Protocol
Institutional Review Board vid University of Georgia godkände mänskliga subjektet studie för att samla perifert blod från friska frivilliga (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 Frivilliga undertecknade krävs informerat medgivande innan blodprovstagning. Forskningen utförs i denna artikel är i enlighet med de etiska riktlinjerna för medicinsk forskning på människor av Helsingforsdeklarationen.
1. Isolering av neutrofiler från perifert Människoblod (Figur 1)
Obs: Det finns flera sätt att isolera neutrofiler från perifert blod. Följande protokoll ger en möjlighet. Detta protokoll ger ett stort antal icke-aktiverade humana neutrofiler förmåga att frisätta NET på yttre stimulering. Använd 40 ml helblod som erhållits från friska frivilliga genom venpunktion. 7,9
- Alikvot 20 ml blod i två 50 ml koniska rör. Tillsätt 10 ml 6% Dextran. Blanda försiktigt.
- Efter 20 minuter överföringen leukocyt-rich övre fasen utan att ta några pelleterade röda blodkroppar i ren 50 ml koniska rör och fyll upp med steril PBS.
- Centrifugera vid 400 x g 10 min. Återsuspendera pelleten i 4 ml steril PBS.
- Förbered en 5-stegs Percoll gradient av 85% -80% -75% -70% -65% i två 15 ml koniska rör och lager 2 ml leukocytsuspension ovanpå varje lutning.
- Centrifug 800 xg under 30 min med obromsad.
- Samla alla celler (neutrofiler) i skikten vid 75% / 80% och 70% / 75% gränssnitt.
- Tvätta cellerna två gånger i PBS (350 xg, 10 min, RT) och räkna cellerna med en hemocytometer.
2. Mätning av kinetik av extracellulärt DNA Release användning av en mikro fluorimeter
Obs: Denna metod möjliggör mätning av förändringar i fluorescens av ett membran ogenomtränglig DNA-bindande färgämne som indikerar DNA tagning på 96 brunnar mikroformat (Figur 2).
- Bered en suspension av neutrofiler i analysmedium (HBSS +1% (volym / volym) autologt serum + 5 mM glukos) vid en koncentration av 2 x 10 6 celler / ml.
- Tillsätt 5 mol / L av membranet ogenomtränglig DNA-bindande färgämne. Blanda försiktigt.
- Alikvot humana neutrofiler (50 ^ il / brunn) på 96-brunnars svart, transparent botten mikroplattor. Se till analysmediet täcker hela botten av brunnen. Om inte trycker plattan försiktigt på sidan.
- Värma upp de platt innehållande neutrofiler för 10 min vid 37 ° C.
- Under tiden bereda lösningar av stimuli vid dubbla av deras slutkoncentrationer som skall användas (i 37 ° C varmt analysmedium). Som en positiv netto kontroll använda humana neutrofiler med 100 nM forbol-myristat-acetat (PMA) för 4 timmar för att utlösa maximal NET release. 5,8 PMA-stimulering under 4 h säkerställer maximal NET frisättning medan spontan NET bildningen fortfarande låg 5,8.
- Förbered mikro fluorimeter för mätning (4 tim, 37 ° C, 530 nm för excitation och 590 nm för emission). </ Li>
- Stimulera neutrofiler genom att tillsätta 50 pl stimulans lösning till 50 pl neutrofila suspensioner. Använd 0,5 mikrogram / ml saponin i en brunn för att mäta maximal DNA frigör signal.
- Placera plattan i läsaren och mäta förändringar i fluorescens under 4 h vid varje 2 min utan skakning.
- För dataanalys, beräkna normaliserade ökningar i fluorescens över tiden.
- Subtrahera baslinjen fluorescens från endpoint värden för alla brunnar inklusive saponin (figur 2A, B). Rise i saponin fluorescens bör vara den högsta signalen. Det kallas "maximal DNA release" (Figur 2A).
- Procenträkning av DNA release i okända prov genom att dividera ökningar i fluorescens av okända prover av maximal DNA release.
- Genomsnittliga resultaten av replikat och presentera dem som "% av maximal DNA release" (figur 2C).
3. Kvantifiering av NET Formation av MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser
Obs: Dessa analyser modifierad (MPO-DNA) eller etablerade (HNE-DNA) i vårt laboratorium kvantifiera NET bildning genom att mäta nivåerna av MPO-DNA och HNE-DNA-komplex 5.
- Coat 96 brunnar med hög bindningskapacitet ELISA-plattor över natten med infångningsantikroppar (50 | j, l / brunn): anti-MPO (1: 2000 utspädning) eller anti-HNE (1: 2000).
- Wash ELISA-plattorna tre gånger med PBS (200 pl / brunn) och blockera dem med 5% BSA och 0,1% humant serumalbumin i 2 h vid RT (200 | j, l / brunn). Tvätta tre gånger med PBS.
- Utsädes neutrofiler på 96-brunnars mikroplattor vid en densitet av 100.000 celler / brunn i 100 | il analysmedium och stimulera NET bildning. Inkubera cellerna: 4 h under 37 ° C.
- Utför en begränsad DNas matsmältningen genom att tillsätta 2 U / ml DNas till neutrofila supernatanter, blanda dem väl. Håll dem vid RT.
- Stoppa DNas efter 15 minuter genom att tillsätta 11 pl 25 mM EGTA (slutlig koncentration 2,5 mM). Blanda väl. samla supernatants i rena mikrocentrifugrör. Spin prover för att bli av med cellrester vid 300 xg under 5 min vid RT. Överföra sina supernatanter till rena mikrocentrifugrör. Hålla dem på is tills redo.
- Använda en alikvot av en tidigare framställd "NET standard".
Obs! NET-standarden är en blandning av DNas omsatta supernatanter av PMA-stimulerade neutrofiler erhållna från åtminstone 5 olika, oberoende mänskliga donatorer.- Att använda samma standard under en lång tid, samla in och delprov en stor volym av neutrofila supernatanterna från varje enskild donator. Samla t ex 2 ml DNas-diger supernatanter av PMA-stimulerade neutrofiler kommer att resultera i 200 alikvoter (10 ul vardera) tillräckligt för 200 ELISA-plattor. Data som kännetecknar NET standarden återfinns i figur 5.
- Stimulera humana neutrofiler med 100 nM PMA under 4 timmar och tillämpa DNas smälta till deras supernatanter enligt steg 3,4-3,5.
- Samla, pool, prov (10 pl) och gratisze (-20 ° C) neutrofila supernatanter.
- För att förbereda "NET-standard", tina en alikvot / givare som erhålls från åtminstone fem olika givare, blanda dem och hålla dem på is.
- Kasta tinade prover och använder färska dem för nästa experiment.
- Förbered en 1: 2 serieutspädning av NET-standard i PBS + EGTA.
- Späd DNase1-spjälkade proverna (standard och okända supernatanter) 20-faldigt i PBS + EGTA och delprov dem på ELISA-plattor belagda med infångningsantikroppar.
- Inkubera ELISA-plattor över natten vid 4 ° C och tvätta dem tre gånger med PBS.
- Applicera detektionsantikropp lösning (100 ul / brunn): pepparrotsperoxidas konjugerad anti-DNA-antikropp (1: 500, mus). Inkubera under 1 timme i mörker.
- Efter fyra tvättar med PBS till TMB-peroxidassubstrat: 100 l / brunn, 30 min. Blåfärgning är en indikation för peroxidasaktiviteten (NET närvarande).
- Stoppa reaktionen genom tillsats av 100 | al / brunn 1 M HCl. Deblå lösningar blir gul (Figur 5A).
- Läs absorbans vid 450 nm med användning av en mikroplattfotometer.
- För dataanalys, beräkna MPO-DNA eller HNE-DNA-komplex jämfört med NET standard.
- Subtrahera bakgrunden optiska densitetsvärdet av analysmediet från alla prover.
- Rita absorbansvärdena (X-axeln) av den utspädda standardprover mot deras relativa nettovikt (Y-axeln) (Figur 5A).
- Använda nonsaturated vidden av denna standardkurva etablera en trendlinje (använd bäst exponentiell anpassning från den programvara som används) (Figur 5A). Ekvationen för denna trendlinje bestämmer omvandlingen av OD-värdena kvantitativa mängder av NET.
- Sätt de uppmätta OD-värden för de okända i trendlinjen ekvation från 3.13.3 som ger mängden nät i det okända provet som procent av netto-standarden (figur 5A).
- Beräknamedelvärden replikat (tripletter) och presentera de slutliga uppgifter som "mängden MPO-DNA eller HNE-DNA-komplex (% av standard)" (figur 5C).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Siffrorna i detta manuskript att beskriva förfarandet för neutrofil isolering, experimentella procedurer, och presentera representativa resultat med förklaring av dataanalys. Figur 1 visar de sekventiella stegen av humant neutrofilt beredning. Detta protokoll representerar endast ett möjligt sätt att neutrofil isolering. Den ger stora mängder av vilande neutrofiler förmåga att frisätta NET vid stimulering. Figur 2 visar hur fluorescensbaserad DNA-frisättningsanalys fungerar. Med hjälp av en fluorescensmikroplattläsare kinetiken för DNA-frisättning i humana neutrofiler följs i 96 brunnar mikroplattor. Figur 3 förklarar varje steg i dataanalysen. Först beräkna maximal DNA signal i neutrofiler behandlade med saponin (figur 3A). Ökningen i fluorescens alltid beräknas som skillnaden mellan högsta fluorescensvärdet och bakgrundsfluorescens nivå (
Figur 4A skildrar systemet att förklara principerna för MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser. Figur 4B visar representativa immunofluorescens bilder av icke stimulerade, PMA- och PAO1-aktiverade humana neutrofiler. Extracellulär DNA visar typisk NET morfologi och co-lokaliserar med MPO och citrullinerad histon H4, en markör för NET bildningen. 6 Figur 4C visar MPO-DNA och HNE-DNA frisättning i humana neutrofiler under samma, tidigare förhållanden (som figur 3B, 3C och 4B). IThe "NET" ELISA-metoder har tidigare karakteriserats. 5 I korthet 2 U / ml DNas-behandling (motsvarande 1 | ig / ml koncentration av DNas som används) under 15 min vid RT gav de högsta MPO-DNA- och HNE-DNA-signaler . 5 springa prover (100 ng / spår) på en agarosgel visade att DNA-längdi de lägre kb intervall ger optimal ELISA 5 DNA digerering signal. (DNas högre dos än 20 U / ml) eller utelämna antingen infångning eller detektionsantikropp avskaffade ELISA-signaler. 5
Dessutom, här analyserna och "NETWORK standard" kännetecknas vidare (figur 5A). NET-standarden innehåller i genomsnitt 19,5 mikrogram / ml extracellulärt DNA (mätt med hjälp av en standard med kända DNA-koncentrationer), 399 ng / ml MPO och 103,4 ng / ml HNE (kommersiella ELISAkits) (n = 8). Baserat på den totala molekylvikter av MPO (84 kDa) och HNE (29,5 kDa) och det faktum att en mikrogram DNA innehåller 9,91 x 10 14 nukleotider, innehåller NET-standarden 109 HNE molekyler och 147 MPO-molekyler per 1000 nukleotider (kb DNA ). Tvåfaldiga seriespäd experiment NET-standard visade att de dynamiska områdena för både MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser är mellan 19,0-609,0 ng /ml DNA-koncentrationer (figur 5B). Spädningar av lägre än 32-faldigt av NET standard resulterade i mättnad medan spädningar av högre än 1024-faldigt skiljde sig inte från bakgrunden (Figur 5B). Behandling av NET standard med proteashämmare inte ändra sina resultat som erhållits genom MPO-DNA och HNE-DNA-analyser tyder på att proteaser inte stör dessa analyser (Figur 5C). Sålunda erhållna resultat i samma NET-standardprov av MPO-DNA eller HNE-DNA ELISA-analyser starkt korrelerar med varandra (figur 5D). För att visa att frysta PMN supernatanter också kan användas i dessa analyser utan att förlora effektivitet, några portioner av NET-standarden lämnades obehandlade eller andra utsattes för en eller två frys / upptiningscykler som utförs vid -20 ° C eller -80 ° C (1 h intervall). Ingen av de frysnings / upptiningsbehandlingar påverkat MPO-DNA eller HNE-DNA-resultat (Figur 5E). I sammanfattning, denNET-standarden ger en tillförlitlig referenspunkt i dessa NET-kvantifiering analyser som möjliggör kvantitativ jämförelse av nettoresultat mellan oberoende försök.
Figur 1:. Isolering av humana neutrofiler Neutrofila granulocyter isolerades från perifert blod från frivilliga i enlighet med den beskrivna protokollet. Blod som innehåller antikoagulant användes för att isolera neutrofiler av dextran sedimentering och gradientcentrifugering. Blod utan antikoagulans användes för att bereda serum. Livskraft neutrofila beredningar bedöms genom exklusion med trypanblått. Neutrofil renhet bedöms av cytospin eller flödescytometri (CD16, CD66abcd dubbel positiva celler). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Principer för den extracellulära DNA Release analys (A) Fluorescens erhålles endast i neutrofiler vars plasma och nukleära membran har äventyrats och membranet täta DNA-bindande färgämnet kan binda till deras DNA. (B) Analysen utförs på svart 96-håls mikroplattor med användning av en mikroplatt fluorimeter. (C) Den fluorimeter registrerar realtid fluorescens kurvor i varje brunn. Ett representativt resultat i visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Analys av DNA-Release Data (.
Figur 4: MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser. Princip och Representativa resultat (A) Scheme förklaraing hur MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser arbete. (B) Representativa resultat av immunfluorescensbilder som framställts på humana neutrofiler exponerade för 100 nM PMA eller P. aeruginosa PAO1 stam (10 MOI) i 4 timmar. Extracellulär DNA (DAPI, blå) co-lokaliseras i NET med MPO (grön) och citrullinerad histon H4 (röd). Ett representativt resultat, n = 3. (C) NET frisättning mättes i humana neutrofiler som utsätts för samma stimuli som ovan med MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser. Medelvärde ± SEM, n = 3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Karakterisering av "NET-standard" (A) Serieutspädningar. (1: 2) av NET standarden framställdesoch utsattes för MPO-DNA ELISA. Uppmätta OD-värden plottas mot% av NET-standard innehåll. Rött "X" indikerar en uppmätt OD-värdet för ett okänt prov. Grå pilen indikerar hur den "NET koncentration" (blå "X") för det okända provet skall bestämmas med användning av den centrala område av den monterade standardkurvan. (B) DNA-koncentrationer i serieutspädda NET-standard proven bestämdes och plottades mot de uppmätta OD-värden av MPO-DNA eller HNE-DNA ELISA-analyser. Grå områden visar de dynamiska områdena för analyserna. (C) behandlings proteashämmare (proteashämmare cocktail, 1%) påverkar inte resultatet av MPO-DNA eller HNE-DNA-analyser (NET-standard). Medelvärde ± SEM, n = 2. (D) Korrelation av MPO-DNA och HNE-DNA-resultat (OD 450 nm) av serieutspädda "NET-standard" prover i deras dynamiska intervall (se 5B). (E) frysning och upptining-cykler (-20 ° C eller -80 ° C; one eller två) påverkar inte resultatet av MPO-DNA och HNE-DNA-analyser (NET-standard, medelvärde ± SEM, n = 2). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET representerar en fascinerande ny mekanism genom vilken neutrofiler döda patogener. 1 Även om litteraturen NET har kontinuerligt byggts ut under de senaste tio åren sedan deras upptäckt flera viktiga frågor som rör deras roll i biologi, mekanism och reglering förblir oklart. Lämplig metod måste utvecklas för att mäta NET, detta mycket unika antimikrobiella mekanism. I denna artikel beskrivs metoder som kan användas för att kvantifiera NET i en hög genomströmning sätt. Den första analysen följer kinetiken för fluorescens av ett membran ogenomtränglig DNA-bindande färgämne. Denna analys ger stora mängder information på sluttningen och hastigheten för DNA-frisättning från neutrofiler. Denna information är avgörande i undersökningar som studerar tidig signalering händelser som leder till NET bildningen. All denna information går förlorad i endpoint analyser som mäter DNA släppas i slutet av inkubationen. Den extracellulära DNA färgämnesbaserad analys är inte specifikt för NET. Detendast mäter DNA release. För att bekräfta NET, är det allmänt accepterat att utföra immunofluorescens på NET bildande neutrofiler och visar samlokalisering av DNA med antingen granulat markörer (MPO, HNE) eller histoner. Kvantifiering av immunofluorescens uppgifter är dock mycket tråkiga och subjektivt.
Här är en modifikation av en tidigare utvecklat ELISA-analys upptäcka MPO-DNA-komplex presenteras. En liknande ELISA-analys för att mäta HNE-DNA-komplex som representerar särskilda NET åtgärder beskrivs också. 3,5 Båda analyserna har präglats i detalj. 5 MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser är kvantitativa och NET specifika samtidigt . 5 Dessa funktioner inte uppfylls av någon annan nuvarande metoden. Analyserna är lätta att utföra och ger reproducerbara data. 5 Ett begränsat DNas matsmältningen steg ingår som säkerställer snabb och standardiserad hantering av NET direkt på neutrofiler. 5 Dessa analyser är lämpliga för compare flera prover samtidigt. I nya kontrollmätningar det visas att frysa / tö cykler och proteaser påverkar inte resultatet av MPO-DNA och HNE-DNA-analyser. Det är okänt, dock om proteiner som är kända för att binda till DNA i NET (inklusive histoner och LL-37) 1,11 skulle störa dessa analyser.
Kritiska steg i de presenterade protokollen är följande. Det är viktigt att skörda neutrofiler som befinner sig i en vilande, vilotillstånd och inte släppa stor mängd NET spontant. Brist på en hypoton lys steg för att avlägsna röda blodkroppar i den presenterade neutrofila isolering protokollet är avgörande för att få icke-aktiverade neutrofiler. För att inhibera neutrofil aktivering efter att cellerna hade renats, är det också viktigt att resuspendera neutrofiler i ett medium innehållande sin donator eget serum. För att få vilande celler är det också viktigt att använda pyrogen- och föroreningsfria reagens under neutrofila beredning. Spontarogen NET frisättning av neutrofiler under extracellulära analys DNA frisättning kan också hända. Tillsats av 1% autologt serum till testmediet är viktigt att förhindra det. Högre eller lägre doser av autologt serum kunde testas för att få optimala resultat. Det är viktigt under MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser som släpps DNA bör inte vara över ned av DNas eftersom det kommer att resultera i fullständig förlust av signalen. Därför bör den optimala dosen bestämmas för varje ny DNas sats. Parametrarna för DNA-digestion kunde ändras något för att erhålla den högsta ELISA-signaler möjlig. Det är också viktigt att blanda DNas och NET noggrant för att säkerställa att den DNas kommer att ha en tydlig tillgång till DNA. Vid skörd av smälta NET, tvätta väl stor utsträckning för att samla alla NET.
DNA-detektionsgräns MPO-DNA och HNE-DNA-analyser är ca 10-20 ng / ml DNA (figur 5B). Serum och plasma fri DNA-nivåer av several hundra till tusen ng / ml rapporterades i sjukdomar (cancer, systemisk lupus erythematosus, myocardial infektion) som har förknippats med onormal NET bildningen. 12-14 Detta tyder på att MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser har också potential för att kunna kvantifiera NET inom humana kliniska prover. Denna framtida tillämpning av MPO-DNA och HNE-DNA ELISA-analyser gör det möjligt att kvantitativt länka NET sjukdom patogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
