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Biology

Sistemas basados ​​en células HeLa Expresión Libre de Expresión de Published: June 10, 2015 doi: 10.3791/52772
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological, Geological, and Environmental Sciences, Cleveland State University

Summary

La expresión de proteínas de la malaria en sistemas basados ​​en células sigue siendo un reto. Demostramos dos sistemas de libre expresión de células de paso y un paso IVT (en la traducción in vitro) para expresar proteínas recombinantes rhoptry malaria a partir de células HeLa. Utilizamos un sistema de purificación basado en la afinidad de Ni-resina para purificar las proteínas rhoptry.

Abstract

La malaria causa de morbilidad y mortalidad global significativo. Ninguna vacuna rutinaria está disponible actualmente. Una de las principales razones de la falta de una vacuna es el reto de identificar candidatos vacunales adecuados. Proteínas palúdicas expresan utilizando sistemas de expresión procariotas y eucariotas basados ​​en células están mal glicosilados, generalmente insolubles y se someten plegado inadecuada conduce a una inmunogenicidad reducida. Los sistemas de expresión libres de germen de trigo, lisado de reticulocitos de conejo y Escherichia coli lisado de células se utilizan actualmente para la expresión de las proteínas de la malaria. Sin embargo, la longitud de tiempo expresión y glicosilación inadecuada de proteínas sigue siendo un desafío. Demostramos la expresión de proteínas de Plasmodium in vitro utilizando sistemas de libre expresión basados ​​en células HeLa, denominados "sistemas de expresión in vitro de células humanas libres". Los sistemas de la libre expresión basados ​​en células HeLa 2 transcriben mRNA en 75 min y 3 l de transcribed mRNA es suficiente para traducir proteínas en 90 min. El sistema de expresión 1-paso es una transcripción y traducción acoplada sistema de expresión; la transcripción y co-traducción se produce en 3 horas. El proceso también se puede extender durante 6 horas al proporcionar energía adicional. En el sistema de expresión de 2 a paso, el ARNm se transcribe primero y después se añadió a la mezcla de traducción de la expresión de la proteína. Describimos cómo expresar proteínas de la malaria; un hidrófobo Acantilado de PF3D7_0114100 Maurer - 2 proteína transmembrana (PFMC-2 ™), una proteína PF3D7_0925900 hidrófilo y un repeticiones armadillo que contienen proteínas PF3D7_1361800, utilizando el sistema de expresión libre de células HeLa basado. Las proteínas se expresan en micro volúmenes que emplean estrategias de expresión de 2 pasos y 1 pasos. Un método de purificación de afinidad para purificar 25 l de proteínas expresadas mediante el sistema de libre expresión in vitro de células humanas también se describe. Rendimiento de proteína se determina mediante el ensayo de Bradford y la expresóy proteínas purificadas se pueden confirmar por análisis de Western Blot. Proteínas recombinantes expresadas se pueden utilizar para inmunizaciones, inmunoensayos y secuenciación de proteínas.

Introduction

En la investigación de la malaria, la expresión de proteínas inmunogénicas utilizando sistemas basados ​​en células procariotas o eucariotas sigue siendo un reto. La riqueza AT del genoma de Plasmodium y los mecanismos de post traduccionales desconocidos 14,7, contribuyen a las dificultades asociadas a la obtención de proteínas correctamente plegadas y inmunogénicas para los estudios de producción de anticuerpos y vacunas. Sistemas procariotas tales como Escherichia coli se han utilizado para la expresión de proteína recombinante. Sistemas procariotas son de bajo costo, eficaces, producen altos rendimientos de proteína recombinante y tienen múltiples vectores de clonación. Anfitrión E. coli células son fáciles de transformar y células crecen rápidamente. Sin embargo, los sistemas procariotas tienen limitaciones tales como la falta de sustitución de aminoácidos, modificación post-traduccional, riesgo de contaminación, productos heterogéneos y acumulación de proteínas recombinantes dentro de cuerpos de inclusión 24.

En unestudio de Mehlin et al (2006)., 1000 marcos de lectura abierta (ORF) se expresaron. Aproximadamente el 7% de las proteínas expresadas eran soluble 14. La insolubilidad observado es debido a la naturaleza sesgada de los genes y la alta frecuencia de los codones que se utilizan idealmente por el Plasmodium rica en AT del genoma 14. Una estrategia alternativa para superar este problema se ha desarrollado mediante el uso de plásmidos o células huésped que contienen tRNAs que reconocen codones o codones que coincidan con las frecuencias 3 raras. Incluso después de realizar estas optimizaciones, porciones muy pequeñas de proteínas se expresan como soluble, activo e inmunogénica 14. Los sistemas de expresión sin células contienen todos los componentes necesarios para la transcripción y la traducción, tales como ribosomas, factores de iniciación, factores de elongación (traducciones factores), tRNA y aminoacil-tRNA sintetasas. Ambas reacciones de transcripción y traducción se acoplan en el procedimiento de un solo paso 11,29. El transcription reacción se realiza en un tubo antes de cantidad apropiada de mRNA se incuba con maquinaria de traducción en un 11,29 tubo diferente. Aunque estos métodos tienen éxito en Plasmodium sp. Expresión de proteínas, un inconveniente importante es la longitud de tiempo para la expresión de la proteína, que es aproximadamente 22 hr 29. Además, el alto costo de los suministros para su inclusión en los protocolos 29, los preparativos de trabajo intensivo del lisado celular e inconsistencias en los preparativos de los componentes, hacen de estos sistemas inalcanzable. El objetivo principal de los investigadores para el desarrollo de un sistema de expresión libre de células depende de factores tales como la modificación genética rápida, los rendimientos rápidos con altas concentraciones y preparaciones de lisado adelante rectas 1.

Sistemas eucariotas como las levaduras, las líneas celulares de mamíferos, baculovirus sistema de expresión mediada, Tetrahymena thermophilia, Dictyostelium discoideum y sistemas de expresión parasitarias Doch como Leishmania se han utilizado para la expresión de proteína recombinante 7. Sistemas eucariotas comparten relación filogenética y por lo tanto también comparten características como la glicosilación, acilación, la formación de enlaces disulfuro, la interacción chaperona, la proteolisis y la compartimentación subcelular. Eventos secreción de proteínas en eucariotas evitar la acumulación y disminuye la toxicidad para los sistemas de expresión 13. Se prefiere el uso de sistemas de levadura, ya que son adecuados para la expresión de proteínas en gran escala y para la obtención de altos rendimientos 4. Dos P. proteínas falciparum PFCP-29 y Pvs25 se produjeron utilizando el sistema de levadura 4. Sin embargo, un inconveniente importante en la síntesis de la mayoría de las proteínas era patrones irregulares de N y O-glicosilación, plegado y truncamiento de proteínas a partir de su forma nativa 4 inadecuada.

El uso de células de mamíferos para la síntesis de proteínas recombinantes es un trabajo intensivo y se Expensive para mantener las líneas celulares recombinantes estables 4. Por lo tanto, las células de mamíferos se han limitado para el análisis de señalización de la proteína, interacciones proteína y las interacciones parásito-huésped y también para el ensayo de vacunas de ADN 4. El ADN humano y vitro sistema libre de células mRNA en la expresión de proteínas se describe en el presente documento es un sistema de base de mamífero derivado de células HeLa que expresa las proteínas en 3 hr. Las proteínas expresadas utilizando vector de expresión pT7CFE1-Chis haber una etiqueta C-terminal de facilitar la identificación y purificación. El sistema basado en HeLa se complementa con factores de iniciación de la traducción y un regulador de la traducción, mejorando así la eficiencia del sistema de traducción. Las proteínas se pueden traducir rápidamente, examinados, verificados y procesados ​​para su uso en diversas aplicaciones inmunológicas y estructurales 15.

Los sistemas de expresión libres de células eucariotas tales como germen de trigo y de reticulocitos de conejo se utilizan actualmente para la expresión de varproteínas eucariotas pagarés incluyendo proteínas de Plasmodium 11,29. Además, E. sistemas libres de células basados ​​coli también se emplean para la expresión de la proteína eucariota 11. La Tabla 1 resume los diferentes sistemas de expresión libre de células mediante la comparación de características de los sistemas, así como la facilidad de uso de los sistemas para la expresión de proteínas. El sistema libre de células humana en comparación con los otros tiene la capacidad de realizar modificaciones post y co-traduccional y es menos costoso. La optimización de codones es posible y todas las reacciones se puede realizar en 3 hr. El sistema de HeLa es un sistema de traducción ideal para la síntesis de proteínas en el entorno de laboratorio.

Una ventaja importante de los sistemas de expresión libre de células humanas sobre otros sistemas libres de células es la disponibilidad de varias líneas celulares diferentes derivadas de diferentes órganos y tejidos. Varias variedades de sistemas libres de células pueden ser diseñados dependiendo de la línea celular. El extracto des derivados de células de mamíferos tienen una mayor eficiencia para sintetizar proteínas grandes que cualquier otro sistema de expresión libre de células. Estos sistemas de expresión de células libres también se pueden utilizar en aplicaciones de diagnóstico y caracterización de proteínas tales como micro matrices 30. Los populares líneas celulares HeLa son los más ampliamente utilizados para llevar a cabo la expresión de proteínas 33. El retículo endoplasmático en las líneas celulares HeLa es subdesarrollado, que conduce a la ausencia de actividad de modificación de la glicosilación post-traduccional 33. Sin embargo, se cree que este sistema a ser ventajoso para la síntesis de proteínas Plasmodium como Plasmodium también carece de modificación posterior a la traducción de glicosilación 29. El protocolo libre de transcripción-traducción de células HeLa es fácil de realizar, de bajo costo y las proteínas se puede expresar en 90 min, listo para la purificación y otras aplicaciones posteriores.

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Protocol

1. Preparación de parásitos Cultivos Celulares, Colección de Parásito Pellets

  1. Preparar medios RPMI-1640 con HEPES mediante la adición de 10 g de polvo de RPMI-1640, 66 mg de sulfato de gentamicina, 2 g de bicarbonato de sodio, 5,9 g de tampón HEPES, 50 mg hipoxantina y 3,8 g de dextrosa en 1 L dH estéril 2 O. Mezclar utilizando la tabla agitador magnético hasta que todos los que se disuelva el polvo en 1 L de agua destilada. Realizar micro filtración de medios utilizando 0,22 micras filtro. Almacene el papel en frascos estériles.
  2. Lávese las no infectadas (fresco) tipo A + eritrocitos utilizando RPMI. Preparar 5% de hematocrito de los eritrocitos (0,5 ml de eritrocitos frescos lavados en 9,5 ml 10% RPMI + suero humano).
  3. Haz 15% de suero humano + RPMI (15 ml de suero humano y 85 ml de RPMI) para iniciar el cultivo de parásitos. Hacer 10% de suero humano y RPMI (10 ml de suero humano y 90 ml de RPMI) para continuar el cultivo de parásitos en los glóbulos rojos.
  4. Cultura P. falciparum (3D7 y FCR-3 cepas) en el tipoA + eritrocitos humanos en 5% de hematocrito y 20% de parasitemia en placa de Petri o un frasco de cultivo de 75 cm 3. Mantener el cultivo in vitro de acuerdo con el método de Trager y Jensen vela tarro 26. Alternativamente, mantienen las culturas están en la incubadora a 37 ° C se mantiene 9,5% de CO 2 y el 3,4% de N 2 gas. Cultura P. falciparum en RPMI 1640 con HEPES medio suplementado con 10% de suero humano.
  5. Sincronizar P. cultura falciparum mediante la adición de 65% de Percoll (65 ml de Percoll + 35 ml de RPMI-1640 sin suero humano) al cultivo concentrado 27.
  6. Centrifugar el concentrado de cultivo con Percoll a 2.500 xg durante 5 min que se traduce en 3 capas. Con cuidado, usando una pipeta de transferencia aislar esquizontes de la transferencia de capa media en un tubo separado en condiciones asépticas 27.
  7. Lavar los cultivos aislados con 10% de suero humano + RPMI-1640 dos veces para eliminar el exceso de Percoll por centrifugación a 7500 xg durante 5 min. Discard el sobrenadante cada vez en condiciones asépticas 27.
  8. Continuar el cultivo de la P. sincronizado esquizontes falciparum en 10% de suero humano RPMI-1640 + 27.
  9. Recoger esquizontes mediante el tratamiento de los eritrocitos infectados por Plasmodium con 10 mM Tris pH 8,8 y centrifugación a 15.000 xg durante 15 min 23. Gránulos de parásitos tienda a -70 ° C después de la adición de 5 l de inhibidor de la proteasa (aprotinina) a los pellets. Utilice bolitas de parásitos para la extracción de proteínas, el aislamiento de ADN genómico y el aislamiento de ARN.

2. Preparación de plásmido vector

  1. Aislar el ADN genómico de P. pellets de esquizontes falciparum preparados a partir de cultivos de aproximadamente el 20% de parasitemia.
  2. Añadir 600 l de 10 mM Tris-HCl de pH 7,6, 50 mM EDTA pH 8,0, 0,1% SDS y 1 mg / ml de proteinasa K, a gránulos en un tubo de microcentrífuga, homogeneizar pellet utilizando una jeringa de 1 ml unida a una aguja 26 G. Alternate llenado de la jeringacon la mezcla de pellets y vaciado en un tubo de microcentrífuga de 20 veces. Incubar tubo que contiene homogeneizado O / N en un baño de agua a 50 ° C.
  3. Realizar fenol - cloroformo (P + C) la extracción mediante la adición de 600 l de P + C (300 l de fenol y 300 l de cloroformo) a pellet homogeneizada. Tubo de tapa y agite la mezcla vigorosamente por inversión de extremo a extremo de tubo. Tubo de centrífuga a 14.000 xg durante 2 min y recoger solución acuosa superior utilizando una micropipeta en un nuevo tubo de microcentrífuga. Repita este paso dos veces.
  4. Añadir 600 l de cloroformo a la capa acuosa en el nuevo tubo de la etapa 2.1.2. Vortex el tubo durante 10 segundos y se centrifuga a 14.000 xg durante 2 min. Medir la capa acuosa superior con una micropipeta y la transfiere a un nuevo tubo de microcentrífuga.
  5. Añadir 0,1 vol de 5 M de acetato de sodio pH 5,5 y 1 vol de isopropanol (si capa acuosa es de 300 l añaden 30 l de 5 M de acetato de sodio pH 5,5 + 330 l de isopropanol) para la puesta acuosaer desde el paso 2.1.3. Incubar el tubo a TA durante 15 min.
  6. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 10 min para precipitar sedimento de ADN. Descartar el sobrenadante y lavar pellet con 100 l de etanol al 70% (70 l de etanol y 30 l de dH 2 O) para eliminar el exceso de sal a partir del ADN. ADN tienda en 50 l de dH2O a -20 ° C.
  7. Diseño de cebadores directo e inverso usando software o manualmente para la amplificación de P. genes falciparum PF3D7_1361800, PF3D7_0925900, PF3D7_1436300 y PF3D7_0114100 previamente identificadas en los estudios de proteoma 16,18 con sitios de restricción apropiados que permitan la clonación de las secuencias de genes en los sitios de clonación múltiple del plásmido de expresión pT7CFE1-CHIS como se muestra en la Tabla 2.
  8. Hacer un 50 l mezcla de reacción mediante la adición; 5 l de aislados P. falciparum ADN genómico, 5 l de tampón 10x, 5μl de MgCl2, 1,5 l de cebador directo, 1,5 l decebador inverso, 0,5 l de ADN polimerasa T7 y 31,5 l de dH 2 O y realizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a 94 ° C durante 8 minutos para la desnaturalización, 50 ° C durante 1 min 30 seg para la extensión y 72 ° C durante 9 min para el recocido y renaturalización para amplificar genes mostrados en la Tabla 1.
  9. Productos de PCR separados sobre 1% gel de agarosa (1 g de agarosa y 100 ml de Tris EDTA acetato (TAE) buffer) 32.
  10. Cortar las bandas de ADN amplificados por PCR a partir del gel de agarosa, colocar las rodajas de gel que contienen ADN en una columna de centrifugación de extracción de gel de ADN y congelar a -20 ° C durante 5 min. Añadir 100 l de isopropanol a las rodajas de gel congelado y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min.
  11. Medir el flujo a través acuosa filtrada en el tubo de recogida de la etapa 2.5, utilizando una micropipeta y transferir a un tubo nuevo. Añadir 0,1 vol de 5 M de acetato de sodio y centrifugar a 14.000 xg durante 5 min. Descartar el sobrenadante y añadir 10 l de dH2O a thsedimento de ADN e.
  12. Digerir el vector de expresión pT7CFE1-CHIS y fragmentos de ADN purificado (de 2,6) en dos tubos separados mediante la adición de 3 l de plásmido y 5 l de PCR productos génicos a cada tubo. Añadir a cada tubo, 1 l de enzimas de restricción específicas, 2 l de tampón de reacción y 14 l de dH 2 O.
  13. Añadir 3 l de plásmido digerido, 5 l de fragmentos de ADN digeridos, 2 l de tampón de ligasa 10x, 1 l de ligasa y 9 l de dH 2 O en un tubo de microcentrífuga. Se incuba a 12 ° CO / N.
  14. Añadir 0,1 volúmenes de acetato de sodio 3 M a pH 5,5 y 2 volúmenes de etanol (si su volumen de tubos de ligadura es 20 l añadir 2 l de 3 M de acetato de sodio + 44 l de etanol) para el tubo desde el paso 2.14. Mezclar bien e incubar a -20 ° C durante 15 min.
  15. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 15 min. Retirar con cuidado el sobrenadante utilizando una pipeta micro sin perturbar el sedimento.
  16. Añadir 100 l de etanol al 70% to el sedimento de la etapa 2.10. Centrifugar el tubo a 14.000 xg durante 5 min. Retire y deseche el sobrenadante. Añadir 10 l de agua libre de nucleasa con el sedimento de ADN.

3. Proteína Expresión Uso en Vitro Cell Humano Sistema Libre Expresión

  1. Preparar 20 l de mezcla de transcripción mediante la medición de 2 l de la pT7CFE1-CHIS plásmido de ADN recombinante, 4 l de 5x tampón de transcripción, 4 l de mezcla NTP, 2 l de T7 RNA polimerasa y 8 l de agua libre de nucleasa para 2 pasos Humano en Vitro Protein Expression utilizando moldes de ADN. Mezclar los componentes en un tubo de microcentrífuga y se incuba durante 75 min a 30 ° C en un baño de agua.
  2. Tome 2 l de la mezcla de transcripción y añadirlo a 23 l de mezcla de traducción que contiene 12,5 l de lisado de células HeLa, 2,5 l de proteínas accesorias, 1 l de solución de sal A, 0,5 l de aminoácidos Met, 0,5 l de aminoácidos Leu, 181; l de inhibidor de RNasa, 1,25 l de mezcla de energía y 3,75 l de agua libre de nucleasa.
  3. Incubar la mezcla de traducción de la etapa 3.2 a 30 ° C durante 90 min. Tienda traducida productos a -20 ° C.
  4. Preparar 25 l de transcripción y traducción mezcla añadiendo 3 l de la pT7CFE1-Chis plásmido de ADN recombinante, 2 l de agua libre de nucleasa, 5 l de mezcla de reacción, 12,5 l de lisado de HeLa y 2,5 l de proteínas accesorias durante 1 a paso Junto Expresión IVT proteína humana para las plantillas de ADN.
  5. Incubar la mezcla de reacción de la etapa 3.4 para 90 min a 6 horas a 30 ° C. Guarde los productos de traducción a -20 ° C.

4. Purificación de proteínas recombinantes expresadas

  1. Añadir 75 l de tampón de purificación 1x a 25 l de producto de traducción para hacer 100 l de mezcla de purificación.
  2. Añadir 100 l de resina quelante de níquel de 100 l de mixto de purificaciónUre. Lavar Ni-resina dos veces añadiendo 300 l de dH 2 O y 300 l de tampón de unión. Vuelva a suspender la resina y se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min para eliminar el exceso de etanol.
  3. Añadir 100 l de mezcla de purificación de la etapa 4,2 a 100 l de resina quelante de níquel e incubar la mezcla durante 60 min a TA.
  4. Centrifugar la mezcla a 14.000 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo etiquetado como "flujo a través".
  5. Resina Lavar con 100 l de tampón de lavado 1x (imidazol 20 mM, NaH 2 PO 4 a pH 8, NaCl 2,5 M y dH 2 O 250). Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min y recoger el sobrenadante en un tubo nuevo etiquetado "lavado". Repita el paso 4.5 en dos ocasiones.
  6. Añadir 100 l de tampón de elución 1x (100 mM de imidazol, 250 mM Na 2 PO 4 a pH 8,0, 2,5 M NaCl y dH 2 O) a la resina y se incuba durante 15 min. Se centrifuga a 14.000 xg durante 1 min. Hacer el paso de elución dos veces. Cadatiempo de recoger el sobrenadante en tubos de microcentrífuga frescas y etiqueta como "eluato".
  7. Después de la elución, se lava la resina dos veces como se describe en el paso 4.5. Tienda fluya a través, lavados y muestras de elución a -20 ° C o inferior. Resina debe almacenarse a 4 ° C. Utilice 30 l de cada muestra para SDS-PAGE y análisis de inmunotransferencia.

5. Coomassie (Bradford) de ensayo de proteínas 34

  1. Preparar soluciones de albúmina de suero bovino (BSA) estándar con la concentración de 20 mg / ml (mezcla de 10 l de BSA (2 mg / ml) y 90 l de dH 2 O), 40 mg / ml (mezcla de 20 l de BSA (2 mg / ml) y 80 l de dH 2 O), 60 mg / ml (mezclar 30 l de BSA (2 mg / ml) y 70 l de dH 2 O), 80 mg / ml (mezcla de 40 l de BSA (2 mg / ml) y 60 l de dH 2 O), 100 g / ml (mezclar 50 l de BSA (2 mg / ml) y 50 l de dH 2 O), 160 g / ml (mezcla de 80 l de BSA (2 mg / ml) y 20 l de dH2 O) y 200 g / ml (100 l de BSA (2 mg / ml).
  2. Medida 5 l de flujo a través, lavados y muestras de eluato de la etapa 4.7. Añadir 95 l de dH 2 O.
  3. Añadir 5 ml de reactivo de azul de Coomassie a las mezclas de los pasos 5.1 y 5.2. Cubrir los tubos con parafilm y se vórtice durante 10 segundos y luego se incuba durante 20 min a TA.
  4. El uso de un espectrofotómetro, medir la densidad óptica (DO) a longitud de onda de 650 nm para los tubos de proteínas de paso 5.3. Concentración Parcela vs. lectura de DO para determinar las concentraciones de proteínas 34.

6. Western Blotting

  1. Añadir 5 l de extractos de esquizontes de P. falciparum, 2 l de Escherichia coli expresó rhOP-3 proteínas recombinantes 31, 5 l de proteínas recombinantes expresadas usando 2-paso 1 y paso en sistemas de expresión in vitro humanos y 10 l de productos de proteína purificada utilizando el método de afinidad para separar los tubos. Añadir tampón de muestra de electroforesis que contiene mercaptoetanol a cada tubo para un volumen final de 20 l para hacer muestras de proteínas solubilizadas. Hervir tubos durante 2 min.
  2. Cargar muestras de proteínas solubilizadas en 10% en geles de SDS-PAGE para separar las proteínas.
  3. Traslado proteínas separadas a partir de geles de SDS-PAGE a papel de nitrocelulosa (PNC) por electroforesis a 35 mA por gel en una cámara de Western Blot semi-seco durante 2 horas.
  4. Bloquear PNC después de la transferencia con 2% de leche sin grasa.
  5. Incubar bloqueado PCN con los siguientes anticuerpos policlonales diluidos 1: 100 en 2% de leche para realizar el Western Blot; anticuerpo de conejo # 676 21 específico para P. rhoptries merozoitos falciparum, anticuerpos de ratón 20 específicos para P. yoelii y P. rhoptries merozoitos berghei, antisueros # 685 específicos para el P. falciparum proteína vacuola parasitófora, SERA (rico antígeno serina) 22 y los anticuerpos específicos para el Maurer217; s de proteínas leporino PFMC-2 ™ 28.
  6. Incubar los PNC también en 1: 100 ratones y suero de conejo y de sobrenadante de cultivo gastado (SCS) a partir de células de mieloma SP2 como controles negativos normales diluidas.
  7. Incubar los PNC con anticuerpos y controles a 4 ºC O / N.
  8. Wash PCN 4x con tampón Blot e incubar PCN con especies anticuerpos secundarios específicos conjugados con peroxidasa de rábano (HRP) diluido 1: 1.000 en 2% de leche.
  9. Lavar PNC 4x con tampón Blot. Incubar lavó PCN con la solución de desarrollo de color A + B (Solución A: añadir 50 ml de 1x Blot tampón y 30 l de H 2 O 2; Solución B: añadir 10 ml de metanol y 30 mg de 3-cloro-naftol) para 30 min en la oscuridad. Analizar los resultados de Western blot colorimétricamente.

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Representative Results

Validación de las proteínas recombinantes expresadas a través de reactividad con anticuerpos específicos es un primer paso importante para confirmar el correcto plegamiento de las proteínas expresadas. Proteínas recombinantes malaria se expresaron mediante el paso y dos pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. Las proteínas recombinantes son método de afinidad Ni-quelante purificada. A continuación, utiliza antisueros contra rhoptries merozoitos enteros en el Western Blot de SDS-PAGE de proteínas recombinantes separadas.

La Figura 1 muestra fragmentos de genes amplificados por PCR de PY17X_1139200, PY17X_1402200, PY17X_1366000, PY17X_0830000 y PF3D7_1436300 en un gel de agarosa al 1%. Bandas de ADN se extrajeron y el ADN se purificaron por congelación en Spin de extracción de ADN de columna.

Malaria genes amplificados con éxito (que se muestran en la Tabla 2) a partir de ADN genómico fueron clonados en el vector de expresión pT7CFE-Chis. Re-amplificación de los genes de la recoplásmidos mbinant demostraron la presencia de los fragmentos de genes clonados en el vector. El diagrama de flujo de sistemas de expresión empleados para la traducción de proteínas se muestra en la Figura 2. Las Figuras 2A y 2B muestra un paso a paso el procedimiento de la etapa 2 en el sistema de expresión in vitro libre de células humana y la IVT acoplado sistema de traducción 1 a paso. Expresión exitosa de proteínas de Plasmodium que utilizan sistemas de libre expresión de células humanas in vitro fue confirmada por rhoptry antisueros de conejo específico. Como se ilustra en la Figura 3A, las proteínas recombinantes fueron reconocidas por rhoptry antisueros de conejo específico # 676. Proteínas recombinantes Como se indica anteriormente, expresadas no fueron reconocidos por antisueros contra proteínas vacuola parasitóforas de P. falciparum y P. yoelii que demuestra la especificidad de los antisueros de conejo 676 contra las proteínas expresadas 32. Suero de conejo normal (NRS) no reaccionó con proteínas recombinantestraducido usando 2-step sistema in vitro de células humanas libre expresión y IVT junto sistema de traducción de 1 paso (Figura 3B). La expresión con éxito de proteínas recombinantes de Plasmodium fue confirmada por diferentes técnicas tales como la tinción de histidina en gel y tinción de níquel-HRP 32. Las proteínas expresadas se purificaron por el sistema de purificación por afinidad. La purificación se realiza en el método LOTE (sin columnas utilizadas). La técnica está optimizado cambiando la concentración de imidazol de 60 mM a 100 mM. La concentración óptima para la elución es de 250 mM. La figura 4 muestra la purificación exitosa de proteínas traducidas de 25 l de los productos de proteína traducida. La Figura 4A muestra la purificación exitosa de proteína transmembrana hendidura de Maurer 18. Figura 4B muestra la purificación exitosa de PF3D7_0925900, P. falciparum ortholog de ​​Plasmodium yoelii PY17X_0830000 gen, unahipotética proteína 32. Figura 4C muestra la purificación exitosa de repeticiones armadillo que contienen proteínas PY17X_1139200, una proteína hipotética usando perlas de resina de Ni y imidazol 100 mM en tampón de elución 1x. El rendimiento de proteína después de la purificación es de 3,5 g / l 25.

Figura 1
Figura 1. La amplificación de P. falciparum y P. genes yoelii. Los productos de PCR 1% en gel de agarosa con bromuro de etidio manchadas muestra de fragmentos de genes de PFc14_0344, PF3D7_0925900, PF3D7_1361800, PY07482 y PFA0680cw amplificados a partir de P. ADN genómico falciparum.

Figura 2
Figura 2. Diagrama de flujo de bas HeLa sistema de expresión libre de células ed. Representación esquemática de ambos de 2 pasos y 1-paso en los sistemas de libre expresión in vitro de células humanas. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3
Figura 3. Inmunoblotting confirmación de la expresión de proteínas. Western blot de las proteínas recombinantes expresadas utilizando toda rhoptry conejo específico anti-sueros # 676 y suero de conejo normal. (A) Reactividad de antisueros 676 con proteínas recombinantes expresadas. (B) de suero de conejo normal no reaccionó con las proteínas recombinantes expresadas. Proteína vacuola parasitófora no reaccionó con proteínas recombinantes 32.hres.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4
Figura 4. Purificación de proteínas a partir de micro volúmenes de producto de la traducción. La purificación de las proteínas recombinantes expresadas utilizando Níquel quelantes método de afinidad de resina. Las proteínas expresadas (traducción) (A) PF3D7_0114100, (B) PY17X_0830000, y (C) las proteínas PY17X_1139200 se incubaron con Níquel - resinas quelantes se purifican con resina quelante de níquel en ausencia de imidazol en tampón de unión tampón y la purificación. Después de la incubación, las perlas se centrifugaron, las proteínas no unidas se separaron y las perlas se lavaron dos veces en tampón de lavado. Proteínas recombinantes unidas se eluyeron dos veces seguido por el lavado de las perlas. Traducidos proteínas, lavados, eluidos y cuentasse solubilizaron en tampón de muestra de electroforesis. Imidazol se utiliza en el lavado (20 mM de imidazol) y la elución (100 mM de imidazol) buffers. Los antisueros # 676 reconocido con éxito y expresó proteínas recombinantes purificadas. El suero normal de conejo no reaccionó con proteínas expresadas como muestran en la Figura 3B. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

<td> 200 KDa
Características Sistema de expresión de células Gratis Germen de trigo célula del sistema libre expresión Sistema de expresión de reticulocitos de conejo Sistema de expresión de proteínas de lisado de E. coli
Tiempo Hecho transcripción y traducción en 3 horas Transcripción durante 6 horas y la traducción de 10 a 20 h RNA tiene que ser aislado traducción toma 90 min Done en 1 hr
Vector adecuado T7 vector puede ser SP6 vectorial T7 se puede utilizar T7 se puede utilizar
Escala Adecuado Adecuado para la síntesis de laboratorio Se utiliza para la síntesis de proteínas a gran escala Adecuado para estudios de laboratorio y de vacunación Adecuado para estudios de laboratorio y de vacunación
Extracto Extractos libres de células HeLa Embrión de extractos de trigo Extractos de células de reticulocitos Extractos de E. coli lisado celular
Modificación Co-traslacional y modificación post translacional Publicar translacional Co-translacional modificación Modificación post-traduccional
Tamaño de la proteína traducida 8 kDa a 250 KDa 220 KDa 250 KDa
La optimización de codones Apretado Apretado Suelto Apretado
Formación de enlaces disulfuro Sí Sí No Sí
Rendimiento Bajo rendimiento Alto rendimiento Bajo Rendimiento Muy alto rendimiento
Costo $ 130,00 para 10 reacciones $ 173,00 para 10 reacciones $ 136,00 para 5 reacciones $ 159.00 para 8 reacciones
La concentración de proteínas 3 a 5 g por reacción 100 g / ml 100 g / ml 500 g / ml
Referencias 32, 30 7, 28, 29 7 7, 24, 25

Tabla 1. Teléfonos sistemas de libre expresión en la investigación de la malaria. Comparación de las célulassistemas libres de expresión utilizados actualmente en la investigación de la malaria.

Gene ID Ortholog ID Proteína Secuencia Primer para PCR
PF3D7_1436300 Componente translocon CTCGAGAATAATAACAATCATAATAATAAG
GAATTCATTATCATCAGGTTTAGCTAATTTTC
PF3D7_0114100 Proteína hendidura de PFMC-2TM Maurer GGATCCATGTTAGGTCAAAAAAACACAAATA
CTCGAGTGTTATTTGCTTTTTGTTTTGAAAA
PY17X_0830000 PF3D7_0925900 La proteína hipotética GGATCCATGAAATTTTTTAATATTCTCGCA
CTCGAGTCCTTGGACAACATATATACT60;
PY17X_1139200 PF3D7_1361800 La proteína hipotética GGATCCATGGGGTGCGACCCTGGGGTCAGCA
CTCGAGGCTCTTCAGATACTAAGCTACTAAT

Tabla 2. rhoptry genes en el estudio. Los cebadores de diferentes genes expresados ​​en este estudio 19.

Nombre de los Materiales Empresa Numero de catalogo Descripción
2-paso en células humanas in vitro sistema de libre expresión 32 Thermo Fisher 88856 Descatalogado. Siempre guarde a -80 ° C. No descongele en agua tibia.
1 paso in vitro acoplada sistema de traducción Thermo Fisher 88860 Siempre guarde a -80 ° C. No thaw en agua tibia.

Sistemas Tabla 3. basados ​​en células Hela libertad de expresión. Kits utilizados para la expresión de proteínas.

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Discussion

Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas usando dos etapas en el sistema libre de células humanas in vitro la expresión y purificación son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) la transcripción de ARN a 30 ° C; 3) la traducción de proteína a 30 ° C en presencia de inhibidor de RNasa; 4) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada usando perlas de resina recubiertas con Ni y 5) el análisis de resultados en western blot utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales. Los pasos importantes para la expresión con éxito de proteínas utilizando un paso IVT sistema de traducción acoplada proteína son: 1) la amplificación y clonación de genes en pT7CFE-CHIS plásmido vector éxito; 2) transcripción y traducción de proteínas a 30 ° C; 3) el desarrollo del protocolo de purificación de afinidad basada en el uso de perlas de resina recubiertas con Ni y 4) el análisis de resultados en western blot utilizando anticuerpos policlonales y monoclonales.

Corrientemente, los sistemas de expresión sin células se utilizan para expresar proteínas recombinantes malaria. Las características críticas de los sistemas de expresión de células libre para expresar proteínas de la malaria es la capacidad de decodificar AT genes ricos, la falta de larga pausa de traslación, la expresión con éxito de las secuencias de aminoácidos repetidos, la falta de mecanismos de glicosilación y la capacidad de los plásmidos para controlar el truncamiento de genes. En este estudio, se demuestra el uso de una de dos pasos en el sistema de expresión in vitro de células humanas libres 32 y unos sistemas de traducción IVT acoplado de un solo paso para la expresión de P. Falciparum ortólogos de genes de P. genes yoelii rhoptry merozoíto como se muestra en la Tabla 1. Un protocolo de purificación fue desarrollado y optimizado para la purificación de micro-volúmenes de proteínas recombinantes obtenidas de 1 a paso y de 2 pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. 4 P. genes falciparum, PF3D7_0114100 una proteína transmembrana hidrofóbica, una repetición ARM hipotética predichaproteína PF3D7_1361800 y una proteína hidrófila PF3D7_0925900, se expresaron mediante un 2 pasos y 1 paso en el sistema de la libre expresión de células humanas in vitro. Se determinaron los rendimientos de proteína purificada. La proteína PFMC-2TM se incluyó en estos estudios, ya que es una proteína de membrana con dos dominios transmembrana y estábamos interesados ​​en determinar si el sistema de expresión in vitro en podía expresar correctamente la proteína transmembrana y permitir la facilidad de purificación.

La diferencia clave tanto en los sistemas de expresión de una etapa y dos etapas es que el sistema de expresión de dos etapas es un sistema dependiente de mRNA, donde un ARNm estable se transcribe y se añade a la reacción de traducción. En contraste, el un paso en la transcripción in vitro acoplada / sistema de traducción implica una transcripción continua y suministro de mRNA seguido por el co-traducción de la proteína durante la reacción. Tanto 1-etapa de transcripción IVT / traducción acopladas esistema Xpression y 2-paso en el sistema de expresión libre de células humanas in vitro se ensayaron para la expresión de proteínas de alto peso molecular. Ambos sistemas tuvieron éxito en la expresión de proteínas recombinantes de bajo peso molecular. En el sistema de expresión 1-paso, se observó reactividad cruzada del anticuerpo con las proteínas en la mezcla de reacción de traducción. Las proteínas específicas de reacción cruzada con los anticuerpos son desconocidas y necesitan una mayor investigación. La expresión de proteínas de alto peso molecular no tuvo éxito utilizando tanto los sistemas de 2 pasos 1 a paso y. Un protocolo de purificación fue desarrollado para microvolúmenes purificación de proteínas recombinantes de diferentes propiedades de solubilidad expresada utilizando tanto 1-paso, y de 2 pasos en sistemas de expresión libre de células humanas in vitro. Las proteínas fueron éxito purificada y el rendimiento obtenido fue de 3,5 g por 25 l cuando se expresa mediante 2 pasos en el sistema de traducción de proteínas in vitro y 1,5 g por 25 l cuando se traduce con el 1-paso queSistema de expresión de la proteína VT. La expresión de proteínas de bajo peso molecular que varían de 18 kDa a 37 kDa es reproducible y sencillo. Sin embargo, la expresión de alto peso molecular resulta en truncamientos de proteínas. Debido a las microvolúmenes obtenidos para el ADN clonado, se usó la amplificación por PCR para verificar productos clonados. Obstáculos potenciales para la expresión de proteínas de alto peso molecular utilizando sistemas de expresión libres de células podría ser la fosforilación constante de eIF2 subunidad alfa debido a la alta concentración de ATP en la reacción. Esto perjudica la iniciación de la traducción en el sistema que afecta potencialmente a la elongación de la síntesis de proteínas durante la síntesis de proteínas grandes en los sistemas de expresión de células libre 10.

El protocolo descrito aquí está influenciada por las condiciones de optimización para la expresión de proteínas. Ni los codones de genes ni el plásmido fueron optimizados para la expresión de las proteínas, y replegamiento de proteínas no se requería. Este sistema expresa proteins en 3 horas y la purificación de la proteína se pueden obtener en 2 horas, lo que permite nuevas aplicaciones posteriores tales como el procesamiento de la proteína recombinante para inmunizaciones o secuenciación de péptidos. Múltiples proteínas recombinantes pueden ser expresadas con el sistema libre de células HeLa, utilizando formatos de microarrays para el cribado de sueros inmunes e identificación de potenciales moléculas candidatas vacuna. Además, las proteínas potencialmente inmunogénicas se pueden identificar a través de pantallas y de las proteínas obtenidas por la ampliación de la expresión seleccionada.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-step in vitro human cell free expression system Thermo Fisher 88856 Discontinued. Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
1-step in vitro coupled translation system Thermo fischer 88860 Always store at -80 °C. Do not thaw in warm water
ProBond Purification system Invitrogen K850-01 Store at RT
Probond Nickel-Chelating Resin Invitrogen R801-01 Store at 4oC.
A+ Human Blood Interstate Blood Bank Store at 4 °C.

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Yadavalli, R., Sam-Yellowe, T. HeLa Based Cell Free Expression Systems for Expression of Plasmodium Rhoptry Proteins. J. Vis. Exp. (100), e52772, doi:10.3791/52772 (2015).

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