodlegemer (RBC). Centrifuger prøver til 5 minutter ved 1500 xg og fjern supernatanten. Hvis pelleten stadig enppears rød (indikerer ufuldstændig fjernelse af RBC), gentages lysistrinnet med en kort inkubation (<1 min) lysisbuffer.
- Vask de resterende PBMC'er med 1 ml FACS buffer (PBS + 1% vægt / vol BSA) og centrifugeres ved 1500 xg i 5 min.
- Aspirer supernatanten og resuspender prøven i 20 pi muse CD16 / 32 antistof (0,025 mg / ml) for at blokere ikke-specifik og FcR-medierede antistofbinding. Der inkuberes i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Overførsel af celler fra mikrocentrifugerør i 4 ml rundbundet FACS rør. Tilsættes 20 pi H-2K b OVA Tetramer-SIINFEKL-PE opløsning ifølge producentens specifikationer til hver prøve og inkuberes i 30 minutter på is.
- Forbered antistoffet cocktail (f.eks αCD8-APC, αCD44-FITC og αCD62L-PECy7 antistoffer (0,005, 0,005 og 0,002 mg / ml koncentration hhv)). Tilsættes 20 pi til hver eksperimentel prøve, og der inkuberes i 20 minutter på is. Forbered enkelt fluoroforen kontrolforanstaltninger ved labeling celler med hver fluorophor-mærket tetramer eller antistof på ovennævnte koncentration.
- Vask 2 gange med FACS buffer og resuspender endelige pellet i FACS-buffer indeholdende 2 pg / ml DAPI. Cellerne er nu klar til flowcytometri analyse (detaljer og eksempler kan findes i Scheffold 25).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De involverede i syntesen af ICMVs trin er illustreret i figur 1 6. Kort fortalt en lipidfilm indeholdende eventuelle lipofile lægemidler eller fluorescerende farvestoffer hydreret i nærværelse af hydrofile lægemidler. Divalente kationer, såsom Ca2 +, tilsættes til at drive fusion af anioniske liposomer i multilamellære vesikler. Dithiol tværbinder, såsom DTT, sættes til "fibre" maleimid-funktionaliserede lipider på apposing lipidlag, og endelig resterende eksterne maleimidgrupper er standset i en reaktion med thiolerede-PEG-dele. En lille del af hver batch kan let underkastes kvalitetskontrol målinger ved bestemmelse partikelstørrelse, polydispersitetsindeks, og zetapotentialet med DLS og zeta-potentialet analysesystem. De resulterende partikler er forholdsvis ensartet med en gennemsnitlig størrelse på 130 ± 20 nm, polydispersitetsindeks på 0,22 ± 0,02, og zetapotentialet af -54 ± 3 mV for OVA-indkapsling partikler (figur 1B og 1C). Typisk udbytte af partikler, målt i tør vægt af partikler, er ~ 50% 6.
Anvendelse af protokollen beskrevet ovenfor, ICMVs kan co-loaded med fluorofor-mærket protein-antigen og fluorescerende lipofile farvestof, hvilket tillader visualisering af antigen og nanopartikel levering in vivo. At sammenligne mønstre af antigen levering i opløselig form versus i ICMVs, C57BL / 6 mus blev administreret sc ved haleroden med 100 ug AlexaFluor555-tagget OVA enten opløselige eller gjorde-mærkede ICMV formuleringer og drænende lyskelymfeknuder LN blev udskåret ved forskellige tidspunkter for udarbejdelse af DLN væv cryo-sektioner. Visualisering med konfokal mikroskopi indikerede, at opløseligt antigen hurtigt nåede DLN'er indenfor 4 timer, men blev også ryddet meget hurtigt med 24 timers (figur 2) 7. I modsætning hertil blev OVA-loaded ICMVs detekteret ved periferien af DLN'er ved 24 timer med fortsat akkumuleringsom undersøges på dag 4, deponering af en stor mængde af OVA-ICMVs i DLN'er (figur 2). Konfokale mikrografer viste også co-lokalisering af AlexaFluor555-tagget OVA og gjorde-mærkede ICMVs inden DLN'er, hvilket tyder på, at ICMVs tillader stabil co-levering af protein-antigener og andre immunstimulerende midler indkapslet i ICMVs 7.
Isolering af CD8 + T-celler fra OT-I / Luc transgene mus kan let udføres med det kommercielt tilgængelige magnetiske negativ udvælgelse kit, hvilket gav ~ 8-12 x 10 6 celler pr en mus milt. Figur 3 viser C57BL / 6-mus adoptivt overført med 5 x 10 5 OT-I / Luc CD8 + T-celler på dag -1, og immuniseret på dag 0 med subkutan administration af 10 ug OVA og 0,3 ug MPLA enten opløselige eller ICMV formuleringer. Bioluminescens billeddannelse med IVIS udført på dag 0 inden vaccinationen udviste minimal OT-I / Luc signal. Men ved dag 4 efter vaccination, mus immuniseretmed OVA / MPLA-ICMVs havde robust bioluminescens signal inden ingvinale LN, som er LN dræner halen basen region 28. I modsætning hertil mus immuniseret med den opløselige form af vaccinen viste meget reducerede udvidelse af OT-I / Luc CD8 + T-celler inden lyskebrok DLN'er.
Under anvendelse af OVA som et model-antigen muligt at overvåge udvidelse af endogene CD8 + -T-celler specifikke for immundominerende OVA 257-264 peptid (SIINFEKL). For eksempel blev C57BL / 6-mus immuniseret på dag 0, 21, og 35 med subkutan administration af 10 ug OVA og 0,3 ug MPLA i enten ICMVs eller opløselig form, og frekvenser SIINFEKL-specifikke CD8 + T-celler blandt CD8 + T-celler i PBMC'er blev bestemt ved flow-cytometri af PBMC'er farvet med SIINFEKL-H-2Kb tetramer-PE. Figur 4A viser repræsentative flowcytometri scatter plots af SIINFEKL-H-2Kb tetramer + -celler blandt CD8 + T-celler i PBMC'er på dag 41 6. Figure 4B viser repræsentative scatter plots af CD62L + CD44 + celler med central hukommelse fænotype blandt SIINFEKL-tetramer + CD8 + T-celler. Ugentlig overvågning af PBMC'er er vist i figur 4C viste, at opløseligt OVA vaccine fremkaldte minimal udvidelse af antigenspecifikke CD8 + T-celler, hvorimod ICMV vaccination fremkaldte betydeligt stærkere CD8 + T-cellereaktioner, opnå en top 28% SIINFEKL-tetramer + T-celler i CD8 + T-cellepopulation ved dag 41 6. Brug af tetramerfarvning protokol præsenteres her, observerede vi baggrunden frekvens på 0,11% ± 0,04% OVA-specifikke T-celler (N = 15) i ubehandlede eller PBS-behandlede dyr, og vi kan registrere statistisk signifikant stigning i antigen-specifikke CD8 + T-frekvenser så lave som 0,46% ± 0,05% (p-værdi <0,005, data ikke vist).
Figur 2. Analyse af antigen drænende til lymfeknuder med konfokal mikroskopi. C57BL / 6 mus blev immuniseret med 100 ug fluorofor-konjugeret OVA (vist med rødt) og 5 ug MPLA enten i opløsning eller ICMVs (vist med blåt). Drænende inguinale lymfeknuder blev udskåret ved angivne tidspunkter, cryosectioned og afbildes med konfokal mikroskopi. Repræsentative konfokale mikrografer er vist. Pink signaler indikerer co-lokalisering af OVA og ICMVs. Dette tal er blevet ændret fra Moon et al. 7.. Klik her for at se en større version af dette tal. 
Figur 3. monitoring T-celle ekspansion efter vaccination. C57BL / 6 albino-mus blev adoptivt overført iv med 5 x 10 5 Luc + OT-I CD8 + -T-celler på dag -1. På dag 0 blev dyrene administreret med 10 ug OVA og 0,1 ug af MPLA enten som opløselige eller ICMV formuleringer. Dyrene blev bedøvet med isofluran og administreres med luciferin (150 mg / kg, 300 pi injiceret ip), og bioluminescens signal fra Luc + OT-1 CD8 + T-celler blev erhvervet med IVIS. Klik her for at se en større version af dette figur. 
Figur 4. Udvidelse af endogene OVA-specifikke CD8 + T-celler efter vaccination ICMV. C57BL / 6 mus blev immuniseret med 10 ug OVA og 0,1 ug af MPLA enten in opløsning eller ICMVs på dag 0, 21 og 35 (pile). Hyppighed af OVA-specifikke T-celler blandt perifert blod mononukleære celler blev vurderet over tid ved flowcytometrisk analyse af SIINFEKL-MHC-I tetramer + CD8 + T-celler. (A) Repræsentativ flowcytometri scatter plots fra individuelle mus på dag 41 show SIINFEKL-MHC-I tetramer + CD8 + T-celler og (B) CD62L + CD44 + celler, markør af centrale hukommelse T-celler. (C) den samlede kinetik for T-celle udvidelse og sammentrækning er vist. Dette tal er blevet ændret fra Moon et al. 6.. Klik her for at se en større version af figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Oplysningerne i denne artikel protokol beskriver syntese og karakterisering af en ny lipidbaseret nanopartikel-system, kaldet ICMVs, og giver processen med validering effektiviteten af nanopartikler-baserede vaccineformuleringer at fremkalde antigen-specifikke CD8 + T-celle responser. ICMV syntese er afsluttet i alle vandige tilstand, hvilket er en stor fordel i forhold til andre almindeligt anvendte polymere nanopartikler systemer (fx poly (lactid-co-glycolid) sure partikler), der typisk kræver organiske opløsningsmidler til fremstilling, hvilket ofte resulterer i tab af antigenicitet i proteinantigener 29,30. Hertil kommer, ICMVs gavn af omfattende stabilitet og evne indkapsle både hydrofobe og hydrofile molekyler 6 og tillader således samtidig tilførsel af antigener og adjuvanser målrettet mod samme intracellulære rum inden APC'er 31,32. Ved hjælp af ICMVs som model vaccine nanopartikel, her har vi skitseret de procedurer,for (1) nanopartikel syntese og karakterisering, (2) validering af nanopartikel dræning til DLN'er, og undersøgelse af fremkaldelse af antigen-specifikke CD8 + T-cellereaktioner ved anvendelse af (3) en ikke-invasiv bioluminescens imaging teknik og (4) peptid-MHC tetramerfarvning assay på PBMCer.
Det er afgørende at sikre ensartethed i nanopartikel syntese fra parti til parti, især for partikelstørrelse og overfladeladning, da de i høj grad kan påvirke lymfe dræning og optagelse af APC'er upon in vivo administration. DLS og zeta potentiale analyser give hurtige metoder til kvalitetskontrol på partikelstørrelse og overfladeladning. For mere detaljerede analyser af morfologi af individuelle partikler, kan disse teknikker suppleres med høj opløsning elektronmikroskopi, såsom cryo-elektronmikroskopi (cryo-EM), der bevarer morfologi "bløde" partikler i forglasset vandige lag 6,33,34 . Indkapslingseffektivitet af antigener og adjuvmyrer skal også bestemmes og holdes ensartet mellem synteser. Adjuvanser, såsom MPLA, kan mærkes med en fluorofor 6 henviser proteinantigener kan kvantificeres ved anvendelse absorbance- og fluorescens-baserede protein kvantificering kits, eller analyseres ved anvendelse af SDS-PAGE 35 og Coomassie eller sølvfarvning 36 og kvantificeret på grundlag af båndintensitet . Uoverensstemmelser i fremstillingen partikel kan skyldes udløbne eller dårligt lagrede reagenser, så optimal reaktivitet er nødvendigt for fuldstændig syntese. Med henblik herpå maleimide- og thiol- funktionaliserede reagenser skal opbevares i små alikvoter ved -80 ° C uden hyppige fryse-tø cykler.
Partikler mindre end 100 nm, er generelt menes at effektivt at indtaste lymfekar og trafik til DLN'er 13, mens større partikler (500-2000 nm) kræver aktiv transport med væv-resident DCs 12,37. I vores hænder, ICMVs med den hydrodynamiske størrelse spænder 150-250 nm effektivt lokaliseret og varede i DLN, der fik omfattende CTL og humorale responser 6,7. Inden 24 timer af indgivelse blev ICMVs forbundet med subkapsulær sinus makrofager i DLN'er, og flowcytometrisk analyser udført på dag 1 og 4 viste, at de fleste ICMVs inden DLN'er blev taget op af LN-residente APC'er med kun en lille del af partikler forbundet med Langerhanske og dermale DC'er 7. Disse resultater viste, at passiv transport er den største form for ICMV menneskehandel til DLN'er. Disse undersøgelser har udnyttet fluoroforen-mærkede nanopartikler og protein-antigener at afgrænse deres lokalisering og distribution mønstre i DLN'er. Konfokal mikroskopi af cryosectioned DLN'er giver ekstra immunofluorescens histokemi til identifikation af LN strukturer (f.eks GL-7-ekspression i kimcentre), og celler interagerer med formulering komponenter (fx DC'er - CD11c, makrofager - F4 / 80, CD169, og B- celler & #8211; B220) 7,9. Denne teknik kan udføres parallelt med flowcytometri analyser af celler høstet fra DLN'er at afgrænse de delmængder af APC'er ansvarlige for partikel optagelse 7,9 eller med hel-dyr billeddannelse til kvantificering vaccine levering fra injektionsstedet til DLN'er 38,39, forudsat at de fluorescerende signaler er stærke og væv autofluorescens ikke interfererer med signalerne.
Effektiv immunisering kræver robust aktivering og ekspansion af antigen-specifikke cytotoksiske T-celler, som kan spores af hele kroppen bioluminescens imaging efter adoptiv overførsel af bioluminescerende, antigenspecifikke transgene T-celler, efterfulgt af vaccination. Den ekstra fordel ved denne metode er potentialet for gentagne visualisering af CTL handel med de samme dyr i en længere periode, hvilket reducerer antallet af dyr, der kræves for immunologiske analyser og undgå brugen af besværlige celleisolering procedures. Under anvendelse af denne billeddannelse teknik har vi for nylig vist, at pulmonal administration af ICMVs co-loaded med protein antigen og en immunstimulerende middel førte til kraftig fremkaldelse af antigen-specifikke CD8 + T-celler i lungen og mediastinale LN og efterfølgende udbredelse af CTL'er til distale slimhindevæv , herunder Peyerske plaques, coecum og vagina 9. Flowcytometrisk analyser viste, at disse nyligt udvidede CD8 + T-celler blev trykt et "slimhinde-homing" fænotype karakteriseret ved α 4 β 7 + integrin udtryk og medierede beskyttende immunrespons mod slimhinde viral udfordring 9. Hele-animalsk billeddannelse af bioluminescerende CD8 + -T-celler blev også for nylig udnyttet af Hailemicheal et al., Som påviste, at tumorantigen peptid formuleres i inkomplet Freunds adjuvans (IFA, olie-i-vand-emulsion) resulterede i binding af T-celler på stedet af injektionenmed vaccine "depot" væk fra tumormasser, hvilket fører til T-celle-dysfunktion og sletning 40.
Tetramerfarvning er blevet anvendt i udstrakt grad i fortiden for at kvantificere niveauet af endogene CTL-responser som følge af forskellige vaccineformuleringer 21. Denne teknik er også relevant og almindeligt anvendt i tidlige humane cancer immunterapi kliniske forsøg for at bekræfte CTL-reaktioner på specifikke tumor-associerede antigener 41,42. PBMC'er kan let opsamles fra mus og forberedt til flowcytometri; men det kan ikke afsløre det fulde omfang af T-celle ekspansion på grund af celle lokalisering til depot-danner vacciner som nævnt før eller inden for tumorer i kræftmodeller, hvilket kræver mere omfattende analyse. Hvorvidt denne metode med flowcytometri tillader bestemmelse af antigenspecifikke T-celler med hukommelse markører (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, og KLRG-1) for at skelne effektor, central hukommelse, og effektor memory ceLLS blandt tetrameren + T-celler 43 eller langvarig væv hjemmehørende CTL'er 44,45 (som sammenfattet i seneste anmeldelser 46,47). Imidlertid tetramerfarvning assay tilvejebringer kun den oprindelige vurdering af CTL-responser, idet højt ekspanderede antigenspecifikke T-celler kan udvise tegn på immun udmattelse 48,49. Funktionel evaluering af CTL-reaktioner kan udføres ved at undersøge cytokinfrigivelse med enzymbundet immunospot (ELISpot) 50 eller intracellulær cytokin-farvning 51 efter ex vivo-stimulering af lymfocytter med minimale epitoper såvel som ved måling af de intracellulære niveauer af perforin og granzym B 52 og ekstracellulære ekspression af CD107a og CD107b ved degranulering 53. Derudover kan cytolytiske funktion af CTL'er direkte vurderes med CTL cytotoksicitetsassays udføres in vitro eller in vivo 54-56.
Induktion af humorale immunreaktionerefter nanopartikel vaccination kan studeres parallelt med CD8 + T-celle analyser præsenteres her. Antistoftitere kan analyseres ved den traditionelle metode med enzymkoblet immunosorbent assay (ELISA), mens antistofaffinitet og bredden af epitopgenkendelse kan vurderes ved at modificere ELISA-protokollen ved anvendelse af chaotropt middel (fx urea) under antistofbinding til den substrat og anvendelse af underdomæner inden antigener som substrater, henholdsvis 7. Fremkaldelse af potente humorale reaktioner kræver udvidelse af follikulært hjælper-CD4 + T-celler (T fh) 57. Til undersøgelse ekspansion af T-fh celler som reaktion på vaccination partikel, kan protokollen præsenteres her let tilpasses til isolering af antigenspecifikke CD4 + T-celler fra OT-II transgene mus, efterfulgt af adoptiv celle overførsel til naive recipientmus. Efter vaccination kan lymfevæv høstes og analyseres med flowcytometrisk analyse at afskrækkeminen ekspansion af antigen-specifik T fh celler (identificeret ved deres CD4 + CXCR5 + PD-1 + fænotype) 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Perkin Elmer forudsat produktionen omkostninger afholdt i offentliggørelsen af denne artikel.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af National Institute of Health giver 1K22AI097291-01 og af National Center for Fremme Translationelle Sciences i National Institutes of Health i henhold Award nummer UL1TR000433. Vi anerkender også Prof. Darrell Irvine på MIT og Prof. Matthias Stephan på Fred Hutchinson Cancer Center for deres bidrag på det indledende arbejde på vaccine nanopartikler og OT-I / Luc transgene mus.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
References
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
- Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
- Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
- Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
- Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
- Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
- DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
- Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
- Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
- Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
- Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
- Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
- Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
- Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
- Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
- Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
- Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
- Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
- Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
- Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
- Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
- Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
- Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
- Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
- Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
- Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).
