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Immunology and Infection

कोशिकी डीएनए रिलीज के उच्च throughput मापन और मानव न्यूट्रोफिल में मात्रात्मक नेट गठन Published: June 18, 2016 doi: 10.3791/52779
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1
1Department of Infectious Diseases, University of Georgia
* These authors contributed equally

Protocol

जॉर्जिया विश्वविद्यालय की संस्थागत समीक्षा बोर्ड मानव विषय अध्ययन स्वस्थ स्वयंसेवकों (UGA # 2012-10769-06) से परिधीय रक्त एकत्र करने के लिए मंजूरी दे दी। 5,7,8 स्वयंसेवक रक्त ड्रॉ से पहले आवश्यक सूचित सहमति पत्र पर हस्ताक्षर किए। अनुसंधान के इस लेख में प्रदर्शन चिकित्सा अनुसंधान हेलसिंकी की घोषणा की मानव विषयों को शामिल करने के लिए नैतिक दिशा निर्देशों के अनुपालन में है।

परिधीय मानव रक्त से न्यूट्रोफिल की 1. अलगाव (चित्रा 1)

नोट: वहाँ परिधीय रक्त से न्यूट्रोफिल को अलग करने के कई तरीके हैं। निम्नलिखित प्रोटोकॉल एक संभावना प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल गैर सक्रिय मानव बाहरी उत्तेजना पर जाल को रिहा करने में सक्षम न्यूट्रोफिल की बड़ी संख्या को अर्जित करता है। 40 मिलीलीटर पूरे रक्त venipuncture से स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त प्रयोग करें। 7,9

  1. दो 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में अशेष 20 मिलीलीटर खून। 10 मिलीलीटर 6% dextran जोड़ें। धीरे मिलाएं।
  2. 20 मिनट के हस्तांतरण ल्युकोसैट रिक के बादसाफ 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में किसी भी pelleted लाल रक्त कोशिकाओं को ले जा रही है, और इसे भरने बाँझ पीबीएस के साथ बिना ज ऊपरी चरण।
  3. 400 XG 10 मिनट पर अपकेंद्रित्र। 4 मिलीलीटर में resuspend गोली पीबीएस बाँझ।
  4. प्रत्येक ढाल के शीर्ष पर दो 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब और परत 2 मिलीलीटर ल्युकोसैट निलंबन में 85% की एक 5-कदम Percoll ढाल तैयार -80% -75% -70% -65%।
  5. ब्रेक बंद के साथ 30 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र 800 XG।
  6. सभी कोशिकाओं को 75% / 80% से कम परतों में (न्यूट्रोफिल) और 70% / 75% इंटरफ़ेस लीजिए।
  7. पीबीएस में दो बार कोशिकाओं को धो लें (350 XG, 10 मिनट, आरटी) और एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती।

2. कोशिकी डीएनए रिलीज की काइनेटिक्स के मापन एक microplate Fluorimeter का प्रयोग

नोट: इस विधि को एक झिल्ली अभेद्य डीएनए बाध्यकारी एक 96 अच्छी तरह से microplate प्रारूप पर डाई डीएनए रिहाई का संकेत (चित्रा 2) के प्रतिदीप्ति में परिवर्तन की माप सक्षम बनाता है।

  1. (HbSS परख माध्यम में न्यूट्रोफिल के निलंबन की तैयारी +1% (वी / वी) ऑटोलॉगस सीरम + 5 मिमी 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में ग्लूकोज)।
  2. जोड़े झिल्ली अभेद्य डीएनए बाध्यकारी डाई के 5 μmol / एल। धीरे मिलाएं।
  3. अशेष मानव न्यूट्रोफिल (50 μl / अच्छी तरह से) 96 अच्छी तरह से काले, पारदर्शी नीचे microplates पर। यकीन परख मध्यम अच्छी तरह से की पूरी तह शामिल किया गया। यदि नहीं, तो तरफ धीरे थाली नल।
  4. 37 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए थाली युक्त न्यूट्रोफिल गर्म।
  5. प्रयोग की जाने वाली इस दौरान उनके अंतिम सांद्रता के डबल में उत्तेजनाओं का समाधान तैयार (37 डिग्री सेल्सियस गर्म परख माध्यम में)। जबकि सहज नेट गठन कम 5.8 रहता है एक सकारात्मक शुद्ध नियंत्रण 4 घंटे के लिए 100 एनएम phorbol-myristate-एसीटेट (पीएमए) के साथ मानव न्यूट्रोफिल का उपयोग के रूप में अधिक से अधिक शुद्ध रिहाई को ट्रिगर। 4 घंटे के लिए 5.8 पीएमए उत्तेजना अधिक से अधिक शुद्ध रिहाई सुनिश्चित करता है।
  6. माप (4 घंटा, 37 डिग्री सेल्सियस, उत्तेजना के लिए 530 एनएम और उत्सर्जन के लिए 590 एनएम) के लिए microplate fluorimeter तैयार करें। </ Li>
  7. 50 μl न्युट्रोफिल निलंबन करने के लिए 50 μl प्रोत्साहन समाधान जोड़कर न्यूट्रोफिल उत्तेजित। अच्छी तरह से एक में 0.5 माइक्रोग्राम / एमएल सैपोनिन का प्रयोग अधिक से अधिक डीएनए रिहाई संकेत को मापने के लिए।
  8. रीडर में थाली प्लेस और कोई झटकों के साथ हर 2 मिनट में 4 घंटे के लिए प्रतिदीप्ति में परिवर्तन को मापने।
  9. डेटा विश्लेषण के लिए, समय के साथ प्रतिदीप्ति में सामान्यीकृत बढ़ जाती है की गणना।
    1. घटाना आधारभूत सैपोनिन सहित सभी कुओं के लिए समापन बिंदु मूल्यों से प्रतिदीप्ति (चित्रा 2A, बी)। सैपोनिन प्रतिदीप्ति में उदय उच्चतम संकेत होना चाहिए। यह 'के रूप में अधिक से अधिक डीएनए रिलीज "(2A चित्रा) कहा जाता है।
    2. अधिक से अधिक डीएनए रिहाई के द्वारा अज्ञात नमूनों की प्रतिदीप्ति में वृद्धि को विभाजित करके अज्ञात नमूने में डीएनए रिहाई के प्रतिशत की गणना।
    3. प्रतिकृति की औसत परिणाम और उन्हें "अधिक से अधिक डीएनए रिहाई के%" (चित्रा 2 सी) के रूप में प्रस्तुत करते हैं।

3. नेट फार्म के quantitationएमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा संसाधनों द्वारा समझना

नोट: हमारी प्रयोगशाला में ये assays संशोधित (एमपीओ-डीएनए) या ​​स्थापित (HNE-डीएनए) एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए परिसरों के स्तर को मापने के द्वारा नेट गठन quantitate 5।

  1. कोट 96 अच्छी तरह से उच्च बाध्यकारी रात भर कब्जा एंटीबॉडी के साथ (50 μl / अच्छी तरह से) क्षमता एलिसा प्लेट्स: विरोधी एमपीओ (1: 2,000 कमजोर पड़ने) या विरोधी HNE (1: 2,000)।
  2. धो एलिसा प्लेटों पीबीएस के साथ तीन बार (200 μl / अच्छी तरह से) और आरटी पर 2 घंटे के लिए 5% और 0.1% बीएसए मानव सीरम albumin के साथ उन्हें ब्लॉक (200 μl / अच्छी तरह से)। पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  3. पर 96 अच्छी तरह से microplates 100,000 कोशिकाओं / 100 μl परख माध्यम में अच्छी तरह के घनत्व पर बीज न्यूट्रोफिल, और NET गठन को प्रोत्साहित। कोशिकाओं को सेते: 37 डिग्री सेल्सियस के लिए 4 घंटा।
  4. न्यूट्रोफिल supernatants के लिए 2 यू / एमएल DNase जोड़कर एक सीमित DNase पाचन प्रदर्शन करना, उन्हें अच्छी तरह मिला लें। उन्हें आरटी पर रखें।
  5. 11 μl 25 मिमी EGTA (अंतिम एकाग्रता 2.5 मिमी) जोड़कर 15 मिनट के बाद DNase बंद करो। अच्छी तरह मिलाएं। सु लीजिएस्वच्छ microfuge ट्यूबों में pernatants। स्पिन नमूने आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर सेल मलबे से छुटकारा पाने के लिए। स्वच्छ microfuge ट्यूबों में उनकी supernatants स्थानांतरण। तैयार है जब तक बर्फ पर उन्हें रखें।
  6. एक पहले से तैयार "नेट मानक 'के एक विभाज्य का प्रयोग करें।
    नोट: नेट की मानक से कम से कम 5 अलग, स्वतंत्र मानव दानदाताओं से प्राप्त पीएमए उत्तेजित neutrophils के DNase पचा supernatants का एक मिश्रण है।
    1. एक लंबे समय के लिए एक ही मानक का उपयोग करें, इकट्ठा करने और प्रत्येक व्यक्ति के दाता से न्यूट्रोफिल supernatants की एक बड़ी मात्रा विभाज्य। उदाहरण के लिए एकत्रित पीएमए उत्तेजित neutrophils के DNase पचा supernatants के 2 मिलीलीटर 200 aliquots में 200 एलिसा प्लेटों के लिए पर्याप्त (10 प्रत्येक μl) परिणाम होगा। नेट मानक निस्र्पक डेटा चित्रा 5 में पाए जाते हैं।
    2. 4 घंटे के लिए 100 एनएम पीएमए के साथ मानव न्यूट्रोफिल उत्तेजित और DNase कदम 3.4-3.5 अनुसार उनके supernatants को पचाने में लागू होते हैं।
    3. लीजिए, पूल, विभाज्य (10 μl) और मुफ्तज़ी (-20 डिग्री सेल्सियस) न्यूट्रोफिल supernatants।
    4. पिघलना एक विभाज्य / दाता कम से कम पांच अलग-अलग दानदाताओं से प्राप्त "मानक नेट" तैयार करने के लिए, उन्हें मिश्रण और उन्हें बर्फ पर रहते हैं।
    5. thawed नमूने त्यागें और अगले प्रयोग के लिए नए सिरे से लोगों का उपयोग करें।
    6. पीबीएस + EGTA में नेट-मानक के 2 धारावाहिक कमजोर पड़ने एक 1: तैयार करें।
  7. DNase1 पचा नमूने (मानक और अज्ञात supernatants) पीबीएस + EGTA में 20 गुना पतला और कब्जा एंटीबॉडी के साथ लेपित एलिसा प्लेटों पर उन्हें विभाज्य।
  8. 4 डिग्री सेल्सियस पर रात खत्म एलिसा प्लेटें सेते हैं और उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं।
  9. पता लगाने के एंटीबॉडी समाधान लागू (100 μl / अच्छी तरह से): घोड़ा मूली peroxidase संयुग्मित विरोधी डीएनए एंटीबॉडी (1: 500, माउस)। अंधेरे में 1 घंटे के लिए सेते हैं।
  10. पीबीएस के साथ चार washes के बाद जोड़ने TMB peroxidase सब्सट्रेट: 100 μl / अच्छी तरह से, 30 मिनट। नीले रंगाई peroxidase गतिविधि (वर्तमान नेट) के लिए एक संकेत है।
  11. 100 μl / अच्छी तरह से 1 एम एचसीएल जोड़कर प्रतिक्रिया बंद करो।नीले पीले समाधान (चित्रा 5 ए) बंद हो जाएगा।
  12. 450 एक microplate दीप्तिमापी का उपयोग कर एनएम पर absorbance पढ़ें।
  13. डेटा विश्लेषण के लिए, नेट मानक की तुलना में एमपीओ डीएनए या HNE डीएनए परिसरों की राशि की गणना।
    1. सभी नमूनों से परख माध्यम की पृष्ठभूमि ऑप्टिकल घनत्व मूल्य घटाना।
    2. उनके रिश्तेदार नेट सामग्री (शाफ़्ट) (चित्रा 5 ए) के खिलाफ पतला मानक नमूनों की absorbance के मूल्यों (एक्स अक्ष) प्लॉट।
    3. इस मानक वक्र के nonsaturated रेंज का उपयोग करते हुए एक प्रवृत्ति लाइन (चित्रा 5 ए) (प्रयुक्त सॉफ्टवेयर से सर्वश्रेष्ठ घातीय फिट का उपयोग करें) की स्थापना। इस प्रवृत्ति लाइन के समीकरण आयुध डिपो मूल्यों का रूपांतरण नेट की मात्रा में मात्रात्मक को निर्धारित करता है।
    4. 3.13.3 से ट्रेंड लाइन समीकरण है कि नेट की मानक (चित्रा 5 ए) के प्रतिशत के रूप में अज्ञात नमूने में नेट की राशि दे देंगे में अज्ञात के मापा आयुध डिपो मूल्यों डालें।
    5. गणनाप्रतिकृति (triplicates) के औसत और के रूप में (चित्रा 5C) "एमपीओ डीएनए या HNE डीएनए परिसरों (मानक का%) की राशि" अंतिम डेटा प्रस्तुत करते हैं।

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Representative Results

इस पांडुलिपि में आंकड़े न्युट्रोफिल अलगाव, प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं, और डेटा विश्लेषण के विवरण के साथ उपस्थित प्रतिनिधि परिणामों की विधि का वर्णन है। चित्रा 1 मानव न्युट्रोफिल तैयारी के अनुक्रमिक कदम से पता चलता। इस प्रोटोकॉल न्युट्रोफिल अलगाव का केवल एक ही तरीका संभव प्रतिनिधित्व करता है। यह उत्तेजना पर जाल को रिहा करने में सक्षम न्यूट्रोफिल आराम की बड़ी मात्रा में पैदावार। 2 से पता चलता चित्रा कैसे प्रतिदीप्ति आधारित डीएनए रिलीज परख काम करता है। डीएनए रिहाई की एक प्रतिदीप्ति microplate रीडर का उपयोग कैनेटीक्स में मानव न्यूट्रोफिल में पीछा कर रहे 96 अच्छी तरह से microplates। चित्रा 3 डेटा विश्लेषण के हर कदम बताते हैं। सबसे पहले, सैपोनिन (चित्रा 3) के साथ इलाज किया न्यूट्रोफिल में अधिक से अधिक डीएनए संकेत गणना। प्रतिदीप्ति में वृद्धि हमेशा उच्चतम प्रतिदीप्ति मूल्य और पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति स्तर (के बीच अंतर के रूप में गणना की जाती है पी के साथ सक्रिय छोड़ा aeruginosa (PAO1) (चित्रा 3 बी) पी। aeruginosa मानव PMNs में नेट गठन हो सके। 5,8,10 यह कई पी के साथ दिखाया गया है aeruginosa PAO1 कि अकेले बैक्टीरिया (जीवाणुओं के बिना) का इस्तेमाल किया डीएनए का पता लगाने के लिए बाध्य नहीं है डाई सहित उपभेदों। 8 PAO1 पी aeruginosa ATCC से प्राप्त हुई थी, Luria-Bertani मध्यम रात भर में सुसंस्कृत, देर-घातीय चरण में काटा, परख माध्यम में धोया और 10 के (MOI) संक्रमण की बहुलता पर न्यूट्रोफिल प्रोत्साहित करने के लिए प्रयोग किया जाता है: 1 (चित्रा 3 बी, सी, 4 बी, सी)। दोहराने कुओं की रोशनी में वृद्धि का मूविंग गणना कर रहे हैं, अधिक से अधिक प्रतिदीप्ति (सैपोनिन) पर सामान्यीकृत और "के रूप में डीएनए रिलीज (अधिकतम%)" (चित्रा 3 सी) व्यक्त कर रहे हैं। चित्रा 3 डी प्रतिनिधि fluores चलताअनुपचारित या पीएमए उत्तेजित neutrophils के cence छवियों।

चित्रा -4 ए योजना एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays। चित्रा 4 बी, nonstimulated PMA- और PAO1 सक्रिय मानव neutrophils के प्रतिनिधि immunofluorescence छवियों से पता चलता के सिद्धांतों समझा दर्शाया गया है। कोशिकी डीएनए ठेठ नेट आकृति विज्ञान पता चलता है और एमपीओ और citrullinated हिस्टोन एच 4, नेट गठन के एक मार्कर के साथ सह-localizes। 6 चित्रा 4C चित्रा 3 बी, 3 सी की तरह ही है, पिछले शर्तों के तहत मानव न्यूट्रोफिल में एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए रिलीज (पता चलता है और 4 बी)। IThe "शुद्ध" एलिसा तरीकों पहले विशेषता किया गया है। 5 संक्षेप में, 2 यू / एमएल DNase उपचार आरटी पर 15 मिनट के लिए (1 माइक्रोग्राम इस्तेमाल किया DNase का / एमएल एकाग्रता के बराबर) उच्चतम एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए संकेतों में हुई । एक agarose जेल पर 5 चल नमूने (100 एनजी / लेन) है कि डीएनए की लंबाई का पता चलाकम केबी रेंज पैदावार में इष्टतम एलिसा संकेत। 5 डीएनए overdigestion या (DNase अधिक से अधिक 20 यू / एमएल खुराक) को छोड़ते हुए या तो कब्जा या पता लगाने के एंटीबॉडी को समाप्त कर दिया एलिसा का संकेत है। 5

इसके अलावा, यहां assays और "शुद्ध मानक" आगे से विशेषता (चित्रा 5 ए) कर रहे हैं। नेट की मानक औसत 19.5 माइक्रोग्राम / एमएल कोशिकी डीएनए (ज्ञात डीएनए सांद्रता के साथ एक मानक का उपयोग करके मापा जाता है), 399 एनजी / एमएल एमपीओ और 103.4 एनजी / एमएल HNE (वाणिज्यिक ELISAkits) पर होता है (एन = 8)। एमपीओ (84 केडीए) और HNE (29.5 केडीए) की कुल आणविक वजन और तथ्य यह है कि 1 माइक्रोग्राम डीएनए 9.91 x 10 14 न्यूक्लियोटाइड शामिल है के आधार पर, शुद्ध मानक 109 HNE अणुओं और 1000 न्यूक्लियोटाइड प्रति 147 एमपीओ अणुओं (केबी डीएनए होता है )। दो गुना नेट की मानक के धारावाहिक कमजोर पड़ने प्रयोगों से पता चला है कि दोनों एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays के गतिशील पर्वतमाला के बीच हैं 19.0 - 609,0 / एनजीमिलीलीटर डीएनए सांद्रता (चित्रा 5 ब)। से नेट मानक के 32 गुना कम की dilutions संतृप्ति में हुई है, जबकि अधिक से अधिक 1024 गुना के dilutions पृष्ठभूमि (चित्रा 5 ब) से अलग नहीं थे। प्रोटीज अवरोधकों के साथ नेट मानक का उपचार इसके परिणाम यह दर्शाता है कि proteases इन assays (चित्रा 5C) के साथ हस्तक्षेप नहीं करते एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए assays के द्वारा प्राप्त नहीं बदला। इस प्रकार, परिणाम एमपीओ डीएनए या HNE डीएनए एलिसा द्वारा एक ही शुद्ध मानक नमूने में प्राप्त दृढ़ता से एक दूसरे (चित्रा 5 डी) के साथ संबंध स्थापित assays। दक्षता को खोने के बिना दिखाने के लिए कि जमे हुए PMN supernatants भी इन assays में इस्तेमाल किया जा सकता है, शुद्ध मानक अनुपचारित छोड़ दिया गया या दूसरों को -20 डिग्री सेल्सियस पर या प्रदर्शन एक या दो / फ्रीज पिघलना चक्र से अवगत कराया गया -80 डिग्री सेल्सियस के कुछ aliquots (1 घंटा अंतराल)। फ्रीज पिघलना / उपचार से कोई भी एमपीओ डीएनए या HNE डीएनए परिणाम (चित्रा 5E) को प्रभावित किया। सारांश में,नेट की मानक इन नेट बढ़ाता assays स्वतंत्र प्रयोगों के बीच शुद्ध परिणाम की मात्रात्मक तुलना सक्षम करने में एक विश्वसनीय संदर्भ बिंदु प्रदान करता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। मानव न्यूट्रोफिल न्युट्रोफिल granulocytes के अलगाव वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार स्वयंसेवकों की परिधीय रक्त से अलग थे। रक्त युक्त थक्कारोधी Dextran अवसादन और ढाल centrifugation द्वारा न्यूट्रोफिल को अलग-थलग करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। थक्कारोधी बिना रक्त सीरम तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। न्यूट्रोफिल तैयारियों की व्यवहार्यता Trypan ब्लू बहिष्कार परख द्वारा मूल्यांकन किया है। न्युट्रोफिल पवित्रता cytospin द्वारा मूल्यांकन या प्रवाह cytometry है (CD16, डबल पॉजिटिव कोशिकाओं CD66abcd)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। कोशिकी डीएनए रिलीज परख के सिद्धांतों (ए) प्रतिदीप्ति केवल न्यूट्रोफिल जिसका प्लाज्मा और परमाणु झिल्ली से समझौता किया गया है और झिल्ली अभेद्य डीएनए बाध्यकारी डाई उनके डीएनए के लिए बाध्य कर सकते हैं में प्राप्त की है। (बी) परख एक microplate fluorimeter का उपयोग कर microplates काला 96 अच्छी तरह से किया जाता है। (सी) fluorimeter वास्तविक समय प्रतिदीप्ति घटता प्रत्येक में अच्छी तरह से रिकॉर्ड। दिखाए में एक प्रतिनिधि का परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: डीएनए रिलीज डेटा का विश्लेषण (। (बी) पीएमए (100 एनएम) और बैक्टीरिया (Pseudomonas aeruginosa PAO1, 10 MOI) द्वारा प्रेरित न्युट्रोफिल डीएनए रिहाई के काइनेटिक्स। (सी) सामान्यीकृत डीएनए रिहाई quadriplicates का उपयोग कर एक प्रयोगों में प्राप्त डेटा संक्षेप। (डी) इलाज और पीएमए उत्तेजित मानव neutrophils के प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों (Sytox ऑरेंज, 4 घंटा ऊष्मायन)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा Assays:। सिद्धांत और प्रतिनिधि परिणाम (ए) योजना समझानेआईएनजी कैसे एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays काम करते हैं। (बी) मानव न्यूट्रोफिल पर तैयार immunofluorescence छवियों के प्रतिनिधि परिणाम 100 एनएम पीएमए या पी के संपर्क में aeruginosa PAO1 तनाव (10 MOI) 4 घंटे के लिए। एमपीओ (हरा) और citrullinated हिस्टोन एच 4 (लाल) के साथ जाल में कोशिकी डीएनए (DAPI, नीला) के सह-localizes। एक प्रतिनिधि परिणाम, एन = 3 (सी) शुद्ध रिहाई एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays के द्वारा ऊपर के रूप में एक ही उत्तेजनाओं से अवगत कराया मानव न्यूट्रोफिल में मापा गया था। मतलब ± SEM, एन = 3. यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5:। "नेट-मानक" (ए) के सीरियल dilutions की विशेषता (1: 2) नेट मानक के तैयार किए गएऔर एमपीओ डीएनए एलिसा के अधीन है। मापा आयुध डिपो मूल्यों नेट की मानक सामग्री के% के खिलाफ साजिश रची है। लाल "X" एक अज्ञात नमूने के एक मापा आयुध डिपो मूल्य इंगित करता है। ग्रे तीर इंगित करता है कि अज्ञात नमूना के "नेट एकाग्रता" (ब्लू "एक्स") फिट मानक वक्र के केंद्रीय सीमा का उपयोग करके निर्धारित किया जा रहा है। क्रमानुसार मिश्रित कुल मानक नमूनों में (बी) के डीएनए सांद्रता निर्धारित किया है और एमपीओ डीएनए या HNE डीएनए एलिसा assays के आयुध डिपो मापा मूल्यों के खिलाफ साजिश रची थे। ग्रे क्षेत्रों assays के गतिशील पर्वतमाला संकेत मिलता है। (सी) protease अवरोध उपचार (protease अवरोध कॉकटेल, 1%) एमपीओ डीएनए या HNE डीएनए assays (नेट मानक) के परिणाम को प्रभावित नहीं करता। मतलब ± SEM, एन = 2. (डी) एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए परिणाम (आयुध डिपो के 450 एनएम) के क्रमानुसार पतला उनके गतिशील पर्वतमाला (5 ब देखें) में "नेट-मानक 'नमूने के सहसंबंध। (ई) ठंड और विगलन चक्र (-20 डिग्री सेल्सियस या -80 डिग्री सेल्सियस, ओपूर्वोत्तर या दो) एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए assays (नेट-मानक के परिणामों को प्रभावित नहीं करते, ± SEM के मतलब, एन = 2)। यहाँ यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें।

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Discussion

जाल एक आकर्षक उपन्यास व्यवस्था है जिसके द्वारा हालांकि नेट की साहित्य गया है लगातार पिछले दस वर्षों उनकी खोज के बाद से, कई महत्वपूर्ण जीव विज्ञान, तंत्र और नियमन में उनकी भूमिका से संबंधित सवालों अस्पष्ट रहते हैं भर में विस्तार किया गया न्यूट्रोफिल। रोगज़नक़ों मार 1 प्रतिनिधित्व करते हैं। उचित कार्यप्रणाली जाल, यह बहुत ही अनूठा रोगाणुरोधी तंत्र को मापने के लिए विकसित किया जाना है। यह लेख तरीकों कि एक उच्च throughput तरीके से जाल quantitate करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता का वर्णन है। पहली परख एक झिल्ली अभेद्य डीएनए बाध्यकारी डाई की प्रतिदीप्ति के कैनेटीक्स इस प्रकार है। इस परख ढलान और न्यूट्रोफिल से डीएनए रिहाई के वेग के बारे में जानकारी की बड़ी राशि प्रदान करता है। यह जानकारी नेट गठन के लिए अग्रणी जल्दी संकेत घटनाओं का अध्ययन कर जांच में महत्वपूर्ण है। यह सब जानकारी ऊष्मायन के अंत में डीएनए रिहाई को मापने के समापन बिंदु assays में खो जाती है। कोशिकी डीएनए डाई आधारित परख नेट के लिए विशिष्ट नहीं है। यहकेवल डीएनए रिहाई के उपाय। जाल पुष्टि करने के लिए, यह व्यापक रूप से नेट के गठन न्यूट्रोफिल पर immunofluorescence प्रदर्शन करते हैं और या तो दाना मार्कर (एमपीओ, HNE) या histones के साथ डीएनए के सह स्थानीयकरण दिखाने के लिए स्वीकार कर लिया है। इम्यूनोफ्लोरेसेंस डेटा के quantitation हालांकि बहुत थकाऊ और व्यक्तिपरक है।

इधर, एक पहले से विकसित एलिसा परख एमपीओ डीएनए परिसरों का पता लगाने के एक संशोधन प्रस्तुत किया है। इसी तरह की एक एलिसा परख मापने HNE डीएनए परिसरों कि विशिष्ट नेट उपायों का प्रतिनिधित्व भी वर्णन किया गया है। 3,5 दोनों assays विस्तृत में विशेषता किया गया है। 5 एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays मात्रात्मक और नेट विशिष्ट एक ही समय में कर रहे हैं । 5 इन सुविधाओं के किसी अन्य वर्तमान विधि द्वारा पूरा नहीं कर रहे हैं। Assays के प्रदर्शन और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्रदान करने के लिए आसान कर रहे हैं। 5 एक सीमित DNase पाचन कदम शामिल किया गया है कि सीधे न्यूट्रोफिल पर नेट की शीघ्र और मानकीकृत हैंडलिंग सुनिश्चित करता है। 5 ये assays कॉम के लिए उपयुक्त हैंएक ही समय में कई नमूने छाँटना। नई, नियंत्रण माप में यह दिखाया गया है कि / फ्रीज पिघलना चक्र और proteases एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए assays के परिणाम को प्रभावित नहीं करते। यह ज्ञात प्रोटीन जाल 1,11 इन assays के साथ हस्तक्षेप करेगा (histones और डालूँगा-37 सहित) में डीएनए के लिए बाध्य करने के लिए कि क्या अज्ञात है, लेकिन।

प्रस्तुत प्रोटोकॉल का महत्वपूर्ण चरणों का पालन कर रहे हैं। यह न्यूट्रोफिल कि एक आराम, मौन राज्य में हैं और अनायास नेट की बड़ी राशि रिलीज नहीं है फसल के लिए महत्वपूर्ण है। एक hypotonic सेल कदम की कमी प्रस्तुत न्युट्रोफिल अलगाव प्रोटोकॉल में लाल रक्त कोशिकाओं को हटाने के लिए गैर-सक्रिय न्यूट्रोफिल प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। न्युट्रोफिल सक्रियण को बाधित करने की कोशिकाओं को शुद्ध किया गया था के बाद, यह भी एक मध्यम उनकी दाता के स्वयं के सीरम युक्त न्यूट्रोफिल resuspend के लिए महत्वपूर्ण है। मौन कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए यह भी न्युट्रोफिल तैयारी के दौरान pyrogen- और प्रदूषण मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण है। Spontaकोशिकी डीएनए रिहाई परख के दौरान न्यूट्रोफिल की neous शुद्ध रिहाई भी हो सकता है। परख मध्यम करने के लिए 1% ऑटोलॉगस सीरम जोड़ना इसे रोकने के लिए महत्वपूर्ण है। ऑटोलॉगस सीरम के अधिक या कम खुराक इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए परीक्षण किया जा सकता है। यह एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays कि जारी की डीएनए DNase द्वारा जीत पचा नहीं होना चाहिए क्योंकि यह संकेत का पूरा नुकसान में परिणाम होगा दौरान महत्वपूर्ण है। इसलिए, इष्टतम खुराक हर नए DNase बैच के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। डीएनए पाचन के मापदंडों थोड़ा प्राप्त करने के लिए उच्चतम एलिसा संभव संकेत बदला जा सकता है। यह भी DNase और अच्छी तरह से जाल मिश्रण करने के लिए सुनिश्चित करने के लिए कि DNase डीएनए के लिए स्पष्ट उपयोग होगा महत्वपूर्ण है। जब पचा जाल कटाई, सभी नेट इकट्ठा करने के लिए बड़े पैमाने पर अच्छी तरह से धो लें।

एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए assays के डीएनए का पता लगाने सीमा के आसपास 10-20 एनजी / एमएल डीएनए (चित्रा 5 ब) है। तोड़ के सीरम और प्लाज्मा मुक्त डीएनए का स्तरअल लाख के लिए एनजी / एमएल रोग (कैंसर, प्रणालीगत एक प्रकार का वृक्ष, दौरे संक्रमण) है कि असामान्य नेट गठन के साथ संबद्ध किया गया है में सूचित किया गया। 12-14 यह पता चलता है एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays भी क्षमता है कि मानव नैदानिक ​​नमूनों में नेट quantitate करने में सक्षम हो। एमपीओ-डीएनए और HNE डीएनए एलिसा assays की यह भविष्य आवेदन मात्रात्मक रोग रोगजनन के लिए जाल से जोड़ने के लिए सक्षम हो जाएगा।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-Human Neutrophil Elastase  Rabbit Ab  Calbiochem 481001 1:2,000x coated
Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) Millipore 07-496 1:2,000x coated
DNase-1 Roche 10-104-159-001 1 µg/ml used for digestion
20 mM EGTA/ PBS Sigma-Aldrich E3889-25G
2.5 mM EGTA/PBS Sigma-Aldrich E3889-25G
Cell death detection ELISA Anti-DNA POD Roche 11544675001 1:500x 
Eon Microplate Spectrophotometer Biotek
Gen5 All-in-One microplate software Biotek analytical tool (ELISA)
Sytox orange Life Technology S11368 0.2% final concentration/volume
1 M Hepes Cellgro 25-060-Cl Use 10 mM final concentration.
1 M glucose Sigma Use 5 mM final concentration.
HBSS Corning 21-023-CM
Varioskan Flash Ver.2.4.3 Thermoscientific
PMA Sigma P 8139 100 nM final used
ELISA Plate Greiner bio-one 655061
Conical tubes 15 ml Thermoscientific 339650
Conical tubes 50 ml Thermoscientific 339652
Percoll (pH 8.5-9.5)  Sigma P 1644 Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G
Dextran Spectrum D1004
RPMI 1640 media Corning Cellgro 17-105-CV
96 well assay plate black plate clear bottom Costar 3603

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 112 न्युट्रोफिल कोशिकी जाल नेट granulocytes न्यूट्रोफिल बाह्य डीएनए myeloperoxidase न्यूट्रोफिल elastase quantitation एलिसा उच्च throughput
कोशिकी डीएनए रिलीज के उच्च throughput मापन और मानव न्यूट्रोफिल में मात्रात्मक नेट गठन<em&gt; इन विट्रो</em
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Sil, P., Yoo, D. g., Floyd, M.,… More

Sil, P., Yoo, D. g., Floyd, M., Gingerich, A., Rada, B. High Throughput Measurement of Extracellular DNA Release and Quantitative NET Formation in Human Neutrophils In Vitro. J. Vis. Exp. (112), e52779, doi:10.3791/52779 (2016).

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