Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/52779
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia
* These authors contributed equally

Protocol

הדירקטוריון סקירה מוסדיים מאוניברסיטת ג'ורג'יה אישרה את המחקר הסובייקט האנושי לאסוף דם היקפיים ממתנדבים בריאים (UGA # 2012-10769-06). 5,7,8 מתנדבים חתם על טופס הסכמה מדעת נדרש לפני לקיחת הדם. המחקר מבוצע במאמר זה תואם עם הקווים המנחים האתיים מחקר רפואי, כולל בבני אדם של הצהרת הלסינקי.

1. ניתוק של נויטרופילים מן היקפיים ודם (איור 1)

הערה: ישנן מספר דרכים כדי לבודד נויטרופילים מדם היקפי. הפרוטוקול הבא מספק אפשרות אחת. פרוטוקול זה מניב כמויות גדולות של נויטרופילים אדם שאינו מופעל מסוגל לשחרר נטס על גירוי חיצוני. השתמש 40 מ"ל דם מלא המתקבל מתנדבים בריאים ידי venipuncture. 7,9

  1. Aliquot דם 20 מ"ל לשני צינורות חרוטי 50 מ"ל. הוסף 10 מ"ל 6% Dextran. מערבבים בעדינות.
  2. לאחר 20 דקות העברה לויקוציטים-ריקיםהשלב העליון h בלי לקחת שום כדוריות דם אדומות pelleted לתוך צינורות חרוטי 50 מ"ל נקי, למלא אותו עם PBS סטרילית.
  3. צנטריפוגה ב 400 XG 10 דקות. Resuspend גלולה ב 4 מ"ל סטרילי PBS.
  4. הכן שיפוע Percoll 5 שלבים של 85% -80% -75% -70% -65% בשני צינורות חרוטי 15 מ"ל ההשעיה לויקוציטים מ"ל שכבת 2 על גבי אחד שיפוע.
  5. צנטריפוגה 800 XG במשך 30 דקות עם בלמים כבויים.
  6. לאסוף את כל התאים (נויטרופילים) בשכבות על% 75% / 80 ו -70% / 75% ממשק.
  7. פעמיים שטפו תאים PBS (350 XG, 10 דקות, RT) ולספור תאים באמצעות hemocytometer.

מדידה 2. קינטיקה של תאי DNA שחרור שימוש microplate fluorimeter

הערה: שיטה זו מאפשרת מדידה של שינויים הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר מעיד על שחרור DNA על פורמט microplate 96-היטב (איור 2).

  1. כן השעיה של נויטרופילים במדיום assay (HBSS +1% (v / v) עצמיים סרום + 5 גלוקוז מ"מ) בריכוז של 2 x 10 6 תאים / מ"ל.
  2. הוסף 5 μmol / L של צבע DNA מחייבת קרום חדיר. מערבבים בעדינות.
  3. נויטרופילים האדם Aliquot (50 μl / טוב) על 96-היטב בתחתית שחור, שקוף microplates. ודא מדיום assay מכסה את כל תחתית הבאר. אם לא, הקש על צלחת בעדינות בצד.
  4. לחמם את נויטרופילים המכיל צלחת במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. בינתיים להכין תמיסות של גירויים במחיר כפול של הריכוזי הסופי שלהם כדי לשמש (37 ° בינוני assay החם C). כביקורת חיובית נטו להשתמש נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר phorbol-myristate-אצטט (PMA) עבור 4 שעות כדי לעורר שחרור NET מקסימלי. 5,8 גירוי PMA עבור 4 שעות מבטיחה שחרור NET מקסימאלי, תוך היווצרות NET ספונטנית נשאר 5,8 נמוכה.
  6. הכן את microplate fluorimeter לשקילה (4 שעות, 37 ° C, 530 ננומטר עירור 590 ננומטר עבור פליטה). </ Li>
  7. לעורר נויטרופילים ידי הוספת פתרון הגירוי 50 μl 50 השעיות נויטרופילים μl. השתמש 0.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​saponin אחד טוב כדי למדוד אות שחרור DNA מקסימלי.
  8. מניחים צלחת בקורא ולמדוד שינויים הקרינה עבור 4 שעות ב כל 2 דקות עם לא רועד.
  9. לניתוח נתונים, לחשב עליות מנורמלות קרינה לאורך זמן.
    1. קרינת בסיס פחת מן ערכי נקודות קצה עבור כל הבארות כולל saponin (איור 2 א ', ב'). עליית קרינת saponin צריכה להיות האות הגבוהה ביותר. זה נקרא "שחרור DNA המקסימאלי" (איור 2 א).
    2. חישוב אחוזי שחרור DNA בדגימות ידועות על ידי חלוקת עליות קרינה של דגימות ידועות על ידי שחרור DNA מקסימאלי.
    3. ממוצע תוצאות של משכפל ולהציגם כמו "% של שחרור DNA המקסימאלי" (איור 2 ג).

3. כימות של בנטוation ידי MPO-דנ"א-DNA HNE מבחני ELISA

הערה: אלה מבחנים שונים (דנ"א MPO) או הקים (HNE-DNA) במעבדה שלנו לכמת היווצרות NET ידי מדידת רמות של מתחמי MPO-דנ"א HNE-DNA 5.

  1. מעיל 96-היטב גבוהה יכולת קשירה צלחות ELISA לילה עם נוגדנים לכידת (50 μl / טוב): אנטי-MPO (דילול 1: 2,000) או אנטי-HNE (1: 2,000).
  2. צלחות לשטוף ELISA שלוש פעמים עם PBS (200 μl / טוב) ולחסום אותם עם BSA 5% ו -0.1% אלבומין בסרום אדם עבור שעה 2 ב RT (200 μl / טוב). לשטוף שלוש פעמים עם PBS.
  3. נויטרופילים זרע על 96 גם microplates בצפיפות של 100,000 תאים / היטב במדיום assay 100 μl, וממריץ היווצרות NET. דגירת תאים: 4 שעות עבור 37 ° C.
  4. בצע עיכול DNase מוגבל על ידי הוספת 2 U / DNase מיליליטר supernatants נויטרופילים, לערבב אותם היטב. שמור אותם ב RT.
  5. עצור את DNase לאחר 15 דקות על ידי הוספת 11 μl 25 מ"מ EGTA (הריכוז הסופי 2.5 מ"מ). לערבב היטב. אסוף supernatants צינורות microfuge נקי. דגימות ספין להיפטר פסולת התא XG ב 300 דקות 5 ב RT. העבר supernatants שלהם לתוך צינורות microfuge נקיים. ולשמור אותם על הקרח עד מוכן.
  6. השתמש aliquot של "תקן NET" שהוכן קודם לכן.
    הערה: הסטנדרטית NET הוא שילוב של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים PMA מגורה המתקבלים לפחות 5 תורמים אנושיים שונים, עצמאיים.
    1. כדי להשתמש באותה רמה במשך זמן רב, לאסוף aliquot נפח גדול של supernatants נויטרופילים מכל תורם יחיד. איסוף למשל 2 מ"ל של supernatants מתעכל DNase של נויטרופילים מגורה PMA תגרום 200 aliquots (10 μl כל אחד) מספיק 200 צלחות ELISA. נתונים המאפיינים את תקן NET נמצאים איור 5.
    2. לעורר נויטרופילים אדם עם 100 ננומטר PMA עבור 4 שעות ולהחיל DNase לעכל כדי supernatants שלהם על פי השלבים 3.4-3.5.
    3. אסוף, בריכה, aliquot (10 μl) וחופשיze (-20 ° C) supernatants נויטרופילים.
    4. כדי להכין את "NET סטנדרטי", הפשרה אחד aliquot / תורם המתקבל לפחות חמישה תורמים נפרדים, לערבב אותם ולשמור אותם על קרח.
    5. בטל דגימות מופשרות ולהשתמש נרות חדשים לניסוי הבא.
    6. כן 1: דילול סדרה 2 של התקן-NET ב PBS + EGTA.
  7. לדלל דגימות מתעכלות DNase1 (סטנדרטי supernatants הידוע) פי 20 ב PBS + EGTA ו aliquot אותם על צלחות ELISA מצופות נוגדנים ללכוד.
  8. דגירה צלחות ELISA במשך הלילה על 4 מעלות צלזיוס ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS.
  9. החל פתרון נוגדן איתור (100 μl / טוב): נוגדן אנטי DNA מצומדות peroxidase חזרת (1: 500, העכבר). דגירה עבור שעה 1 בחושך.
  10. אחרי ארבעה שוטף עם PBS להוסיף מצע peroxidase TMB: 100 μl / היטב, 30 דקות. צבע הכחול הוא אינדיקציה לפעילות peroxidase (רשתות נוכחיות).
  11. עצור תגובה על ידי הוספת 100 μl / טוב 1 M HCl. הפתרונות כחולים יצהיבו (איור 5 א).
  12. קראו ספיגה ב 450 ננומטר באמצעות פוטומטר microplate.
  13. לניתוח נתונים, לחשב את כמות MPO-DNA או מתחמים-DNA HNE בהשוואת לתקן NET.
    1. הפחת את ערך צפיפות אופטית רקע של המדיום assay מכל המדגמים.
    2. מגרש את הערכים הספיגים (ציר ה- X) של דגימות תקן בדילול נגד תוכן NET היחסי (ציר ה- Y) (איור 5 א).
    3. באמצעות מגוון nonsaturated של עקומת סטנדרט זה להקים קו המגמה (להשתמש בכושר מעריכי הטוב ביותר מהתוכנה בשימוש) (איור 5 א). המשוואה של קו מגמה זו קובעת את ההמרה של ערכי OD כדי כמותיים סכומי נטס.
    4. הכנס את ערכי OD המדודים של האלמונים למשוואת המגמה אונליין מ 3.13.3 זה תיתן את כמות הרשתות במדגם הידוע כאחוז התקן-NET (איור 5 א).
    5. לחשבממוצעים של משכפל (triplicates) ולהציג את הנתונים הסופיים כמו "כמות MPO-DNA או מתחמי-DNA HNE (% לסטנדרטים)" (איור 5 ג).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הנתונים בכתב היד הזה לתאר את שיטת בידוד נויטרופילים, פרוצדורות, ותוצאות נציג נוכחיות עם הסבר של ניתוח נתונים. איור 1 מציג את צעדי סדרתי של הכנת נויטרופילים אדם. פרוטוקול זה מייצג רק דרך אפשרית אחת של בידוד נויטרופילים. זה מניב כמויות גדולות של נח נויטרופילים מסוגל לשחרר נטס על גירוי. איור 2 מראה כיצד assay לשחרור DNA מבוסס-הקרינה עובד. באמצעות קינטיקה קורא microplate קרינה של שחרור דנ"א נויטרופילים אדם המיושמים 96 גם microplates. איור 3 מסביר כל צעד של ניתוח הנתונים. ראשית, לחשב אות DNA מקסימלי נויטרופילים שטופלו saponin (איור 3 א). גידול הקרינה תמיד מחושב כהפרש בין ערך הקרינה הגבוה ביותר ורמת קרינת רקע ( פ aeruginosa (PAO1) (איור 3B). פ aeruginosa מעורר היווצרות נטו PMNs האדם. 5,8,10 הוכח עם מספר פ aeruginosa זנים כולל PAO1 כי חיידקים בלבד (ללא נויטרופילים) לא יחייבו את צבען לגילוי DNA בשימוש. 8 PAO1 פ aeruginosa התקבל ATCC, בתרבית לילה בינוני לוריא- Bertani, שנקטפו בשלב מאוחר מעריכי, שטף במדיום assay והשתמשו לעורר נויטרופילים על ריבוי של זיהום (משרד הפנים) של 10: 1 (איור 3B, C, 4B, C). הממוצעים של גידול הקרינה של בארות לשכפל מחושבים, מנורמלים על קרינת מקסימלית (saponin) והם כפי שבאו לידי ביטוי "שחרור DNA (% ממשקל מקסימאלי)" (איור 3 ג). איור 3D מציג פלורסנט נציגתמונות דעך של נויטרופילים מטופל או PMA-מגורה.

איור 4 א מתאר את ערכת מסביר את העקרונות של מבחני ELISA MPO-דנ"א HNE-DNA. איור 4B מראה תמונות immunofluorescence נציג nonstimulated, PMA- ו נויטרופילים אדם המופעל PAO1. תאי DNA מראה מורפולוגיה NET טיפוסי ושיתוף localizes עם MPO ו- H4 היסטון citrullinated, סמן של היווצרות NET. 6 איור 4C מראה MPO-DNA ושחרור HNE-דנ"א נויטרופילים האדם תחת קורת, התנאים הקודמים (כמו איור 3B, 3C ו -4 ב). IThe "NET" שיטות ELISA מתאפיינים בעבר. 5 בקצרה, 2 U / ml טיפול DNase (המקבילה של 1 מיקרוגרם / ריכוז מ"ל של DNase בשימוש) במשך 15 דקות ב RT הביא את האותות MPO-דנ"א HNE-DNA הגבוהה ביותר . 5 דגימות ריצה (100 ng / נתיב) על ג'ל agarose חשף כי אורך DNAבתשואות לטווח kb נמוך אות ELISA אופטימלי. 5 DNA overdigestion (DNase מינון גבוה יותר מ -20 U / ml) או להשמיט גם את תפיסתם או נוגדן זיהוי ביטל את אותות ELISA. 5

בנוסף, כאן המבחנים ואת "התקן NET-" מאופיינים נוסף (איור 5 א). The Net-רגיל מכיל על דנ"א תאיים הממוצע 19.5 מיקרוגרם / מ"ל ​​(נמדד על ידי שימוש בתקן עם ריכוזי DNA ידוע), 399 ng / ml MPO ו HNE 103.4 ng / ml (מסחרי ELISAkits) (n = 8). בהתבסס על משקל מולקולרי הכולל של MPO (84 KDA) ו HNE (29.5 KDA) והעובדה 1 מיקרוגרם DNA מכיל 9.91 x 10 14 נוקלאוטידים, Net-רגיל מכיל 109 HNE מולקולות 147 מולקולות MPO ל -1,000 נוקלאוטידים (DNA kb ). כפולת ניסויי דילול סדרה של NET-התקן גילו כי הטווח הדינמי של שני מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA ELISA הוא בין 19.0 - 609,0 ng /ריכוזי המ"ל DNA (איור 5). דילולים נמוכים יותר פי 32 של תקן NET ביאה לרוויה בעוד דילולים של גבוה 1,024 פי לא היו שונים מן הרקע (איור 5 ב). טיפול של תקן NET עם מעכבי פרוטאז לא לשנות תוצאותיה שהשיגו מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA המציין כי פרוטאזות אינם מפריעים מבחנים אלה (איור 5 ג). לפיכך, תוצאות שהושגו המדגם הזהה NET הסטנדרטי ידי ELISA MPO-DNA או HNE-DNA מבחני מתואמים חזק עם השני (איור 5D). כדי להראות כי supernatants PMN הקפוא יכול לשמש גם מבחנים אלה מבלי לאבד יעילות, כמה aliquots של NET-התקן נותר ללא טיפול או אחרים נחשפו אחד או שני מחזורי הקפאה / פשרה בצעו ב -20 ° C או -80 ° C (1 מרווח hr). אף אחד מהטיפולים ההקפאה / הפשרה השפיעו על תוצאות MPO-DNA או HNE-DNA (איור 5E). לסיכום,NET-התקן קובע נקודת התייחסות אמינה מבחני NET-לכימות אלה המאפשרים השוואת כמותית של תוצאות NET בין ניסויים עצמאיים.

איור 1
איור 1:. בידוד של האדם נויטרופילים גרנולוציטים נויטרופילים בודדו מדם היקפי של מתנדב על פי הפרוטוקול המתואר. דם המכילה קרישה שמשה לבודד נויטרופילים ידי שקיעת Dextran צנטריפוגה שיפוע. דם ללא נוגד קרישה שימש להכנת בסרום. הכדאיות של ההכנות נויטרופילים נבחנת על ידי assay הרחקה כחול Trypan. טוהר נויטרופילים נבחן על ידי cytospin או cytometry זרימה (CD16, CD66abcd תאים פעמים חיוביים). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2:. עקרונות של Assay תאי DNA שחרור (א) הקרינה מתקבל רק נויטרופילים אשר פלזמה ממברנות הגרעין נפרץ ואת צבע קרום חדיר ה- DNA מחייבת יכול להיקשר ל- DNA שלהם. (ב) assay מבוצע על 96-היטב שחור microplates באמצעות fluorimeter microplate. (ג) fluorimeter רושמת עקומות קרינה בזמן אמת בכל טוב. אחת התוצאות נציג לראות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3
איור 3: ניתוח של נתוני שחרור DNA (. (ב) קינטיקה של שחרור DNA נויטרופילים המושרה על ידי PMA (100 ננומטר) וחיידקים (Pseudomonas aeruginosa PAO1, 10 משרד הפנים). (C) מנורמל מרוכז נתוני שחרור DNA שהושגו אחד ניסויים באמצעות quadriplicates. (ד) תמונות קרינת נציג של נויטרופילים אדם מטופל PMA מגורה (אורנג Sytox, דגירת hr 4). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4
איור 4: MPO-דנ"א HNE-DNA ELISA מבחנים:. עיקרון ואת נציג תוצאות (א) תכנית להסבירing איך עבודת מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA ELISA. (ב) נציג תוצאות של תמונות immunofluorescence המוכנות על נויטרופילים אדם חשופים 100 ננומטר PMA או פ aeruginosa זן PAO1 (10 משרד הפנים) עבור 4 שעות. תאי DNA (DAPI, כחול) שיתוף לוקליזציה ברשתות עם MPO (ירוק) ו- H4 היסטון citrullinated (אדום). תוצאת נציג אחד, n = 3. (ג) שחרור NET נמדדה נויטרופילים אדם חשופים לאותה גירויים כנ"ל על ידי מבחני ELISA MPO-דנ"א HNE-DNA. ממוצע ± SEM, n = 3. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5
איור 5: אפיון של "NET הסטנדרטי" (א) דילולים הסידוריים. (1: 2) תקן NET הוכנונתון MPO-DNA ELISA. ערכי OD נמדדים הם זממו נגד% של תוכן NET הסטנדרטי. אדום "X" מציין ערך OD נמדד של מדגם לא ידוע. החץ האפור מציין כיצד "ריכוז NET" (כחול "X") של מדגם לא ידוע יקבע באמצעות מגוון המרכזי של עקומת סטנדרט מצויד. (ב) ריכוזי DNA בדגימות NET סטנדרטיים בדילול סדרתי נקבעו זממו נגד ערכי OD המדוד של מבחני ELISA MPO-DNA או HNE-DNA. תחומים אפורים לציין את הטווח הדינמי של המבחנים. (ג) הטיפול מעכב פרוטאז (קוקטייל מעכבי פרוטאז, 1%) אינה משפיעה על התוצאה של מבחני MPO-DNA או HNE-דנ"א (סטנדרטיים NET). ממוצע ± SEM, n = 2. (ד) המתאם של תוצאות MPO-דנ"א HNE-דנ"א (OD 450 ננומטר) של בדילול סדרתי "רגיל-NET" דגימות טווח דינמי שלהם (ראה 5B). (E) מחזורי הקפאה להפשרה (-20 ° C או -80 מעלות צלזיוס; one או שתיים) אינו משפיע על התוצאות של MPO-דנ"א מבחני HNE-דנ"א (NET-רגיל, ממוצע ± SEM, n = 2). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

רשתות מייצגי מנגנון חדשני מרתק שבו נויטרופילים להרוג פתוגנים. 1 למרות שהספרות של הנטס כבר ברציפות ההרחבה בעשר השנים האחרונות מאז גילויין, מספר שאלות חשובות הקשורות לתפקידם בביולוגיה, מנגנון ויסות עדיין אינן ברורות. יש במתודולוגיה שתפותח למדוד נטס, זה מנגנון מיקרוביאלית מאוד ייחודי. מאמר זה מתאר את השיטות שבהן ניתן להשתמש כדי לכמת נטס באופן תפוקה גבוהה. את assay הראשון כדלקמן קינטיקה של הקרינה של צבען DNA מחייבת קרום חדיר. assay זה מספק כמות גדולה של מידע על המדרון ומהירות שחרור דנ"א נויטרופילים. מידע זה חיוני בחקירות לומדות מוקדם איתות אירועים המוביל להיווצרות NET. כל המידע הזה הוא אבד מבחני סיום מדידים שחרור DNA בסוף הדגירה. הדנ"א התאי לצבוע המבוסס assay אינו ספציפי עבור רשתות. זהרק מודד שחרור DNA. כדי לאשר נטס, זה מקובל לבצע immunofluorescence על נויטרופילים יוצרי NET ולהראות שיתוף לוקליזציה של DNA או בטושים גרגיר (MPO, HNE) או היסטונים. כימות של נתוני immunofluorescence היא אף מאוד משעממת וסובייקטיביים.

כאן, שינוי של assay ELISA שפותחו בעבר גילוי מתחמי MPO-DNA מוצג. מדידה assay ELISA דומה מתחמי HNE-DNA המייצגים אמצעים NET ספציפיים מתואר גם. 3,5 מבחני שניהם מתאפיינים בפרוטוקול מפורט ומלא. 5 מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA ELISA הם כמותיים NET ספציפיים בעת ובעונה אחת תכונות. 5 אלה אינן מתקיימים בכל דרך שוטפת אחרת. המבחנים קלים לבצע ולספק נתונים לשחזור. 5 צעד עיכול DNase מוגבל כלול המבטיחים טיפול מהיר ואחיד של רשתות ישירות על נויטרופילים. 5 מבחנים אלה מתאימים כדי comלקלף כמה דגימות בעת ובעונה אחת. במדידות חדשות, בקרה הוא הראה כי מחזורי הקפאה / פשרה ו פרוטאזות אינן משפיעות על התוצאה של מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA. לא ידוע, עם זאת, אם חלבונים ידועים נקשרים ל- DNA ברשתות (כולל היסטונים ול"ל-37) 1,11 יפריע מבחנים אלה.

צעדים קריטיים של הפרוטוקולים שהוצגו הם כדלקמן. חשוב לקצור נויטרופילים הנמצאים במצב מנוחה, רגיעה ואינו לשחרר כמות גדולה של רשתות באופן ספונטני. חוסר צעד תמוגה hypotonic להסיר תאי הדם האדומים בפרוטוקול בידוד נויטרופילים המוצג הינו חיוני כדי להשיג נויטרופילים שאינם מופעלים. כדי לעכב הפעלת נויטרופילים לאחר שהתאים היו מטוהרים, זה חשוב גם resuspend נויטרופילים בתווך המכיל סרום של התורם שלהם. כדי להשיג תאים רדומים הוא גם חיוני להשתמש ריאגנטים pyrogen- וזיהום ללא במהלך הכנת נויטרופילים. Spontaשחרור NET neous של נויטרופילים במהלך assay לשחרור DNA התאי יכול לקרות גם. הוספת 1% סרום אוטולוגי למדיום assay חשוב למנוע זאת. גבוהות או נמוכות מנות של סרום אוטולוגי יכולות להיבדק כדי לקבל תוצאות אופטימליות. זה קריטי במהלך מבחני ELISA MPO-דנ"א HNE-DNA שפורסמו DNA לא צריך להיות יותר מדי מתעכל על ידי DNase משום שהיא תגרום לאובדן מוחלט של האות. לכן, המינון האופטימלי צריך להיקבע עבור כל אצווה DNase חדשה. הפרמטרים של מערכת העיכול DNA יכול להיות שונה מעט כדי להשיג את ELISA הגבוהה ביותר אותות אפשריים. כמו כן, חשוב לערבב את DNase ורשתות ביסודיות כדי להבטיח כי DNase תהיה גישה ברורה ל- DNA. כאשר קצירת נטס מתעכל, לשטוף הבאר נרחבת כדי לאסוף את כל הרשתות.

מגבלת זיהוי DNA של מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA הוא סביב 10-20 DNA ng / ml (איור 5). רמות סרום ו- DNA פלזמה ללא לנתקאל מאות עד אלף ng / ml דווחו מחלות (סרטן, זאבת אדמנתית מערכתית, זיהום שריר הלב) כי קושרו עם היווצרות NET נורמלי. 12-14 הדבר מצביע על כך מבחני MPO-דנ"א HNE-DNA ELISA גם יש פוטנציאל כדי להיות מסוגל לכמת נטס בדגימות קליניות בבני אדם. יישום עתידי זה של מבחני ELISA MPO-דנ"א HNE-דנ"א יאפשר לקשר כמותית וגבעות כדי בהיווצרות המחלה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab  Calbiochem 481001 1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) Millipore 07-496 1:2,000x coated
DNase-1 Roche 10-104-159-001 1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS Sigma-Aldrich E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS Sigma-Aldrich E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD Roche 11544675001 1:500x 
Eon Microplate Spectrophotometer Biotek
Gen5 All-in-One microplate software Biotek analytical tool (ELISA)
Sytox orange Life Technology S11368 0.2% final concentration/volume
1 M Hepes Cellgro 25-060-Cl Use 10 mM final concentration.
1 M glucose Sigma Use 5 mM final concentration.
HBSS Corning 21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3 Thermoscientific
PMA Sigma P 8139 100 nM final used
ELISA Plate Greiner bio-one 655061
Conical tubes 15 ml Thermoscientific 339650
Conical tubes 50 ml Thermoscientific 339652
Percoll (pH 8.5-9.5)  Sigma P 1644 Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran Spectrum D1004
RPMI 1640 media Corning Cellgro 17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom Costar 3603

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
  2. Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
  3. Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
  4. Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
  5. Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
  6. Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
  7. Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
  8. Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
  9. Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
  10. Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
  11. Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
  12. Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
  13. Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
  14. Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).

Tags

אימונולוגיה גיליון 112 מלכודות תאי נויטרופילים NET גרנולוציטים נויטרופילים DNA תאיים myeloperoxidase אלסטט נויטרופילים לכמת ELISA קצב העברת נתונים גבוה
מדידת תפוקה גבוהה של שחרור DNA תאי והיווצרות NET כמוני נויטרופילים האנוש<em&gt; במבחנה</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sil, P., Yoo, D. g., Floyd, M.,… More

Sil, P., Yoo, D. g., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro. J. Vis. Exp. (112), e52779, doi:10.3791/52779 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter