Introduction
Traditionelle Impfstoffentwicklung hat überwiegend beschäftigt die empirischen Ansatz von Versuch und Irrtum. Jedoch mit der jüngsten Entwicklung einer breiten Palette von Biomaterialien und Entdeckung von molekularen Determinanten Aktivierung des Immunsystems ist es nun möglich, rationell Vakzinformulierungen mit biophysikalische und biochemische Hinweise von Pathogenen 1,2 abgeleitet. Insbesondere wurden verschiedene partikulären Drug-Delivery-Plattformen als Impfstoffträger, da sie mit Untereinheiten-Antigenen und immunstimulierende Mittel gemeinsam geladen werden untersucht, Impfstoffkomponenten Schutz vor Abbau, verbessern und ihre Co-Lieferung an präsentierenden Zellen Antigen (APCs) mit Wohnsitz in der Lymphe Knoten (LNS), damit die Maximierung Immunstimulation und Aktivierung 3-5. In diesem Bericht beschreiben wir die Synthese eines "pathogen-imitiert" Nanopartikel-System, genannt interbilayer netzten multilamellare Vesikel (ICMVs), die zuvor als ein potenter Impfstoff platfor demonstriert wordenm für die Auslösung robust zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und humorale Immunreaktionen sowohl systemische und Schleimhautgewebe Fächer 6-9. Insbesondere erzielte Impfung mit ICMVs wesentlichen Serum-IgG-Ebenen verstärkt gegen eine Malaria-Antigen, gegenüber der Impfung mit üblichen Hilfsmitteln (zB Alaun und Montanide) 7 und auch ausgelöste starke CTL-Antworten gegen Tumorzellen und virale Herausforderung Modellen in Mäusen 9. Hier mit ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikelsystem beschreiben wir Methoden zur Charakterisierung von Nano-Impfstoff-Formulierungen, einschließlich Partikelgröße und Zetapotentialmessungen und Verfolgung von Menschenhandel zu Partikel Ablassen LNs (DLNs) nutzen konfokale Bildgebung von Gewebe gefriergeschnitten 7. Zusätzlich stellen wir eine Ganztier-Bildgebung basierte Verfahren zum Analysieren Expansion von CTL-Antworten in Mäusen nach dem adoptiven Transfer von Luciferase-exprimierende Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen 9,10. Schließlich definieren wirRitz Tetramerfärbung von peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) zu Längs Quantifizierung der endogenen T-Zell-Antworten in Mäusen, die mit Nanopartikeln 6,9 geimpft.
ICMVs eine lipidbasierte Nanopartikel-Formulierung durch kontrollierte Fusion von Liposomen einfach synthetisiert in multilamellaren Strukturen, die dann chemisch durch Vernetzung Maleimid-funktionalisierten Phospholipid-Kopfgruppen in Lipidschichten mit Dithiol Vernetzer 6 stabilisiert werden. Sobald ICMVs synthetisiert werden, kann ein kleiner Anteil von Nanopartikeln verwendet werden, um Teilchengröße und Zeta-Potential (das heißt, die Oberflächenladung der Teilchen) mit einer dynamischen Lichtstreuung (DLS) System und ein Zeta-Potential-Analysegerät ermitteln. DLS misst Änderungen der Lichtstreuung in Partikelsuspensionen, was die Bestimmung des Diffusionskoeffizienten und die hydrodynamische Größe von Partikeln 11. Konsistente Teilchengröße von Charge zu Charge Synthese kritischDa Teilchengröße gehört zu den wichtigsten Faktoren, die Lymphdrainage Impfstoffpartikel DLNs und anschließende zelluläre Aufnahme durch APCs 12,13. Zusätzlich kann Zetapotential durch Messen der Partikelgeschwindigkeit, wenn ein elektrischer Strom angelegt wird, die Bestimmung der elektrophoretischen Beweglichkeit von Partikeln und Partikeloberflächenladung 11 können erhalten werden. Konsistente Werte Zeta-Potential von Teilchen ist wichtig, da Oberflächenladung der Teilchen bestimmt, kolloidale Stabilität, die direkten Einfluss auf die Dispersion während der Lagerung und nach der Verabreichung in vivo 14,15 hat. Um die Partikellokalisierungs zu DLNs verfolgen, können ICMVs mit gewünschten Fluorophore einschließlich lipophilen Farbstoffen und kovalent-markierten Antigene bezeichnet werden. Nach der Immunisierung können Mäuse zu verschiedenen Zeitpunkten getötet werden, DLNs reseziert gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht die Visualisierung von lymphatischen draining sowohl der Nanopartikel Impfstoffträger und Antigen DLNs. Die Gewebeschnitte können zusätzlich mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern und verwendet, um weitere Informationen zu erhalten, wie die Typen von Zellen mit dem Antigen, und die Bildung von Keimzentren assoziiert gefärbt, wie wir vorher 7 gezeigt werden.
Sobald die Partikelsynthese optimiert und Handels den DLNs bestätigt wird, ist es wichtig, Auslösung in vivo CTL-Expansion zu validieren. Um Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen als Reaktion auf die Impfung Nanopartikel zu analysieren, haben wir eine Modellantigen, Ovalbumin (OVA) verwendet, die mit OVA 257-264-Peptid (SIINFEKL) immun CD8 + T-Zell-Epitop, das detaillierte immunologischen Analysen ermöglicht von Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten für die anfängliche Entwicklung von Impfstoffen 16,17. Insbesondere, um die Dynamik der Expansion und Migration von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen zu befragen, erzeugten wir haben eindoppelt transgenen Mausmodell durch Kreuzung Glühwürmchen-Luciferase-exprimierenden transgenen Mäusen (Luc) mit OT-I-transgenen Mäusen, die CD8 + T-Zellen mit T-Zell-Rezeptor (TCR) spezifisch für SIINFEKL (in Verbindung mit H-2K b) besitzen. Aus diesen OT-I / Luc Mäusen, Luciferase-exprimierenden kann OT-I CD8 + -T-Zellen isoliert und zur adoptiven Transfer in naiven C57BL / 6-Mäusen hergestellt werden. Sobald ausgesät werden erfolgreiche Immunisierung mit OVA haltigen Nanopartikeln in Expansion der übertragenen T-Zellen, die durch die Überwachung des Biolumineszenz-Signals mit einem ganzen Tier Abbildungssystems 9,10 verfolgt werden können führen. Diese nicht-invasive Ganzkörper-Bildgebung Technik hat mit anderen viralen oder Tumorantigene, die in der Vergangenheit 18-20 angewandt, sodass Prozesse in T-Zell-Expansion in Lymphgewebe und Verbreitung in die peripheren Gewebe in Längs Weise beteiligt.
Komplementär zur Analyse adoptiv transferierte Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen, endogenous T-Zell-Reaktionen nach der Impfung mit dem Peptid-Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Tetramer-Assay 21, bei dem ein Peptid-MHC-Tetramer-Komplex, bestehend aus vier Fluorophor-markierten MHC-Klasse I-Moleküle mit Peptid beladen Epitope untersucht werden, wird verwendet, TCR und Etiketten CD8 + T-Zellen in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu binden. Der Peptid-MHC-Tetramer-Assay kann entweder im Terminal Nekropsie Studien zur Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen in lymphoiden und peripheren Gewebe zu identifizieren oder in Langzeitstudien mit peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von der seriellen Blutabnahmen durchgeführt werden, erhalten. Nach Färbung Lymphozyten mit Peptid-MHC-Tetramer, Durchflusszytometrie Analyse wird für detailliertere Analysen auf den Phänotyp von CTLs oder Quantifizierung ihrer Häufigkeit bei CD8 + T-Zellen durchgeführt.
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Protocol
Alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimente wurden von der Universität Ausschuss für Nutzung und Pflege von Tieren (UCUCA) an der Universität von Michigan nach den Verhaltensregeln und Richtlinien genehmigt und durchgeführt.
Mit Protein-Antigen und Adjuvans Molecules 1. Synthese und Charakterisierung von ICMVs CO bela
- Mix 1: 1-Molverhältnis von 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC) und 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine- N - [4- (p maleimidophenyl) butyramido] (MPB) in Chloroform, wobei die Gesamtlipidmenge bei 1,26 umol pro Charge (das heißt, 500 & mgr; g von DOPC und 630 ug MPB) in einem 20 ml Glasröhrchen (Durchmesser = 28 mm und Höhe = 61 mm).
- Hinzuzufügen lipophile Arzneimittel, wie Monophosphoryl-Lipid A (MPLA) oder lipophilen Farbstoffen (zB DID), um die Lipidlösung in gewünschte Konzentration. Gründlich zu entfernen des organischen Lösungsmittels durch Spülen mit extra dry nitrogen Gas- und indem die Proben unter Vakuum O / N.
- Hydratisieren des Lipidfilms durch Zugabe von 200 ul 10 mM Bis-Tris-Propan (BTP, pH 7,0), enthaltend wasserlösliche Medikamente (zB Protein-Antigene). Vortex für 10 Sekunden alle 10 Minuten für 1 Stunde bei RT.
- Übertragen Sie den Inhalt aus dem Glasfläschchen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, Ort Proben in einem Eis-Wasser-Bad und beschallen kontinuierlich für 5 min mit der Intensität von 40% Einstellung auf einem 125 W / 20 kHz-Sonde-Spitze Ultraschallgerät.
- In 4 ul 150 mM Dithiothreitol (DTT) zu jeder Charge (Arbeitskonzentration 2,4 mM), Wirbel, und kurz Zentrifuge unter Verwendung eines Tischmikrozentrifuge.
- In 40 ul 200 mM CaCl 2 und mit der Pipette (Arbeitskonzentration 33 mM) zu mischen. Proben bei 37 ° C für 1 Stunde zur Vernetzung des MPB-enthaltende Lipidschichten mit DTT zu ermöglichen.
- Centrifuge Proben bei 20.000 · g für 15 Minuten, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren in 200 ul ddiH 2 O.
- Wiederholen Sie die Schritte 1,7 und Zentrifuge wieder nach dem zweiten ddiH 2 O zu waschen, um CaCl 2, nicht umgesetzten DTT und nicht verkapselten Fracht Materialien aus dem Überstand zu entfernen.
- Herstellung von 10 mg / ml 2 kDa Polyethylenglycol-thiol (PEG-SH) in ddiH 2 O. Resuspendieren jedes ICMV Probe in 100 ul PEG-SH-Lösung und Inkubation bei 37 ° C für 30 min.
- Führen Sie zwei ddiH 2 O Wäschen (Schritt 1.7) und resuspendieren die endgültige ICMV Pellet in PBS und bei 4 ° C. Vor dem Gebrauch mischen ICMV Suspension, als Partikel auf den Boden nach längerer Lagerung zu begleichen.
- Zur Charakterisierung der Partikel, Entnahme einer kleinen Aliquot (~ 10%) der ICMVs aus jeder Charge und einzeln in einem Gesamtvolumen von 1 ml ddiH 2 O verdünnen Platzieren einer einzigen Probe in einem Zetasizer Zelle und Messung Teilchengröße Polydispersitätsindex und Zeta-Potential der Proben unter Verwendung eines DLS und Zetapotential-Messsystem (nach dem Protokoll des Herstellers).
2. Prüfung der Lymphknotens von Fluoreszenz-markierten ICMVs mit konfokale Mikroskopie
- Vorbereitung der ICMVs mit Fluorophor-markierten Antigen und lipophilen Fluoreszenzfarbstoff beladen
- Vorbereitung Fluorophor-markierten Protein, wie Ovalbumin mit Alexa Fluor 555-succinimidylester umgesetzt, entsprechend der Anleitung des Herstellers.
- Um ICMVs mit Fluorophor in der Lipidhülle versehen vorzubereiten, fügen lipophilen Fluoreszenzfarbstoff (zB 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (DID)) während der Herstellung der Lipidfilm (Schritt 1.2) mit 0,05% molaren Lipidmenge. Für Lipidfilm Flüssigkeitszufuhr (Schritt 1.3), Verwendung Puffer, der Fluorophor-markierten Antigen und komplette ICMV Synthese wie in Schritten von 1,4 bis 1,11 dargestellt.
- Die subkutane Verabreichung von Nanopartikeln an Schwanzbasis
- Betäuben Maus mit einem kontrollierten Fluss Verdampfer mit einer Induktionskammer u ausgestattettilizing 3% Isofluran und 1,5 l / min Sauerstoff Strom gemäß einer IACUC genehmigt Tier-Protokoll. Sobald die Maus bewusstlos ist, führen Sie folgende Schritte schnell vor der Narkose nachlässt, um optimalen Zugang zu der Stelle der Injektion zu ermöglichen und zu minimieren Beschwerden an das Tier. Alternativ können Sie einen gut passenden Nasenkegel auf die Anästhesie aufrechtzuerhalten. Wenn Mäuse länger als 5 min narkotisiert, gelten Augenschmier notwendig, Reizung nach dem Eingriff zu minimieren.
- Sprühen Sie die Basis des Schwanzes mit 70% Ethanol zu desinfizieren und nass das Pelzteil das nasse Haar, ein kleines Stück Haut sichtbar, die verwendet werden kann, um die Nadel unter die Haut sichtbar zu schützen.
- Vorbereitung Partikelinjektionssuspension enthaltend gewünschte Menge an Antigen und Adjuvans pro 100 ul Impfdosis in PBS (beispielsweise 10 & mgr; g OVA und 0,3 & mgr; g MPLA pro 100 ul Injektionsdosis wurde in der Vergangenheit 6,9 verwendet wurde).
- Zeichnen Sie die Partikelsuspension intoa Spritze mit einer 27-29 G Nadel und führen Sie die Nadel an der Basis des Schwanzes (~ 5 mm vom Haaransatz) mit der Fase nach oben ein und injizieren 50 ul der Partikelsuspension 22.
- Warten Sie einige Sekunden für Druckausgleich, um übermäßige Rückströmung zu verhindern, und ziehen Sie die Nadel heraus. Ist die Einspritzung auf der anderen Seite der Schwanzbasis auf beiden Ablaßleisten LNs zielen.
- Vorbereitung von Lymphknotengefrierschnitten und Prüfung mit der konfokalen Mikroskopie.
- Euthanize die Maus mit CO 2 Ersticken, gefolgt von induzierten Pneumothorax nach ein IACUC genehmigten Tier Protokoll. Auszug Leisten LNs nach Protokoll in Bedoya 23 gezeigt und waschen das Blut, indem das Gewebe in 1 ml 4 ° C PBS.
- Absorbieren die PBS aus dem Gewebe mit Gewebe und legen Gewebe in Gewebe cryomolds (10 x 10 x 5 mm 3) an die Spitze vorgefüllt mit Oktober Einfriermedium 24. Snap einfrieren tisverklagen Block in flüssigem Stickstoff für 30 Sekunden. Alternativ legen Gewebeblock auf Trockeneis für 30 min. Speichern gefrorenen Gewebe in -80 ° C Tiefkühltruhe.
- Schneiden Gewebeschnitte 5-10 um dick in einem Kryostat bei -20 ° C 24 gesetzt.
- Falls erforderlich, Immunfluoreszenz Etikettierung, und untersuchen das Gewebe mit der konfokalen Mikroskopie, wie zuvor gezeigt 24.
3. Überwachung Expansion von Antigen-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen nach der Nanopartikel-Impfung mit ganzen Tier Imaging
- Isolierung des OVA 257-264-spezifischen, Luciferase-exprimierenden CD8 + T-Zellen von OT-I / Luc transgenen Mäusen
- Euthanize eine OT-I / Luc transgene Maus mit CO 2 Ersticken und induzieren ein Pneumothorax nach einem IACUC genehmigten Tier Protokoll. Ernten der Milz steril durch Zugriff auf die Bauchhöhle und sorgfältig Ablösen der Gewebe aus dem Pankreas 23 undin 5 ml 4 ° C PBS + 2% FBS für die Übertragung auf Gewebekultur Kapuze.
- Platzieren der Milz auf einem 70 & mgr; m Nylon-Sieb über ein 50 ml konisches Zentrifugenröhrchen (bis zu 3 Milz zu einem Zeitpunkt). Verwendung eines Kolbens von einer 3-ml-Spritze, mahlen die Zellen durch das Sieb.
- Waschen Sie den Kolben und das Sieb mit PBS + 2% FBS und entsorgen. Bringen Sie das Gesamtvolumen auf 10 ml / Milz in der 50 ml Tube, nehmen Sie eine kleine Probe der Zellsuspension mit einem Hämocytometer zählen, und Zentrifuge für 10 Minuten bei 300 x g.
- Mit einem handelsüblichen Magnet negative Selektion Kit, isolieren die CD8 + T-Zell-Population, indem Sie den Anweisungen des Herstellers.
- Nach Waschen der Zellen mit PBS, zählen die Anzahl der isolierten CD8 + T-Zellen. Die Reinheit der isolierten CD8 + T-Zellen zu bewerten, inkubieren ~ 20.000-30.000 Zellen in 20 ul Maus CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) für 10 min, anschließend werden 20 ul αCD8-APC-Antikörper (0,005 mg / ml) und Inkubation für 30 min. Perform alle Inkubationen bei 4 ° C in PBS + 1% w / v BSA. Zuführen Durchflusszytometrieanalyse 25.
- Der adoptive Transfer von isolierten CD8 + T-Zellen und Visualisierung ihrer Expansion nach der Impfung
- Zuführen adoptiven Transfer von isolierten OT-I / Luc CD8 + T-Zellen in naiven C57BL / 6-Mäusen durch Verabreichung 1-10 x 10 5 Zellen in einem 200 & mgr; l Volumen von PBS durch intravenöse Injektion in die Schwanzvene 22 (Tag -1). In Anbetracht, dass Pelz und schwarze Flecken auf der Haut in C57BL / 6-Mäuse können mit dem Biolumineszenz-Signal stören, sind rasiert Albino C57BL / 6-Mäuse ideal für diese Studien.
- Nach einem Tag (Tag 0), zur Verwaltung der Impfstoff wie zuvor beschrieben (Abschnitt 2.2).
- Verwalten 150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht der Maus intraperitoneal in einem 300 & mgr; l Volumen von PBS. Nach 10 min zu betäuben die Mäuse mit Isofluran (wie in Schritt 2.2.1) und zu visualisieren OT-I / Luc CD8 + T-Zellen durch den Erwerb der Biolumineszenz-Signal für 5-10 min wit einem ganzen Tier Abbildungssystem (IVIS, siehe Wilson 26 für detaillierte Anleitung). Wiederholen Sie dies für Langzeitstudien wie nötig.
4. Peptid-MHC-Tetramer-Färbung von PBMCs für die Analyse von Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellen
Anmerkung: Die folgenden Protokollprozedur kann entweder C57BL / 6-Mäuse adoptiv mit OT-I / Luc CD8 + T-Zellen oder C57BL / 6-Mäusen ohne die adoptive Übertragung übertragen geführt werden.
- Bei einem gewünschten Zeitpunkt nach der Impfung, sammeln etwa 100 ul Blut (4-6 Tropfen) von Mäusen über submandibular Blutungstechnik 27 in ein Rohr mit K 2 EDTA beschichteten und invertieren mehrere Male, um die Gerinnung zu verhindern.
- Übertragen Sie 100 ul Blut in ein Mikrozentrifugenröhrchen, fügen Sie 1 ml Lysepuffer, und Inkubation für 2 bis 3 min, um die roten Blutkörperchen (Erythrozyten) zu entfernen. Centrifuge Proben für 5 min bei 1.500 xg und entfernen Sie den Überstand. Wenn das Pellet noch einppears rot (zeigt unvollständige Entfernung der roten Blutkörperchen), wiederholen Sie die Lyse mit einer kurzen Inkubationszeit (<1 min) Lysepuffer.
- Waschen der verbleibenden PBMCs mit 1 ml FACS-Puffer (PBS + 1% w / v BSA) und Zentrifugieren bei 1500 × g für 5 min.
- Den Überstand aspirieren und Resuspendieren der Probe in 20 ul Maus-CD16 / 32-Antikörper (0,025 mg / ml) zu unspezifisch und FcR-vermittelte Antikörper blockieren die Bindung. Inkubieren für 10 min bei RT.
- Übertragen Zellen von Mikrozentrifugenröhrchen in 4 ml-Rund FACS-Röhrchen. Mit 20 ul H-2K b OVA Tetramer-SIINFEKL-PE-Lösung nach den Angaben des Herstellers zu jeder Probe und inkubiere für 30 min auf Eis.
- Bereiten Sie die Antikörper-Cocktail (zB αCD8-APC, αCD44-FITC und αCD62L-PECy7 Antikörper (0,005, 0,005 und 0,002 mg / ml-Konzentration, respectively)). In 20 ul zu jeder experimentellen Probe und Inkubation für 20 min auf Eis. Bereiten einzigen Fluorophor Kontrollen labeling Zellen mit jeder Fluorophor-markierten Tetramer oder Antikörper in der oben angegebenen Konzentration.
- Mit FACS-Puffer waschen 2mal und resuspendieren Endpellet in FACS-Puffer, enthaltend 2 ug / ml DAPI. Die Zellen sind nun bereit für die Durchflusszytometrie-Analyse (Details und Beispiele können in Scheffold 25 zu finden).
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Representative Results
Die bei der Synthese von ICMVs beteiligten Schritte sind in Figur 1 6 gezeigt. Kurz gesagt wird ein Lipidfilm keine lipophilen Arzneimitteln oder Fluoreszenzfarbstoffe enthält in Gegenwart von hydrophilen Arzneimitteln hydratisiert. Zweiwertige Kationen, wie Ca 2+, werden zugegeben, um die Fusion von anionischen Liposomen in multilamellaren Vesikeln zu fahren. Dithiol-Vernetzer, wie beispielsweise DTT, auf apposing Lipidschichten und schließlich verbleibenden externen Maleimidgruppen "staple" Maleimid-funktionalisierten Lipide zugesetzt werden, in einer Reaktion mit thiolierten-PEG-Einheiten abgeschreckt. Eine kleine Fraktion von jeder Charge leicht zu Qualitätskontrollmessungen durch Bestimmung der Teilchengröße, Polydispersitätsindex und Zeta-Potential mit einem DLS und Zeta-Potential-Analysesystem unterzogen werden. Die resultierenden Teilchen sind relativ homogen mit einer durchschnittlichen Größe von 130 ± 20 nm, der Polydispersitätsindex von 0,22 ± 0,02 und Zeta-Potential von -54 ± 3 mV für OVA-Einkapselung pArtikel (1B und 1C). Typische Ausbeute von Partikeln, in Trockengewicht der Teilchen gemessen wird, ist ~ 50% 6.
Verwendung des oben beschriebenen Protokolls ICMVs mit Fluorophor-markierten Protein-Antigen und fluoreszierende lipophilen Farbstoff zusammen geladen werden, so dass die Visualisierung des Antigens und zur Freisetzung von Nanopartikeln in vivo. Um die Muster der Antigenabgabe in löslicher Form im Vergleich zu in ICMVs vergleichen, C57BL / 6-Mäuse wurden sc in Schwanzbasis mit 100 ug AlexaFluor555-markierten OVA sowohl in löslichen oder haben markierten ICMV Formulierungen und Entwässerung Leisten LNs wurden zu verschiedenen geschnitten verabreicht Zeitpunkte für die Herstellung von dLN Gewebe der Kryo-Schnitte. Visualisierung mit konfokaler Mikroskopie gezeigt, dass lösliches Antigen schnell erreicht die DLNs innerhalb von 4 Stunden, wurde aber auch sehr schnell mit 24 Stunden (Abbildung 2) 7 gelöscht. Im Gegensatz dazu wurden OVA bela ICMVs am Umfang der DLNs von 24 Stunden nachgewiesen werden, wobei fortlaufende Anhäufungwie an Tag 4 untersucht, Abscheiden einer großen Menge von OVA-ICMVs in DLNs (Abbildung 2). Konfokale Mikroaufnahmen zeigten auch Co-Lokalisation von AlexaFluor555-markierten OVA und tat-markierten ICMVs innerhalb DLNs, was darauf hindeutet, dass ICMVs ermöglichen stabile Co-Lieferung von Protein-Antigene und andere immunstimulierende Mittel innerhalb ICMVs 7 gekapselt.
Isolierung von CD8 + T-Zellen von OT-I / Luc transgene Maus kann leicht mit dem im Handel erhältlichen magnetischen negativen Selektionssatzes durchgeführt werden, was ~ 8-12 x 10 6 Zellen pro Maus Milz, Fig. 3 zeigt C57BL / 6-Mäusen mit adoptiv transferiert 5 x 10 5 OT-I / Luc CD8 + T-Zellen am Tag 1, und am Tag 0 immunisiert mit subkutaner Verabreichung von 10 ug OVA und 0,3 & mgr; g MPLA entweder in löslicher oder ICMV Formulierungen. Biolumineszenz-Bildgebung mit IVIS durchgeführt am Tag 0 vor der Impfung zeigten minimale OT-I / Luc Signal. Doch am Tag 4 nach der Impfung, immunisierten Mäusenmit OVA / MPLA-ICMVs hatte robust Biolumineszenz-Signal innerhalb Leisten LNs, die LNs Ablassen des Heckbasisbereich 28 sind. Im Gegensatz dazu Mäusen mit der löslichen Form des Impfstoffes immunisiert zeigten stark reduziert Expansion des OT-I / Luc CD8 + T-Zellen innerhalb Leisten DLNs.
Verwendung OVA als Modellantigen ermöglicht die Überwachung der Expansion von endogenen CD8 + T spezifisch immun OVA 257-264-Peptid (SIINFEKL) Zellen. Zum Beispiel wurden C57BL / 6-Mäuse an den Tagen 0, 21 immunisiert und 35 mit subkutaner Verabreichung von 10 ug OVA und 0,3 & mgr; g MPLA entweder ICMVs oder löslicher Form, und die Frequenzen der SIINFEKL-spezifischen CD8 + -T-Zellen unter den CD8 + T-Zellen in PBMCs wurden durch durchflusszytometrische Analyse von PBMCs mit SIINFEKL-H-2K b Tetramer-PE. 4A gefärbten ermittelt zeigt repräsentative Durchflusscytometrie Streudiagramme von SIINFEKL-H-2K b Tetramer + -Zellen unter den CD8 + T-Zellen in PBMCs am Tag 41 6. Figure 4B zeigt repräsentative Streudiagramme von CD62L + CD44 + Zellen mit zentralen Speicher Phänotyp unter SIINFEKL-Tetramer + CD8 + T-Zellen. Wöchentliche Überwachung von PBMCs in 4C angezeigt ist, dass lösliches OVA Impfstoff rief minimalen Expansion von Antigen-spezifischen CD8 + -T-Zellen, während ICMV Impfung ausgelöste deutlich stärker CD8 + T-Zell-Antworten, die Erreichung einer Spitzen 28% SIINFEKL-Tetramer + -Zellen in der CD8 + T-Zell-Population von Tag 41 6. Mit dem hier vorgestellten Tetramerfärbung Protokoll beobachteten wir die Hintergrundfrequenz von 0,11% ± 0,04% OVA-spezifischen T-Zellen (N = 15) unbehandelt oder PBS-behandelten Tieren, und wir erkennen können statistisch signifikanten Anstieg der antigenspezifischen CD8 + -T-Zell geringen Frequenzen von 0,46% ± 0,05% (p-Wert <0.005, Daten nicht gezeigt).
Abbildung 2. Analyse der Antigen Entwässerung in Lymphknoten mit der konfokalen Mikroskopie. C57BL / 6-Mäuse wurden mit 100 ug fluorophorkonjugierten OVA (in rot dargestellt) und 5 ug MPLA entweder in Lösung oder ICMVs (in blau dargestellt) immunisiert. Ablassen inguinalen Lymphknoten wurden zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen, gefriergeschnitten und mittels konfokaler Mikroskopie abgebildet. Vertreter konfokale Mikroaufnahmen gezeigt. Rosa Signale zeigen Co-Lokalisation von Eizellen und ICMVs. Diese Zahl hat sich von Mond et al. 7 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 3. Kontrollausrüsg T-Zellexpansion nach der Impfung. C57BL / 6-Albino-Mäuse wurden am Tag -1 adoptiv übertragen iv mit 5 × 10 5 Luc + OT-I-CD8 + T-Zellen. Am Tag 0 wurden die Tiere mit 10 ug des OVA und 0,1 & mgr; g MPLA entweder als lösliche oder ICMV Formulierungen verabreicht. Die Tiere wurden mit Isofluran betäubt und mit Luciferin verabreicht (150 mg / kg, 300 ul injiziert ip) und Biolumineszenz-Signal von Luc + OT-1 CD8 + T-Zellen wurde mit IVIS erworben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version davon zu sehen Figur. 
Abbildung 4. Ausbau der endogenen OVA-spezifischen CD8 + T-Zellen nach ICMV Impfung. C57BL / 6-Mäuse wurden mit 10 & mgr; g OVA und 0,1 ug MPLA entweder i immunisiertn Lösung oder ICMVs an den Tagen 0, 21 und 35 (Pfeile). Frequenz von OVA-spezifischen T-Zellen unter den peripheren mononukleären Blutzellen wurde über die Zeit durch durchflusszytometrische Analyse von SIINFEKL-MHC-I Tetramer + CD8 + T-Zellen untersucht. (A) Repräsentative Durchflusszytometrie Streudiagramme von einzelnen Mäusen am Tag 41 Show SIINFEKL-MHC-I Tetramer + CD8 + T-Zellen und (B) CD62L + CD44 + Zellen, Marker der zentralen Gedächtnis-T-Zellen. (C) Die gesamte Kinetik der T-Zell-Expansion und Kontraktion dargestellt. Diese Zahl hat sich von Mond et al. 6 modifiziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version der Abbildung zu sehen.
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Discussion
Die in diesem Artikel beschriebenen Protokoll beschreibt die Synthese und Charakterisierung eines neuen lipidbasierte Nanopartikel System bezeichnet ICMVs und liefert das Verfahren zur Überprüfung der Wirksamkeit der Nanopartikel-Impfstoffformulierungen zu Antigen-spezifischen CD8 + T-Zellantworten induzieren. ICMV Synthese in allen wässrigen Zustand, was ein großer Vorteil ist, verglichen mit anderen gemeinhin verwendeten polymeren Nanopartikelsysteme (zB Poly (lactid-co-glycolid) Säurepartikel), die typischerweise organische Lösungsmittel zur Herstellung, was häufig zu einem Verlust der abgeschlossen Antigenität in Proteinantigenen 29,30. Darüber hinaus profitieren Sie von umfangreichen ICMVs Stabilität und die Fähigkeit, sowohl hydrophobe und hydrophile Moleküle 6 kapseln, wodurch eine Co-Lieferung der Antigene und Adjuvantien auf den gleichen intrazellulären Kompartiment in APCs 31,32 ausgerichtet. Verwendung ICMVs als Modell-Impfstoff Nanopartikel, hier haben wir die Verfahren dargelegtfür (1) Synthese von Nanopartikeln und Charakterisierung, (2) Validierung des Nanopartikels Entwässerung DLNs und Prüfung Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + T-Zell-Reaktionen unter Verwendung von (3) ein nicht-invasives Biolumineszenz Bildgebungsverfahren und (4) die Peptid-MHC- Tetramerfärbung Assay auf PBMCs.
Es ist entscheidend, um die Einheitlichkeit in der Synthese von Nanopartikeln von Charge zu Charge sicherzustellen, insbesondere für Partikelgröße und Oberflächenladung, da sie einen großen Einfluss auf lymphdrainage und die Aufnahme durch APCs bei in vivo Verabreichung. DLS und Zeta-Potential-Analyse eine schnelle Methoden der Qualitätsprüfung von der Partikelgröße und Oberflächenladung. Für eine detailliertere Analyse der Morphologie der einzelnen Partikel können diese Techniken mit hochauflösender Elektronenmikroskopie ergänzt werden, wie zum Beispiel Cryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), der Morphologie der "weichen" Partikel in verglaster wässrige Schicht 6,33,34 bewahrt . Einkapselungseffizienz von Antigenen und adjuvAmeisen muss auch festgestellt werden und gleichmäßig gehalten zwischen Synthesen. Adjuvantien wie MPLA kann mit einem Fluorophor markiert 6 wohinProteinAntiGene können mit Absorptions- und Fluoreszenz-basierte Proteinquantifizierung Kits quantifiziert werden oder analysiert Verwendung SDS-PAGE und Coomassie 35 oder Silberfärbung 36 und quantifiziert, basierend auf Bandenintensität werden . Inkonsistenzen in Partikelpräparat kann von abgelaufenen oder schlecht gelagert Reagenzien führen, da eine optimale Reaktionsfähigkeit für eine vollständige Synthese notwendig ist. Hierzu maleimide- und Thiol- funktionalisierten Reagenzien werden in kleinen Aliquots bei -80 ° C ohne häufigen Frost-Tau-Zyklen gehalten werden.
Partikel, die kleiner als 100 nm sind in der Regel angenommen, dass effektiv geben Sie die Lymphgefäße und Traffic auf DLNs 13, wohingegen größere Partikel (500-2000 nm) erfordern den aktiven Transport von Gewebeansässigen DCs 12,37. In unseren Händen, ICMVs mit der hydrodynamischen Größe im Bereich von 150 bis 250 nm effizient lokalisiert und beharrte auf dem dLN, was zu umfangreichen CTL und humorale Antworten 6,7. Innerhalb von 24 Stunden der Verabreichung wurden ICMVs mit subkapsulären Sinus Makrophagen in DLNs zugeordnet und durchflusszytometrischen Analysen an den Tagen 1 und 4 durchgeführt, zeigte, daß die meisten ICMVs innerhalb DLNs wurden von LN residenten APCs mit nur einem geringen Anteil von Teilchen mit Langerhans'schen zugeordnet getroffen und dermale DCs 7. Diese Ergebnisse zeigten, dass passiven Transport ist der Hauptmodus des ICMV Handel zu DLNs. Diese Studien haben Fluorophor-markierte Nanopartikel und Proteinantigene verwendet werden, um deren Lokalisierung und Verteilungsmuster in DLNs abzugrenzen. Konfokalmikroskopie von gefriergeschnitten DLNs können zusätzliche Immun Histochemie zur Identifizierung von LN Strukturen (zB GL-7-Expression in den Keimzentren) und Zellen, die Interaktion mit den Formulierungskomponenten (zB DCs - CD11c, Makrophagen - F4 / 80, CD169 und B- Zellen, & #8211; B220) 7,9. Diese Technik kann parallel mit Durchflusszytometrie Analyse von Zellen von DLNs geerntet, um die Teilmengen von APCs für Partikelaufnahme 7,9 verantwortlich Abgrenzung durchgeführt werden oder mit Ganztierbildgebung zu Impfstoff Lieferung von Injektionsstelle zu DLNs 38,39 quantifizieren, sofern die Fluoreszenzsignale sind stark und Gewebeautofluoreszenz nicht mit den Signalen stören.
Eine wirksame Immunisierung erfordert eine starke Aktivierung und Expansion von Antigen-spezifischen zytotoxischen T-Zellen, die durch Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung nach adoptiven Transfer von Biolumineszenz, Antigen-spezifische T-Zellen transgener aufgespürt werden kann, gefolgt von Impfung. Der Vorteil dieses Verfahrens ist die Möglichkeit zur wiederholten Darstellung von CTL Handel bei denselben Tieren über einen längeren Zeitraum, wodurch die Anzahl der Tiere, für immunologische Analysen erforderlich Verringerung und Vermeidung der Verwendung von mühsamen Zellisolierung procedures. Unter Verwendung dieses Abbildungstechnik, haben wir kürzlich gezeigt, daß die pulmonale Verabreichung von ICMVs mit Protein-Antigen und ein immunstimulierendes Mittel, mit CO bela führte zu potent Hervorrufen von antigenspezifischen CD8 + -T-Zellen in der Lunge und Mediastinum LNs und anschließende Verbreitung von CTLs zu distalen Schleimhautgeweben einschließlich Peyer-Plaques, Blinddarm und Vaginaltrakt 9. Durchflusszytometrische Analysen zeigten, dass diese neu erweiterten CD8 + T-Zellen wurden mit einem "Schleimhaut-homing" Phänotyp gekennzeichnet durch α 4 β 7 + Integrinexpression und vermittelt schützende Immunantworten gegen Schleimhaut virale Herausforderung 9 aufgedruckt. Die Ganztier-Bildgebung von biolumineszenten CD8 + T-Zellen wurde auch kürzlich von Hailemicheal et al., Die die Tumorantigen-Peptid in inkomplettem Freund'schen Adjuvans formuliert gezeigt verwendet (IFA, Öl-in-Wasser-Emulsion) ergab Sequestrierung von T-Zellen an der Stelle, der Injektionsmit Impfstoff "Depot" von den Tumormassen, die T-Zell-Dysfunktion und Löschung 40 führt.
Tetramer-Färbung wurde in der Vergangenheit ausgiebig verwendet, um die Konzentration des endogen CTL Antworten von verschiedenen Impfstoff-Formulierungen 21 resultierende quantifizieren. Diese Technik ist auch relevant und wird häufig in frühen menschlichen Krebsimmuntherapie klinischen Studien verwendet werden, um CTL-Reaktionen auf bestimmte tumorassoziierte Antigene 41,42 bestätigen. PBMCs leicht von Mäusen gesammelt und für die Durchflusszytometrie vorbereitet werden; sie jedoch nicht enthüllen kann das volle Ausmaß der T-Zell-Expansion durch Zellortung zu Depot bildenden Impfstoffen vor oder innerhalb von Tumoren in Krebsmodellen erwähnt, erfordern somit eingehender analysiert. Kompatibilität dieser Methode mit Durchflusszytometrie ermöglicht die Bestimmung von Antigen-spezifischen T-Zellen mit Speicher Marker (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2 und KLRG-1) bis Effektor zentralen Speicher und Effektor-Memory ce unterscheidenlls unter den Tetramer + T-Zellen 43 oder lang anhaltende Gewebe Wohnsitz CTLs 44,45 (wie in den letzten Bewertungen 46,47 zusammengefasst). Allerdings sieht die Tetramerfärbung Test nur die erste Bewertung der CTL-Reaktionen, da hoch erweitert Antigen-spezifischen T-Zellen können Anzeichen von Immun Erschöpfung 48,49 aufweisen. Funktionelle Bewertung von CTL-Reaktionen kann durch Untersuchen Zytokinfreisetzung mit enzymverbundenen immunospot (ELISpot) 50 oder intrazelluläre Zytokinfärbung 51 nach ex vivo-Stimulation von Lymphozyten mit minimalen Epitope sowie durch die Messung der intrazellulären Spiegel von Perforin und Granzyme B 52 und extrazellulären geführt werden Expression von CD107a Degranulation und CD107b auf 53. Zusätzlich kann zytolytische Funktion CTLs direkt mit CTL Zytotoxizitätsassays in vitro oder in vivo durchgeführt 54-56 beurteilt.
Induktion von humoralen ImmunantwortenNanopartikel nach Impfung kann parallel zu der CD8 + T-Zellen untersucht werden Analysen hier vorgestellt. Antikörpertiter kann durch die traditionelle Methode des Enzym-gebundenen Immunosorbent-Assay (ELISA) analysiert, während der Antikörperaffinität und Breite der Epitoperkennung durch Verändern der ELISA-Protokoll bei der Verwendung von chaotropen Mittels beurteilt werden (beispielsweise Harnstoff) während der Antikörperbindung an die Substrat und die Anwendung von Unterdomänen innerhalb Antigene als Substrate bzw. 7. Hervorrufen potenter humorale Antworten erfordert Ausbau des follikulären CD4 + T-Helferzellen (T fh) 57. Zur Expansion von T-Zellen in Reaktion fh Partikel Impfung zu untersuchen, kann das hier vorgestellte Protokoll leicht zur Isolierung von Antigen-spezifischen CD4 + T-Zellen von OT-II-transgenen Mäusen, gefolgt von einer adoptiven Zelltransfer in naive Empfängermäuse angepasst werden. Nach der Impfung kann lymphatischen Gewebe geerntet und mit durchflusszytometrischen analysiert werden Analysen zur AbschreckungMine Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen fh (durch ihre CD4 + CXCR5 + PD-1 + Phänotyp identifiziert) 7.
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Disclosures
Perkin Elmer, sofern die Produktionskosten bei der Veröffentlichung dieses Artikels entstehen.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das National Institute of Health gewähren 1K22AI097291-01 und von der Nationalen Zentrum für die Förderung der Translational Sciences der National Institutes of Health unter Preis Anzahl UL1TR000433. Wir erkennen auch Prof. Darrell Irvine am MIT und Prof. Matthias Stephan am Fred Hutchinson Cancer Center für ihren Beitrag auf der ersten Arbeiten auf den Impfstoff Nanopartikeln und OT-I / Luc transgenen Mäusen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
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