Introduction
Традиционные развития вакцины в основном использовали эмпирический подход опытной и ошибок. Тем не менее, с недавним развитием широкого спектра биоматериалов и открытий молекулярных детерминант иммунной активации, теперь можно рационально спроектировать вакцинных препаратов с биофизических и биохимических сигналов, полученных от патогенов 1,2. В частности, различные частицы платформы доставки лекарств были рассмотрены в качестве носителей вакцинных как они могут быть совместно с грузом субъединиц антигенов и иммуностимулирующих агентов, защищать компоненты вакцины от деградации и повышения их сотрудничество доставку антиген-представляющие клетки (АРС), проживающих в лимфе узлы (LNS), таким образом, максимально иммунную стимуляцию и активацию 3-5. В этом докладе мы описываем синтез "патогенных имитируя" системы наночастиц, называемые interbilayer сшитого многослойные везикулы (ICMVs), которые ранее были продемонстрированы как мощное platfor вакциным для надежных процессе индукции цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и гуморального иммунного ответа в обоих системных и слизистых тканей отсеков 6-9. В частности, вакцинация ICMVs достигается существенно повысить уровень IgG в сыворотке против малярийного антигена, по сравнению с вакцинацией с обычными вспомогательными веществами (например, квасцы и Montanide) 7, а также вызвало мощные ответов CTL против опухолевых клеток и вирусных моделей призов у мышей 9. Здесь, используя ICMVs как система наночастиц модель вакцины, мы опишем методы для характеризации нано-вакцин составов, в том числе размера частиц и дзета-потенциал измерений и отслеживания оборота частицы в дренирующих лимфоузлов (dLNs) с использованием конфокальной микроскопии в тканях cryosectioned 7. Кроме того, мы представляем весь животного изображений на основе метода анализа расширение ответов CTL у мышей после усыновителя передачи люциферазы выражения антиген-специфических CD8 + Т-клеток 9,10. Наконец, мы деписец тетрамер окрашивания мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) для продольной количественного эндогенных ответов Т-клеток у мышей, вакцинированных с наночастицами 6,9.
ICMVs являются липидов на основе наночастиц препарат синтезированы путем регулируемого синтеза простых липосом в многослойных структурах, которые затем химически стабилизированных сшивающих головных групп фосфолипидов малеимид-функционализированного в липидных слоев с дитиольному сшивающих агентов 6. После ICMVs синтезируются, небольшая часть наночастиц может быть использовано для определения размера частиц и дзета-потенциал (т.е. поверхностный заряд частиц) с (DLS) системы динамического светорассеяния и дзета-потенциал анализатора. DLS измеряет изменения в рассеянии света в суспензии частиц, что позволяет определение коэффициента диффузии и гидродинамического размера частиц 11. Достижение последовательной размер частиц от партии к партии синтеза является критическимс размером частиц является одним из основных факторов, влияющих на лимфатический дренаж частиц вакцины в dLNs и последующего клеточного поглощения БТР 12,13. Кроме того, дзета-потенциал может быть получен путем измерения скорости частиц, когда электрический ток подводится, которая позволяет определять электрофоретической подвижности частиц и поверхности частиц заряда 11. Обеспечение последовательного дзета-потенциал значения частиц является важным, поскольку поверхностный заряд частиц определяет стабильность коллоидного, который имеет непосредственное влияние на дисперсию частиц во время хранения и после введения в естественных условиях 14,15. Для того, чтобы отслеживать локализацию частиц в dLNs, ICMVs могут быть помечены с заданными флуорофорами в том числе липофильных красителей и ковалентно-меченых антигенов. После иммунизации мышей может быть умерщвлены в различные моменты времени, dLNs резекции, cryosectioned и анализировали с конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет визуализировать лимфатической DraIНин обоих перевозчиков и антигена dLNs вакцин наночастиц. Разделы ткани могут быть дополнительно окрашены флуоресцентной меченых антител и используется для получения более подробной информации, такие как типы клеток, связанных с антигеном и формирования зародышевых центров, как мы показали, ранее 7.
После синтеза частиц оптимизирован и торговля в dLNs подтвердится, это очень важно для проверки выявление в в естественных условиях расширения CTL. Для того чтобы проанализировать извлечение антиген-специфических CD8 + Т-клеток в ответ на вакцинацию наночастиц, мы использовали модели антиген, овальбумин (OVA), с OVA 257-264 пептида (SIINFEKL) иммунодоминантном CD8 + Т-клеточного эпитопа, который позволяет детально иммунологические анализы антиген-специфических ответов Т-клеток для первоначального 16,17 разработки вакцины. В частности, допрашивать динамику расширения и миграции антиген-специфических CD8 + Т-клеток, мы сформировалидважды трансгенной мышиной модели, пересекая люциферазы светляков-выражения трансгенных мышей (Luc) с OT-I у трансгенных мышей, которые обладают CD8 + Т-клеток с Т-клеточного рецептора (TCR), специфичные для SIINFEKL (в связи с Н-2К б). Из этих мышей ОТ-I / Luc, экспрессирующих люциферазы, ОТ-я CD8 + Т-клетки могут быть выделены и подготовлены для передачи в приемной наивных мышей C57BL / 6. После семенами, успешное иммунизация OVA-наночастиц приведет к расширению переданных Т-клеток, которые можно отслеживать с помощью мониторинга сигнал биолюминесценции с всей системы формирования изображений животных 9,10. Это неинвазивный метод визуализации всего тела был использован с другими вирусными или опухолевых антигенов в прошлом 18-20, выявление процессов, участвующих в разложении Т клеток в лимфоидных тканей и распространения в периферических тканях в продольном образом.
В дополнение к анализу адаптивно переданных антиген-специфических CD8 + Т-клеток, endogenoСША T-клеточные ответы после вакцинации могут быть рассмотрены с пептидом главного комплекса гистосовместимости (МНС) тетрамер анализа 21, в котором тетрамер комплекс пептид-МНС, состоящая из четырех флуорофора с метками МНС-молекул класса I, загруженной с пептидных эпитопов, используют чтобы связать TCR и этикеток CD8 + Т клеток в антиген-специфическим образом. Пептид-МНС тетрамер анализ может выполняться либо в терминальных вскрытии исследований для выявления антиген-специфических CD8 + Т-клеток в лимфоидных и периферических тканях или в продольных исследованиях с мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК), полученных от последовательный забор крови. После окрашивания лимфоцитов с пептид-МНС тетрамер, проточной цитометрии анализа выполняется для детального анализа на фенотип ЦТЛ или количественной оценки их частоты среди CD8 + Т-клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты, описанные в этом протоколе были одобрены Университета Комитета по использованию и уходу за животными (UCUCA) в Университете Мичигана и осуществляется в соответствии с установленными правилами и руководящими принципами.
1. Синтез и характеристика ICMVs Co загружены белкового антигена и адъюванта молекул
- Смешайте 1: 1 мольное отношение 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-фосфохолин (DOPC) и 1,2-dioleoyl- зп глицеро-3-phosphoethanolamine- N - [4- (п -maleimidophenyl) бутирамид] (МПБ) в хлороформе, сохраняя общее количество липидов в 1,26 мкмоль на пакете (т.е. 500 мкг DOPC и 630 мкг MPB) в стекл нный сосудик на 20 мл (диаметр = 28 мм и высотой = 61 мм).
- Добавить липофильные препараты, такие как монофосфориллипида А (MPLA) или липофильных красителей (например, сделал), к липидной раствора при требуемой концентрации. Тщательно удаления органического растворителя путем продувки очень сухой nitrogeн газ и размещения образцов в вакууме O / N.
- Гидрат липидной пленки путем добавления 200 мкл 10 мМ трис-пропан (БТП, рН 7,0), содержащего водорастворимые препараты (например, белковых антигенов). Вихревые в течение 10 сек каждые 10 мин в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Перенесите содержимое из стекла флакона в 1,5 мл трубки микроцентрифужных, место образцы в ледяной бане, и разрушать ультразвуком непрерывно в течение 5 мин с использованием интенсивности настройки на 125 Вт / 20 кГц зонд наконечника ультразвуком 40%.
- Добавьте 4 мкл 150 мМ дитиотреитола (DTT), чтобы каждой партии (рабочей концентрации 2,4 мМ), вихря, и кратко центрифуге с использованием настольный микроцентрифужных.
- Добавить 40 мкл 200 мМ CaCl 2 и смешать с пипетки (рабочей концентрации 33 мМ). Инкубируйте образцы при 37 ° С в течение 1 часа, чтобы позволить сшивание МПБ, содержащей липидные слои с DTT.
- Центрифуга образцов при 20000 мкг в течение 15 мин, удалить супернатант, и ресуспендируют в 200 мкл ddiH 2 O.
- Повторите шаг 1,7 и центрифуги снова после второго ddiH 2 O стирки для удаления CaCl 2, непрореагировавший DTT, и разинкапсулировать грузовых материалы из супернатанта.
- Подготовка 10 мг / мл 2 кДа полиэтиленгликоль-тиола (ПЭГ-SH) в ddiH 2 O. Ресуспендируют каждый образец ICMV в 100 мкл ПЭГ-SH раствора и инкубируют при 37 ° С в течение 30 мин.
- Выполните два ddiH 2 O моет (шаг 1.7) и ресуспендируют окончательный осадок в ICMV PBS и хранят при температуре 4 ° С. Перед использованием смешать суспензию ICMV, а частицы могут оседать на дно после длительного хранения.
- Для характеристики частиц, удалить небольшую аликвоту (~ 10%) ICMVs из каждой партии и разбавить по отдельности в общем объеме 1 мл ddiH 2 O. Поместите один образец в размере Zetasizer клеток и мера частиц, индекс полидисперсности и дзета-потенциала образцов с использованием DLS и дзета-потенциал измерительной системы (в соответствии с протоколом производителя).
2. Рассмотрение лимфоузлов Слив флуоресценции-метками ICMVs с конфокальной микроскопии
- Подготовка ICMVs загружен флуорофора с метками антигена и липофильных флуоресцентного красителя
- Подготовка флуорофора с метками белка, такие как яичный белок взаимодействует с Alexa Fluor 555-сукцинимидиловым эфира, в соответствии с инструкцией завода-изготовителя.
- Чтобы приготовить ICMVs помеченные флуорофора в липидной оболочки, добавить липофильный флуоресцентный краситель (например, 1,1'-диоктадецил-3,3,3 ', 3'-Tetramethylindodicarbocyanine, (сделал)) в процессе подготовки липидной пленке (этап 1.2) в количестве 0,05% молярного липидов. Для липидной пленки гидратации (этап 1.3), использование буфера, содержащего флуорофора с метками антиген, и полного синтеза ICMV, как описано в пунктах 1.4-1.11.
- Подкожное введение наночастиц в основание хвоста
- Обезболить мышь с помощью контролируемого потока испарителя, оснащенный индукции камеры ütilizing 3% изофлуран и 1,5 л / мин в потоке кислорода в соответствии с утвержденным протоколом IACUC животных. После того, как мышь находится в бессознательном состоянии, выполните следующие действия быстро до анестезии носить с для оптимального доступа к месту инъекции и свести к минимуму дискомфорт для животного. Кроме того, пользоваться правильно подобранным носовой конус для поддержания анестезии. Если мышей под наркозом в течение более 5 мин, применять смазку, необходимую для глаз, чтобы минимизировать раздражение после процедуры.
- Спрей основания хвоста с 70% этанола для дезинфекции и влажной мех часть влажные волосы, чтобы выставить небольшой участок видимой кожи, которая может быть использована для визуализации иглы под кожу.
- Приготовления инъекции суспензии частиц, содержащий желаемое количество антигена и адъюванта на 100 мкл дозы вакцинации в PBS (например, 10 мкг OVA и 0,3 мкг MPLA на 100 мкл дозы впрыска были использованы в прошлом 6,9).
- Нарисуйте суспензии частиц IntOA шприц с иглой 27-29 G и вставить иглу в основание хвоста (~ 5 мм от линии роста волос) с фаской вверх и вводят 50 мкл суспензии 22 частиц.
- Подождите несколько секунд, чтобы уравнять давление, чтобы предотвратить чрезмерное обратного потока и вытащите иглу. Повторите инъекции на другой стороне основания хвоста целевой как дренирующие паховые LNS.
- Подготовка лимфоузлов криосрезов и обследование с конфокальной микроскопии.
- Эвтаназии мышь с CO 2 удушья, а затем индуцированного пневмоторакса в соответствии с утвержденным протоколом IACUC животных. Экстракт паховые LNS в соответствии с протоколом продемонстрировано в Bedoya 23 и промыть кровь путем помещения ткани в 1 мл 4 ° C PBS.
- Собрать PBS из тканей с тканями и поставить ткань в ткани cryomolds (10 х 10 х 5 мм 3), предварительно заполнен до верхней с октября замораживания среднего 24. Привязать заморозить ТИСв суд блок в жидком азоте в течение 30 сек. В качестве альтернативы, блок поместить ткани на сухом льду в течение 30 мин. Хранить замороженные ткани в -80 ° C морозильнике.
- Сокращение срезов ткани толщиной 5-10 мкм в криостате установлен при -20 ° С 24.
- При необходимости, выполните иммунофлюоресценции маркировки, и изучить ткани с конфокальной микроскопии, как было показано ранее 24.
3. Контроль Расширение антиген-специфические, люциферазы-экспрессирующих CD8 + Т-клеток после вакцинации наночастиц с целого животного изображений
- Выделение OVA-специфических 257-264 люциферазы, экспрессирующих CD8 + Т-клеток от ОТ-I / Luc трансгенных мышей
- Эвтаназии в трансгенной мыши OT-I / Luc с СО 2 удушья и вызвать пневмоторакс в соответствии с утвержденным протоколом IACUC животных. Урожай селезенки в стерильных условиях путем доступа в брюшную полость и осторожно отсоединения ткани из поджелудочной железы 23, иМесто в 5 мл 4 ° C PBS + 2% FBS для передачи капот культуры ткани.
- Поместите селезенки на нейлоновой фильтр 70 мкм на 50 мл коническую центрифужную пробирку (до 3 селезенке в то время). Использование плунжера из 3 мл шприц, клетки измельчить через сито.
- Вымойте поршень и сетчатый фильтр с PBS + 2% FBS и выбросить. Довести общий объем до 10 мл / селезенки в 50 мл трубки, взять небольшой образец суспензии клеток считаться с гемоцитометра и центрифуги в течение 10 мин при 300 х г.
- Использование имеющихся в продаже магнитного негативное комплект выбора, изолировать популяции клеток CD8 + T, следуя инструкциям изготовителя.
- После промывки клеток с PBS, подсчитывают количество выделенных CD8 + Т-клеток. Для оценки чистоты выделенных CD8 + Т-клеток, инкубировать ~ 20,000-30,000 клеток в 20 мкл мышиного CD16 / 32 антитела (0,025 мг / мл) в течение 10 мин, затем добавить 20 мкл αCD8-APC антитела (0,005 мг / мл) и инкубировать в течение 30 мин. Физ Раrform Все инкубации при 4 ° С в PBS + 1% вес / объем BSA. Выполните анализ потока цитометрии 25.
- Приемные Передача изолированных CD8 + Т-клеток и визуализация их расширение после вакцинации
- Выполнение приемных передачи изолированных OT-I / Люк CD8 + Т-клеток в наивных мышей C57BL / 6 путем введения 1-10 × 10 5 клеток в объеме 200 мкл PBS посредством внутривенной инъекции в хвостовую вену 22 (-1 день). Учитывая, что меховые и черный кожи патчи в C57BL / 6 мышей может вмешиваться в биолюминесценции сигнала, побрился альбиносов C57BL / 6 мышей идеально подходят для этих исследований.
- После одного дня (день 0), прививку, как описано ранее (раздел 2.2).
- Администрирование 150 мг люциферин на кг веса тела мыши внутрибрюшинно в объеме 300 мкл PBS. Через 10 мин, обезболить мышей с изофлуран (как в шаге 2.2.1) и визуализировать OT-I / Люк CD8 + Т-клеток путем приобретения сигнал биолюминесценции в течение 5-10 мин сIth всей системы формирования изображения животных (ИВИС, см Уилсон 26 для подробной инструкцией). При необходимости повторите для продольных исследований.
4. Пептид-МНС тетрамеров Окрашивание РВМС для анализа антиген-специфических клеток CD8 + Т-
Примечание: В следующей процедуре протокола может быть выполнена с использованием либо мышей C57BL / 6 адаптивно передаваемые с OT-I / Люк CD8 + Т-клеток или C57BL / 6 мышей без приемных передачи.
- В нужной точке времени после вакцинации, собирать около 100 мкл крови (4-6 капли) от мышей через подчелюстной техники кровотечение 27 в трубку, покрытую К 2 EDTA и инвертировать несколько раз, чтобы предотвратить свертывание.
- Передача 100 мкл крови в микроцентрифужных трубки, добавляют 1 мл буфера для лизиса и инкубировали в течение 2 до 3 мин, чтобы удалить эритроциты (эритроцитов). Центрифуга образцов в течение 5 мин при 1500 мкг и удалить супернатант. Если осадок ещеppears красные (с указанием неполное удаление эритроцитов), повторите шаг лизиса с кратковременной инкубации (<1 мин) буфера для лизиса.
- Промыть оставшиеся МНПК 1 мл FACS буфера (PBS + 1% вес / объем BSA) и центрифуге при 1500 х г в течение 5 мин.
- Аспирата супернатант и ресуспендируют образца в 20 мкл мышиного CD16 / 32 антитела (0,025 мг / мл), чтобы блокировать неспецифическую и FcR-опосредованного связывания антитела. Инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре.
- Трансфер клетки от микропробирок в 4 мл с круглым дном FACS труб. Добавьте 20 мкл H-2K б решения OVA Тетрамер-SIINFEKL-PE в соответствии с требованиями завода-изготовителя для каждого образца и инкубировать в течение 30 мин на льду.
- Подготовьте смесь антител (например, αCD8-APC, αCD44-FITC, и αCD62L-PECy7 антитела (0,005 0,005 0,002 мг / мл концентрация, соответственно)). Добавьте 20 мкл каждой экспериментального образца, и инкубировать в течение 20 мин на льду. Подготовьте отдельные элементы управления флуорофорные от Лос-Анджелесаbeling клетки с каждого флуорофора с метками тетрамера или антитела в концентрации, указанной выше.
- Промыть 2 раза FACS буфера и ресуспендируют конечный осадок в FACS буфере, содержащем 2 мкг / мл DAPI. Клетки готов к проточной цитометрии (подробности и примеры можно найти в Scheffold 25).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этапы в синтезе ICMVs показаны на рисунке 1 6. Вкратце, липидную пленку, содержащую любые липофильные препараты или флуоресцентные красители гидратируют в присутствии гидрофильных лекарств. Двухвалентные катионы, такие как Ca 2+, добавляют привод сплав анионных липосом в многослойные везикулы. Дитиольному сшивающий агент, такой как DTT, добавляют к "сшивание" малеимид-функционализированного липидов на липидные слои соединяющий, и, наконец, остальные внешние группы малеимида закаливают в реакции с тиолированным-PEG остатков. Небольшая часть каждой партии может быть легко подвергнуты измерениям контроля качества путем определения размера частиц, индекс полидисперсности и дзета-потенциал с DLS и дзета-потенциал системы анализа. Полученные частицы являются относительно однородными со средним размером 130 ± 20 нм, полидисперсность индекса 0,22 ± 0,02 и дзета-потенциала от -54 мВ ± 3 для OVA-инкапсуляции рстатьи (рис 1B и 1C). Типичный выход частиц, измеренный в сухом весе частиц, составляет ~ 50% 6.
Используя протокол, описанный выше, может быть ICMVs совместно загружен флуорофора-меченого антигена белка и флуоресцентного липофильного красителя, что позволяет визуализировать антигена и наночастиц доставки в естественных условиях. Для сравнения образцы доставки антигена в растворимой форме в сравнении с ICMVs, мышей C57BL / 6 вводили подкожно в основание хвоста 100 мкг AlexaFluor555-меченый OVA либо растворимых или же меченных ICMV составы и дренирующих паховых лимфоузлов вырезали при различных моменты времени для подготовки дин ткани крио-секций. Визуализация с конфокальной микроскопии показали, что растворимый антиген быстро достигли dLNs в течение 4 часов, но также очищается очень быстро с 24 часов (рис 2) 7. В противоположность этому, OVA-загружена ICMVs были обнаружены на периферии dLNs на 24 ч, при продолжении накопленияа исследовали на 4 день, хранение большого количества OVA-ICMVs в dLNs (рисунок 2). Конфокальные микрофотографии также показали совместной локализации AlexaFluor555-меченых OVA и делали меченных ICMVs пределах dLNs, предполагая, что ICMVs разрешить совместное стабильную доставку белковых антигенов и других иммуностимулирующих агентов, инкапсулированных в ICMVs 7.
Выделение CD8 + Т-клеток от ОТ-I / Luc трансгенной мыши, могут быть легко выполнены с коммерчески доступного набора магнитного отрицательного отбора, получая ~ 8-12 × 10 6 клеток в селезенке мышей. Рисунок 3 показывает мышей C57BL / 6 адаптивно передаваемые с 5 х 10 5 OT-I / Люк CD8 + Т-клеток на день -1, и иммунизацию в день 0 подкожно администрации 10 мкг OVA и 0,3 мкг МПЛА либо в растворимых или ICMV составов. Биолюминесценция изображения с ИВИС осуществляется в день 0 до вакцинации показали минимальный сигнал OT-I / Luc. Тем не менее, по 4-й день после вакцинации мышей, иммунизированныхс OVA / МПЛА-ICMVs была надежной биолюминесценции сигнал в пределах паховых лимфоузлов, которые LNS дренажные базовый регион хвост 28. В противоположность этому, у мышей, иммунизированных растворимой формы вакцины показали значительно сниженной расширение OT-I / Люк CD8 + Т-клеток в паховых dLNs.
Использование OVA в качестве модели антигена позволяет осуществлять мониторинг расширения эндогенных CD8 + Т-клеток, специфичных для иммунодоминантной OVA 257-264 пептида (SIINFEKL). Например, мыши C57BL / 6 иммунизировали в дни 0, 21 и 35 с подкожного введения 10 мкг OVA и 0,3 мкг MPLA в любом ICMVs или растворимой форме, и частоты SIINFEKL-специфических CD8 + Т-клеток среди CD8 + Т-клеток в РВМС были определены с помощью проточной цитометрии анализа РВМС окрашенных SIINFEKL-Н-2К б тетрамер-PE. фиг.4А показаны репрезентативные проточной цитометрии графиков разброса SIINFEKL-Н-2К б тетрамера + клеток среди CD8 + Т-клеток в РВМС на 41 день 6. Figurе 4В показаны репрезентативные разброс участков CD62L + CD44 + клеток с центральной фенотипа памяти среди SIINFEKL-тетрамере + CD8 + Т-клеток. Еженедельный мониторинг РВМС, показанных на фигуре 4C показано, что растворимый вакцина OVA лишь минимальное расширение антиген-специфических CD8 + Т-клеток, в то время как ICMV вакцинации вызывали значительно сильнее ответов CD8 + Т-клеток, достигая пика 28% SIINFEKL-тетрамер + Т-клеток в CD8 + Т-клеток населения в день 41 6. Использование протокола окрашивания тетрамер представленные здесь, мы наблюдали фоновый частоту 0,11% ± 0,04% OVA-специфических Т-клеток (N = 15) в необработанных или PBS-обработанных животных, и мы можем обнаружить Статистически значимое увеличение антиген-специфических CD8 + Т-клеток частот, как низко как 0,46% ± 0,05% (величина р <0,005, данные не показаны).
Рисунок 2. Анализ антигена слива лимфатические узлы с конфокальной микроскопии. Мышей C57BL / 6 иммунизировали 100 мкг флуорофора-сопряженных OVA (показано красным) и 5 мкг MPLA либо в растворе, либо ICMVs (показанного на синий). Слив паховые лимфатические узлы вырезали в указанных временных точках, cryosectioned и полученную с конфокальной микроскопии. Представительства конфокальные микрофотографии показаны. Розовые сигналы указывают совместной локализации OVA и ICMVs. Эта цифра была изменена с Луны и др. 7. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры. 
Рисунок 3. MonitorinG T расширение клеток после вакцинации. C57BL / 6 мышей-альбиносов адаптивно переданы IV с 5 × 10 5 Люк + OT-я CD8 + Т-клеток в день -1. В день 0 животным вводили 10 мкг OVA и 0,1 мкг MPLA либо растворимых или ICMV составов. Животных под наркозом с изофлуран и управляться с люциферина (150 мг / кг, 300 мкл вводили внутрибрюшинно), и сигнал от биолюминесценции Люк + OT-1 CD8 + Т-клеток была приобретена с ИВИС. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этого фигура. 
Рисунок 4. Расширение эндогенных ОВА-специфичных CD8 + Т-клеток после вакцинации ICMV. C57Bl / 6 мышей, иммунизированных 10 мкг OVA и 0,1 мкг МПЛА либо ян раствор или ICMVs в дни 0, 21 и 35 (стрелки). Частота OVA-специфических Т-клеток среди мононуклеарных клеток периферической крови оценивали с течением времени по проточной цитометрии анализа SIINFEKL-MHC-I тетрамера + CD8 + Т-клеток. () Представитель проточной цитометрии разброс участков из отдельных мышей в день 41-шоу SIINFEKL МНС-I тетрамере + CD8 + Т-клеток и (В) CD62L + CD44 + клеток, маркера центральных Т-клеток памяти. (C) общий кинетика Т клеток расширения и сжатия показана. Эта цифра была изменена с Луны и др. 6. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию рисунке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол в этой статье описан синтез и характеристику новой липидной основе системы наночастиц, называемый ICMVs, и обеспечивает процесс проверки эффективности вакцинных препаратов на основе наночастиц, чтобы вызвать антиген-специфических CD8 + Т-клеточные ответы. Синтез ICMV завершена во всех водном состоянии, что является важным преимуществом по сравнению с другими, обычно используемых полимерных систем наночастиц (например, поли (лактид-со-гликолид) частицы кислоты), которые, как правило, требуют органических растворителей для подготовки, что часто приводит к потере Антигенность в белковых антигенов 29,30. Кроме того, польза от ICMVs обширной стабильности и способности для инкапсуляции как гидрофобные, так и гидрофильные молекулы 6, таким образом, возможность совместного доставки антигенов и адъювантов, нацеленных на той же внутриклеточный компартмент в АРС 31,32. Использование ICMVs как наночастицы модель вакцины, здесь мы наметили процедурыдля (1) синтеза наночастиц и характеристик, (2) проверки наночастиц дренажа в dLNs и экспертизы процессе индукции антиген-специфических CD8 + Т-клеточных реакций с использованием (3) неинвазивный метод визуализации биолюминесценции и (4) пептид-MHC Тетрамер окрашивание анализ на МНПК.
Это имеет решающее значение для обеспечения единообразия в синтезе наночастиц от партии к партии, особенно для размера частиц и поверхностного заряда, как они могут сильно повлиять на лимфатический дренаж и поглощение БТР По в естественных условиях администрации. DLS и дзета-потенциал анализа обеспечивают быстрые методы проверки качества на размер частиц и поверхностного заряда. Для получения более подробных анализов на морфологию отдельных частиц, эти методы могут быть дополнены с высоким разрешением электронной микроскопии, такие как крио-электронной микроскопии (крио-ЭМ), который сохраняет морфологию "мягких" частиц в стекловидной водного слоя 6,33,34 , Эффективность инкапсуляции антигенов и adjuvМуравьи также должны быть определены и поддерживаться равномерная между синтезов. Адъюванты, такие как MPLA, могут быть помечены с флуорофором 6, тогда как белковые антигены могут быть количественно с использованием absorbance- и флуоресценции на основе наборов Количественную оценку белка или анализировали с использованием SDS-PAGE и Кумасси 35 или окрашиванием серебром 36, и количественно на основе интенсивности полос , Несоответствия в подготовке частиц может привести от просроченных или плохо хранятся реактивы, а оптимальная реактивность необходимо для полного синтеза. Для этого, maleimide- и тиол Функционализованные реагенты должны храниться в небольших аликвотах при -80 ° С без частых циклов замораживания-оттаивания.
Частицы размером менее 100 нм, как правило, считали эффективно ввести лимфатические сосуды и трафик на dLNs 13, в то время как более крупные частицы (500-2000 нм) требует активного транспорта по ткани резидентом ДК 12,37. В наших руках, ICMVs с гидродинамической размером от 150-250 нм эффективно локализованы и сохраняется в дин, в результате обширного CTL и гуморального ответов 6,7. В течение 24 ч введения, ICMVs были связаны с субкапсулярную пазухи макрофагов в dLNs, проточной цитометрии и анализов выполнены в дни 1 и 4 показано, что большинство ICMVs пределах dLNs были подхвачены LN-резидентов АРС только небольшой части частиц, связанного с Лангерганса и кожные ДК 7. Эти результаты показывают, что пассивный транспорт является основным способом торговли ICMV к dLNs. Эти исследования использовали флуорофорные-тегами наночастиц и белковых антигенов, чтобы очертить их локализации и распределения, в dLNs. Конфокальной микроскопии cryosectioned dLNs позволяет дополнительно иммунофлюоресценции гистохимии для идентификации LN структур (например, GL-7 выражение в зародышевых центрах) и клетки, взаимодействующие с компонентами композиции (например, контроллеры домена - CD11c, макрофагов - F4 / 80, CD169, и В- клетки и #8211; В220) 7,9. Эта методика может быть выполнена параллельно с проточной цитометрии анализа клеток, полученных из dLNs очертить подмножества АРС, ответственных за поглощение частицы 7,9 или изображений вся животного для количественного доставку вакцины от инъекции, чтобы dLNs 38,39, при условии, что флуоресцентные сигналы достаточно сильны и тканей флуоресценции не мешает с сигналами.
Эффективное иммунизации требуется надежную активацию и расширение антиген-специфических цитотоксических Т-клеток, которые можно отслеживать с биолюминесценции визуализации всего тела после приемных передачи биолюминесцентного, антиген-специфических Т-клеток трансгенных с последующим вакцинации. Дополнительным преимуществом этого метода является возможность повторного визуализации торговли CTL в тех же животных в течение длительного периода, тем самым снижая количество животных, необходимых для иммунологических анализов и избегая использования кропотливой изоляторе procedurES. Используя эту технику изображения, мы недавно показали, что легочная администрация ICMVs со загружены белка антигена и иммуностимулирующее средство привело к мощному процессе индукции антиген-специфических CD8 + Т-клеток в легких и средостения LNs и последующего распространения ЦТЛ в дистальных слизистой ткани , в том числе патчи Пейера, слепой, и вагинальный тракта 9. Цитометрический анализ показал, что эти вновь расширенные CD8 + Т-клетки отпечатаны с "слизистую оболочку самонаведения" фенотипа характеризуется α 4 β 7 + интегрина выражение и опосредованных защитные иммунные реакции против вирусного заражения слизистой оболочки 9. Весь животного визуализации биолюминесценции CD8 + Т-клеток также недавно использованы Hailemicheal и др., Которые показали, что опухолевый антиген пептид, сформулированы в неполном адъюванте Фрейнда (IFA, эмульсии масло-в-воде) в результате секвестрации Т-клеток на месте впрыскас вакциной "депо" от опухолевых масс, что приводит к дисфункции клеток Т и удаления 40.
Окрашивание Тетрамер широко использовались в прошлом для количественной оценки уровня эндогенных ответов CTL в результате различных составов 21 вакцин. Этот метод также имеет отношение и широко используются в начале человека иммунотерапии рака клинических испытаний, чтобы подтвердить ответы ЦТЛ в конкретных опухолевых антигенов 41,42. МНПК могут быть легко собраны от мышей и подготовлены для проточной цитометрии; Однако, он не может раскрыть в полной мере расширения Т-клеток из-за клеток локализации в депо-образующих вакцин, как упоминалось ранее, или в опухоли в моделях рака, что требует более глубокого анализа. Совместимость этого метода проточной цитометрии с позволяет определить антиген-специфических Т-клеток с маркерами памяти (CD44, CD62L, CD127, Bcl-2, и KLRG-1), чтобы отличить эффектор, центральную память и эффекторной CE памятизаполняет среди тетрамерных + Т-клеток или тканей 43 резидентов ЦТЛ длительного действия (44,45 Как показано в недавних обзорах 46,47). Тем не менее, окрашивание тетрамера анализ обеспечивает только начальную оценку ЦТЛ-реакций, так как высоко-расширенные антиген-специфические Т-клетки могут проявлять признаки истощения иммунной 48,49. Функциональная оценка ЦТЛ-реакций могут быть выполнены путем анализа выпуска цитокинов с ферментом, связанным immunospot (ELISPOT) 50 или внутриклеточного окрашивания цитокинов после 51 экс виво стимуляции лимфоцитов с минимальными эпитопов, а также путем измерения внутриклеточных уровней перфорин и гранзима 52 и внеклеточной выражение CD107a и CD107b на дегрануляции 53. Кроме того, функция Цитолитическую ЦТЛ могут быть непосредственно оценивается с CTL цитотоксичности, выполненных в пробирке или в естественных условиях 54-56.
Индукции гуморальных иммунных ответовпосле вакцинации наночастиц можно изучать параллельно с клетки CD8 + Т-анализа, представленные здесь. Титры антител могут быть проанализированы с помощью традиционного метода иммуноферментного анализа (ELISA), а сродство антител и ширина распознавания эпитопа может быть оценена путем модификации протокол ELISA с использованием хаотропного агента (например, мочевина) при связывания антител с субстрат и использование субдоменов течение антигенов в качестве субстратов, соответственно 7. Выявление мощных гуморального ответов требует расширения фолликулярная вспомогательных CD4 + Т-клеток (Т FH) 57. Чтобы исследовать расширение Т FH клеток в ответ на вакцинацию частиц, протокол, представленные здесь, могут быть легко приспособлены для выделения антиген-специфических CD4 + Т-клеток из трансгенных мышей ОТ-II, с последующим переводом в приемной клеток наивных мышей-реципиентов. После вакцинации, лимфоидные ткани могут быть собраны и проанализированы с помощью проточной цитометрии анализ, чтобы удержатьмой расширение антиген-специфических Т клеток FH (идентифицируются по их CXCR5 + PD-1 + фенотипа CD4 +) 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Perkin Elmer при условии, себестоимость производства, понесенных в течение публикации этой статьи.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным институтом здравоохранения предоставлять 1K22AI097291-01 и Национального центра Продвижение поступательного наук Национальных Институтов Здоровья в премии Количество UL1TR000433. Мы также признаем, профессор Даррелл Ирвайн в Массачусетском технологическом институте и профессор Маттиас Стефана в Фреда Хатчинсона онкологический центр за их вклад в первоначальной работы по наночастиц вакцин и OT-I / Luc трансгенных мышей.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1. Synthesis and characterization of ICMVs co-loaded with protein antigen and adjuvant molecules | |||
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB) | Avanti Polar Lipids, INC. | 870012 | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids, INC. | 850375 | |
| Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD™) (MPLA) | Avanti Polar Lipids, INC. | 699800 | |
| 20 ml glass vials | Wheaton | 0334125D | |
| Symphny Vacuum Oven | VWR | 414004-580 | |
| Ovalbumin (OVA) | Worthington | 3054 | |
| Bis-Tris Propane (BTP) | Fisher | BP2943 | |
| Q125 Sonicator (125 W/20 kHz) | Qsonica | Q125-110 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Fisher | BP172 | |
| 2 kDa Thiolated Polyethylene Glycol (PEG-SH) | Laysan Bio | MPEG-SH-2000-1g | |
| Malvern ZetaSizer Nano ZSP | Malvern | ||
| ZetaSizer Cuvettes | Malvern | DTS1070 | |
| 2. Examination of lymph node draining of fluorescence-tagged ICMVs with confocal microscopy | |||
| 1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID) | Life Technologies | D-7757 | |
| Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS) | Life Technologies | A37571 | |
| Tissue-Tek OCT freezing medium | VWR | 25608-930 | |
| Tissue Cryomolds | VWR | 25608-922 | |
| 3. Monitoring expansion of antigen-specific, luciferase-expressing CD8+ T cells after nanoparticle vaccination with whole animal imaging | |||
| C57BL/6 mice | Jackson | 000664 | |
| Albino C57BL/6 mice | Jackson | 000058 | |
| OT-1 C57BL/6 mice | Jackson | 003831 | |
| 70 μm nylon strainer | BD | 352350 | |
| EasySep™ Mouse CD8+ T Cell Isolation Kit | StemCell | 19853 | |
| IVIS® whole animal imaging system | Perkin Elmer | ||
| 4. Peptide-MHC tetramer staining of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) for flow cytometric analysis of antigen-specific CD8+ T cells | |||
| K2EDTA tubes | BD | 365974 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Anti-CD16/32 Fc Block | Ebioscience | 14-0161-86 | |
| H-2Kb OVA Tetramer | MBL | TS-5001-1C | |
| Anti-CD8-APC | BD | 553031 | |
| Anti-CD44-FITC | BD | 553133 | |
| Anti-CD62L-PECy7 | Ebioscience | 25-0621-82 | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI) | SIGMA | D8417-10MG | |
| CyAn Flow Cytometer | Beckman Coulter | ||
| FlowJo Software | FlowJo | ||
References
- Irvine, D. J., Swartz, M. A., Szeto, G. L. Engineering synthetic vaccines using cues from natural immunity. Nature materials. 12, 978-990 (2013).
- Moon, J. J., Huang, B., Irvine, D. J. Engineering nano- and microparticles to tune immunity. Advanced materials. 24, 3724-3746 (2012).
- Sahdev, P., Ochyl, L. J., Moon, J. J. Biomaterials for nanoparticle vaccine delivery systems. Pharmaceutical Research. , (2014).
- Zhao, L., et al. Nanoparticle vaccines. Vaccine. 32, 327-337 (2014).
- Riet, E., Ainai, A., Suzuki, T., Kersten, G., Hasegawa, H. Combatting infectious diseases; nanotechnology as a platform for rational vaccine design. Advanced drug delivery reviews. 74C, 28-34 (2014).
- Moon, J. J., et al. Interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles as synthetic vaccines for potent humoral and cellular immune responses. Nature Materials. 10, 243-251 (2011).
- Moon, J. J., et al. Enhancing humoral responses to a malaria antigen with nanoparticle vaccines that expand Tfh cells and promote germinal center induction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 1080-1085 (2012).
- DeMuth, P. C., Moon, J. J., Suh, H., Hammond, P. T., Irvine, D. J. Releasable layer-by-layer assembly of stabilized lipid nanocapsules on microneedles for enhanced transcutaneous vaccine delivery. ACS Nano. 6, 8041-8051 (2012).
- Li, A. V., et al. Generation of Effector Memory T Cell-Based Mucosal and Systemic Immunity with Pulmonary Nanoparticle Vaccination. Science Translational Medicine. 5, 204ra130 (2013).
- Stephan, M. T., Moon, J. J., Um, S. H., Bershteyn, A., Irvine, D. J. Therapeutic cell engineering with surface-conjugated synthetic nanoparticles. Nature Medicine. 16, 1035-1041 (2010).
- Murdock, R. C., Braydich-Stolle, L., Schrand, A. M., Schlager, J. J., Hussain, S. M. Characterization of nanomaterial dispersion in solution prior to In vitro exposure using dynamic light scattering technique. Toxicological Sciences. 101, 239-253 (2008).
- Manolova, V., et al. Nanoparticles target distinct dendritic cell populations according to their size. European Journal of Immunology. 38, 1404-1413 (2008).
- Reddy, S. T., et al. Exploiting lymphatic transport and complement activation in nanoparticle vaccines. Nature Biotechnology. 25, 1159-1164 (2007).
- Kaur, R., Bramwell, V. W., Kirby, D. J., Perrie, Y. Manipulation of the surface pegylation in combination with reduced vesicle size of cationic liposomal adjuvants modifies their clearance kinetics from the injection site, and the rate and type of T cell response. Journal of Controlled Release. 164, 331-337 (2012).
- Zhuang, Y., et al. PEGylated cationic liposomes robustly augment vaccine-induced immune responses: Role of lymphatic trafficking and biodistribution. Journal of Controlled Release. 159, 135-142 (2012).
- Hogquist, K. A., et al. T cell receptor antagonist peptides induce positive selection. Cell. 76, 17-27 (1994).
- Clarke, S. R. M., et al. Characterization of the ovalbumin-specific TCR transgenic line OT-I: MHC elements for positive and negative selection. Immunology and Cell Biology. 78, 110-117 (2000).
- Azadniv, M., Dugger, K., Bowers, W. J., Weaver, C., Crispe, I. N. Imaging CD8(+) T cell dynamics in vivo using a transgenic luciferase reporter. International Immunology. 19, 1165-1173 (2007).
- Kim, D., Hung, C. F., Wu, T. C. Monitoring the trafficking of adoptively transferred antigen- specific CD8-positive T cells in vivo, using noninvasive luminescence imaging. Human gene therapy. 18, 575-588 (2007).
- Rabinovich, B. A., et al. Visualizing fewer than 10 mouse T cells with an enhanced firefly luciferase in immunocompetent mouse models of cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 14342-14346 (2008).
- Altman, J. D., et al. Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science. 274, 94-96 (1996).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual Restraint and Common Compound Administration Routes in Mice and Rats. Journal of Visualized Experiments. , e2771 (2012).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin Iii, J. Isolation and Th17 Differentiation of Naive CD4 T Lymphocytes. Journal of Visualized Experiments. , e50765 (2013).
- Chen, Y., et al. Visualization of the interstitial cells of cajal (ICC) network in mice. Journal of Visualized Experiments. , (2011).
- Scheffold, A., Busch, D. H., Kern, F. In Cellular Diagnostics Basics, Methods and Clinical Applications of Flow Cytometry. Karger. Sack, U., Tárnok, D. H., Rothe, G. , 476-502 (2009).
- Wilson, K., Yu, J., Lee, A., Wu, J. C. In vitro and in vivo Bioluminescence Reporter Gene Imaging of Human Embryonic Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e740 (2008).
- Golde, W. T., Gollobin, P., Rodriguez, L. L. A rapid, simple, and humane method for submandibular bleeding of mice using a lancet. Lab Animal. 34, 39-43 (2005).
- Tilney, N. L. Patterns of lymphatic drainage in the adult laboratory rat. Journal of Anatomy. 109, 369-383 (1971).
- Stivaktakis, N., et al. PLA and PLGA microspheres of beta-galactosidase: Effect of formulation factors on protein antigenicity and immunogenicity. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 70A, 139-148 (2004).
- Bilati, U., Allemann, E., Doelker, E. Nanoprecipitation versus emulsion-based techniques for the encapsulation of proteins into biodegradable nanoparticles and process-related stability issues. AAPS PharmSciTech. 6, E594-E604 (2005).
- Blander, J. M., Medzhitov, R. Toll-dependent selection of microbial antigens for presentation by dendritic cells. Nature. 440, 808-812 (2006).
- Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
- Dubochet, J., et al. Cryo-electron microscopy of vitrified specimens. Quarterly reviews of biophysics. 21, 129-228 (1988).
- Vinson, P. K., Talmon, Y., Walter, A. Vesicle-micelle transition of phosphatidylcholine and octyl glucoside elucidated by cryo-transmission electron microscopy. Biophysical Journal. 56, 669-681 (1989).
- Schagger, H. Tricine-SDS-PAGE. Nature Protocols. 1, 16-22 (2006).
- Chevallet, M., Luche, S., Rabilloud, T. Silver staining of proteins in polyacrylamide gels. Nat Protoc. 1, 1852-1858 (2006).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nature Reviews Immunology. 5, 617-628 (2005).
- Liu, H., et al. Structure-based programming of lymph-node targeting in molecular vaccines. Nature. 507, 519-522 (2014).
- Xu, Z., et al. Multifunctional nanoparticles co-delivering Trp2 peptide and CpG adjuvant induce potent cytotoxic T-lymphocyte response against melanoma and its lung metastasis. Journal of Controlled Release. 172, 259-265 (2013).
- Hailemichael, Y., et al. Persistent antigen at vaccination sites induces tumor-specific CD8(+) T cell sequestration, dysfunction and deletion. Nature Medicine. 19, 465 (2013).
- Slingluff, C. L., et al. Phase I trial of a melanoma vaccine with gp100(280-288) peptide and tetanus helper peptide in adjuvant: Immunologic and clinical outcomes. Clinical Cancer Research. 7, 3012-3024 (2001).
- Speiser, D. E., et al. Rapid and strong human CD8(+) T cell responses to vaccination with peptide, IFA, and CpG oligodeoxynucleotide 7909. Journal of Clinical Investigation. 115, 739-746 (2005).
- Araki, K., et al. mTOR regulates memory CD8 T-cell differentiation. Nature. 460, 108-112 (2009).
- Masopust, D., Vezys, V., Marzo, A. L., Lefrancois, L. Preferential localization of effector memory cells in nonlymphoid tissue. Science. 291, 2413-2417 (2001).
- Cuburu, N., et al. Intravaginal immunization with HPV vectors induces tissue-resident CD8+ T cell responses. Journal of Clinical Investigation. 122, 4606-4620 (2012).
- Ahlers, J. D., Belyakov, I. M. Memories that last forever: strategies for optimizing vaccine T-cell memory. Blood. 115, 1678-1689 (2010).
- Seder, R. A., Darrah, P. A., Roederer, M. T-cell quality in memory and protection: implications for vaccine design. Nature Reviews Immunology. 8, 247-258 (2008).
- Barber, D. L., et al. Restoring function in exhausted CD8 T cells during chronic viral infection. Nature. 439, 682-687 (2006).
- Wherry, E. J., et al. Molecular signature of CD8+ T cell exhaustion during chronic viral infection. Immunity. 27, 670-684 (2007).
- Czerkinsky, C. C., Nilsson, L. A., Nygren, H., Ouchterlony, O., Tarkowski, A. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. Journal of Immunological Methods. 65, 109-121 (1983).
- Foster, B., Prussin, C., Liu, F., Whitmire, J. K., Whitton, J. L. Detection of intracellular cytokines by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. Chapter 6 (Unit 6 24), (2007).
- Wonderlich, J., Shearer, G., Livingstone, A., Brooks, A. Induction and measurement of cytotoxic T lymphocyte activity. Current protocols in immunology. Chapter 3 (Unit 6 24), (2006).
- Betts, M. R., et al. Sensitive and viable identification of antigen-specific CD8+T cells by a flow cytometric assay for degranulation. Journal of Immunological Methods. 281, 65-78 (2003).
- Brunner, K. T., Mauel, J., Cerottini, J. C., Chapuis, B. Quantitative assay of the lytic action of immune lymphoid cells on 51-Cr-labelled allogeneic target cells in vitro; inhibition by isoantibody and by drugs. Immunology. 14, 181-196 (1968).
- Noto, A., Ngauv, P., Trautmann, L. Cell-based flow cytometry assay to measure cytotoxic activity. Journal of Visualized Experiments. , e51105 (2013).
- Quah, B. J., Wijesundara, D. K., Ranasinghe, C., Parish, C. R. The use of fluorescent target arrays for assessment of T cell responses in vivo. Journal of visualized experiments. , e51627 (2014).
- Crotty, S. Follicular helper CD4 T cells (TFH). Annual review of immunology. 29, 621-663 (2011).
