Protocol
Georgia Üniversitesi Kurumsal Değerlendirme Kurulu sağlıklı gönüllülere (UGA # 2012-10769-06) periferik kan toplamak için insan konu çalışmayı onayladı. 5,7,8 Gönüllüler kan beraberlik önce gerekli bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı. Bu makalede yapılan araştırmalar Helsinki Bildirgesi'nin insan denekler üzerinde tıbbi araştırmalar için etik kurallarına uygun olduğunu.
Periferik İnsan Kanı adlı Nötrofiller 1. izolasyonu (Şekil 1)
Not: Periferik kan nötrofillerin izole edilmesi için çeşitli yollar vardır. Aşağıdaki protokol, bir imkanı sağlar. Bu protokol, dış uyarım üzerine NET'leri salabilen aktif olmayan, insan nötrofil sayıda verir. 40 ml delme ile sağlıklı gönüllülerden elde edilen tam kan kullanın. 7,9
- iki adet 50 ml konik tüpler içine kısım 20 ml kan. 10 mi% 6 Dekstran ekleyin. hafifçe karıştırın.
- 20 dakika transferi lökosit ric sonratemiz 50 ml'lik konik tüpler içine herhangi peletlenmiş kırmızı kan hücrelerinin alarak ve steril PBS ile doldurmak olmadan h üst faz.
- 400 x g'de 10 dakika santrifüje. 4 ml süspanse pelet PBS steril.
- % 85 5-adım Percoll degrade hazırlayın -80% -75% -70% -65% iki 15 ml konik tüpler ve katman 2 ml lökosit süspansiyonu her degrade üstünde.
- frenler kapalı olarak 30 dakika boyunca Santrifüj 800 xg.
- tüm hücreler% 75 /% 80 tabakalarında (nötrofilleri) ve% 70 /% 75 arayüzü toplayın.
- PBS içinde iki kez (350 xg, 10 dakika, RT) hücre yıkayın ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
Bir Mikroplaka florimetrede Kullanarak Hücre dışı DNA Yayın Kinetiği 2. Ölçüm
Not: Bu yöntem, bir zara-geçirmeyen DNA bağlayıcı 96 oyuklu bir mikro-plaka biçiminde DNA serbest gösterge boya (Şekil 2) arasında floresan değişikliklerin ölçülmesini sağlar.
- + Deney ortamı içinde nötrofil bir süspansiyonu (HBSS hazırlanması2 x 10 6 hücre / ml'lik bir konsantrasyonda,% 1 (h / h) otolog serum + 5 mM glükoz).
- Zarın geçirgenlik göstermediği bir DNA bağlayıcı boya 5 umol / L ekleyin. hafifçe karıştırın.
- Kısım İnsan nötrofilleri (50 ul / oyuk) 96 çukurlu mikrolevhaların siyah şeffaf dibine. Emin deney ortamı kuyunun tüm alt kapsar emin olun. Değilse, yan hafifçe plaka dokunun.
- 37 ° C'de 10 dakika süreyle plaka içeren nötrofillerin ısıtın.
- Bu sırada nihai konsantrasyonlarının iki katı uyaranların çözümler hazırlamak kullanılmak üzere (37 ° C sıcak bir deney ortamı içinde). Pozitif NET kontrolü maksimum NET salınımını tetiklemek için 4 saat boyunca 100 nM forbol-miristat-asetat (PMA) insan nötrofilleri kullanmak spontan NET oluşumu düşük 5,8 kalır. 4 saat boyunca 5,8 PMA uyarımı maksimal NET salınımını sağlar.
- Ölçme (4 saat, 37 ° C, uyarma için 530 nm ve emisyon 590 nm) için mikroplak florimetresi hazırlayın. </ Li>
- 50 ul nötrofil süspansiyonlar 50 ul uyaran çözeltisi ilave edilerek nötrofillerin uyarırlar. Maksimal bir DNA salma sinyalinin ölçülmesi de bir 0.5 ug / ml saponin kullanın.
- okuyucusunda plaka koyun ve hiçbir çalkalanarak her 2 dakikada 4 saat floresan değişiklikleri ölçer.
- Veri analizi için, zamanla floresan normalize artışlar hesaplar.
- Saponin dahil olmak üzere tüm kuyuları için son nokta değerleri çıkarınız, taban floresans (Şekil 2A, B). saponin floresan artış en yüksek sinyal olmalıdır. Bu "olarak maksimum DNA serbest" (Şekil 2A) olarak ifade edilir.
- maksimal DNA salınımı ile bilinmeyen numunelerin floresan artışlar bölerek bilinmeyen örneklerinde DNA sürümü yüzdelerini hesaplayınız.
- Çoğaltır ortalama sonuçları ve "maksimal DNA sürüm%" (Şekil 2C) olarak sunuyoruz.
NET Formu 3. kantitasyonuMPO-DNA ve HNE-DNA ELISA tahlilleri ile tirme
Not: laboratuvarımızda Bu tahliller, modifiye edilmiş (MPO-DNA) ya da kuruldu (HNE-DNA) MPO-DNA ve HNE-DNA kompleksleri seviyeleri ölçülerek NET oluşumu miktarının 5.
- Ceket 96 oyuklu yüksek bağlama gece boyunca antikorlarla (50 ul / kuyucuk) kapasitesi ELISA plakaları: Anti-MPO (1: 2000 seyreltme) ya da anti-HNE (1: 2,000).
- PBS ile yıkayın ELISA plakaları, üç kez (200 ul / oyuk) ve oda sıcaklığında 2 saat süre ile% 5 BSA ve% 0.1 insan serum albümini ile bloke (200 ul / oyuk). PBS ile üç kez yıkanır.
- Tohum 96 oyuklu mikro / göz 100 ul deney ortamı içinde 100,000 hücre yoğunluğunda nötrofiller ve NET oluşumunu uyarır. hücreleri inkübe: 37 ° C 4 saat.
- iyice karıştırın, nötrofil Süpernatantları 2 U / ml DNaz ekleyerek sınırlı DNase sindirim gerçekleştirin. Oda sıcaklığında tutun.
- 11 ul 25 mM EGTA (nihai konsantrasyon 2.5 mM) eklenerek 15 dakika sonra DNase durdurun. İyice karıştırın. SU toplayınTemiz mikrofuj tüpleri içerisinde pernatants. Spin örnekleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre enkaz kurtulmak için. Temiz mikrofuge'de tüpler içine onların süpernatantlar aktarın. hazır olana kadar buz üzerinde saklayın.
- önceden hazırlanmış "NET standart" bir kısım kullanın.
Not: NET standardı en az 5 farklı, bağımsız insan vericilerden elde edilen PMA ile uyarılmış nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer bir karışımıdır.- , Uzun bir süre aynı standart kullanmak toplamak ve her donörden nötrofil süpernatantlar büyük bir ses bölmeyin için. Örneğin PMA ile uyarılan nötrofil DNaz ile sindirilmiş yüzer 2 ml toplama 200 alikotları 200 ELISA plakaları için yeterli (10 ul her) neden olur. NET standart karakterize eden veriler, Şekil 5'de görülmektedir.
- 4 saat boyunca 100 nM PMA insan nötrofilleri uyarır ve DNaz adımları 3,4-3,5 göre kendi süpernatanlanna sindirmek geçerlidir.
- Toplama, havuz alikotu (10 ul) ve serbestze (-20 ° C), nötrofil süpernatanlar.
- en az beş ayrı donörlerden elde edilen bir kısım / donör çözülme, "standart NET" hazırlamak için, bunları karıştırın ve buz üzerinde saklayın.
- çözülmüş örnekleri atın ve bir sonraki deney için taze olanları kullanın.
- PBS + EGTA NET-standart 2 seri seyreltme: 1 hazırlayın.
- DNase1-sindirilmiş örnekleri (standart ve bilinmeyen süpernatantlar) PBS + EGTA içinde 20-kat seyreltilir ve yakalama antikorları ile kaplanmış ELISA plakaları üzerinde bunları kısım.
- 4 ° C'de gece boyunca ELISA inkübe edin ve PBS ile uygun üç kez yıkayın.
- Algılama antikoru solüsyonu halinde (100 ul / oyuk): turp peroksidaz konjuge anti-DNA antikoru (1: 500, fare). Karanlıkta 1 saat süreyle inkübe edin.
- PBS ile dört kez yıkamadan sonra, TMB peroksidazı substrat ekleyin: 100 ul / oyuk, 30 dak. Mavi bir renk peroksidaz aktivitesi (mevcut NET) için bir göstergesidir.
- de 100 ul / 1 M HCI ilave ederek reaksiyonu durdurun.mavi çözümler sarı (Şekil 5A) dönecek.
- bir mikro-fotometre kullanılarak 450 nm'de absorbansı okumak.
- Veri analizi için, NET standardına göre MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri miktarını hesaplayın.
- bütün örneklerden, deney ortamı GEÇMİŞİ optik yoğunluk değeri çıkarın.
- Nispi net içeriği (Y-ekseni) (Şekil 5A) karşı seyreltilmiş standart numunelerin absorbans değerlerine (X-ekseni) çizilir.
- Bu standart eğrinin nonsaturated aralığını kullanarak (Şekil 5A) (kullanılan yazılım en iyi üstel uyum kullanın) bir trend çizgisi kurmak. Bu eğilim çizgisinin denklemi NET'ler miktarda nicel OD değerlerinin dönüşüm belirler.
- NET-standart (Şekil 5A) yüzdesi olarak bilinmeyen numunedeki NET'ler miktarda verecektir 3.13.3 den trend çizgisi denklemi içine bilinmeyenler ölçülen OD değerlerini yerleştirin.
- Hesaplamakçoğaltır (üç kez) ortalamaları ve (Şekil 5C) "MPO-DNA veya HNE-DNA kompleksleri (standardın%) miktarı" olarak son verileri sunmak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu yazıda rakamlar. Nötrofil izolasyon, deneysel prosedürler ve veri analizi açıklama ile mevcut temsilcisi sonuçları yöntemi tarif 1 insan nötrofil hazırlık ardışık adımları göstermektedir. Bu protokol nötrofil izolasyon tek olası yolu temsil eder. Bu stimülasyon üzerine NET'leri salabilen nötrofillerin istirahat büyük miktarda verir. Floresan bazlı DNA salınım testi nasıl çalıştığını 2 gösterileri Şekil. İnsan nötrofil-de 96 mikropleytin takip edilmektedir DNA serbest bir floresan mikroplaka okuyucu kinetik kullanma. Şekil 3 veri analizi her adımını açıklar. İlk olarak, saponin (Şekil 3A) ile muamele nötrofillerde maksimal bir DNA sinyal hesaplar. floresanstaki artışı her zaman en yüksek flüoresans değeri ve arka plan floresans seviyesine (arasındaki fark olarak hesaplanır
Şekil 4A, Şekil 4B, nonstimulated PMA ve PAO1-aktive edilmiş insan nötrofil Örnek immünofloresan görüntüleri gösterir. MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA deneyleri ilkelerini açıklayan şemasını tasvir etmektedir. Hücre dışı DNA, tipik net morfolojisi gösterir ve MPO ve sitrülinlenmiş histon H4 NET formasyonunun bir markör ile birlikte lokalize eder. 6. Şekil 4C Şekil 3b, 3c aynı gibi önceki koşullar altında insan NötrofilisteMPO-DNA ve HNE-DNA serbest (gösterir ve 4B). IThe "net" ELISA yöntemleri, daha önce karakterize edilmiştir. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca 5 Kısaca, 2 U / ml DNAz muamelesi (kullanılan DNase / ml konsantrasyonu 1 ug eşdeğeri), en yüksek MPO-DNA ve HNE-DNA sinyallerinin sonuçlandı ., bir agaroz jeli üzerinde 5 öRNEKLERİ (100 ng / şerit) DNA uzunluğu ortayaAlt KB aralığı verimlerle uygun ELISA sinyali. 5 DNA Overdigestion yakalama ve algılama antikoru, ya ELISA sinyalleri iptal atlanması ya da (DNaz daha yüksek, 20 U / ml doz). 5
Bunlara ek olarak, deneyler ve "Network standardı" tekrar karakterize edilmiştir (Şekil 5A) vardır. NET standart ortalama 19.5 ug / ml hücre dışı (bilinen bir DNA konsantrasyonları ile bir standart kullanılarak ölçülmüştür) DNA, 399 ng / ml MPO ve 103.4 ng / ml HNE (Ticari ELISAkits) aşağıdakileri içermektedir (n = 8). MPO (84 kDa) ve HNE (29.5 kDa) toplam molekül ağırlıkları ve 1 mg DNA 9.91 x 10 14 nükleotid içermektedir gerçeğine dayanarak, NET standardı 109 HNE molekülleri ve 1000 nükleotidler başına 147 MPO molekülleri (kb DNA içeren ). NET-standart iki katlı seri seyreltme deneyleri MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA analizlerde dinamik aralığı arasında olduğunu ortaya koymuştur 19,0-609,0 ng /mi DNA konsantrasyonları (Şekil 5B). Daha yüksek 1.024 misli seyreltmeleri, arka (Şekil 5B) farklı değildi, oysa NET standart 32-kat daha düşük seyreltileri doyma sonuçlandı. Proteaz inhibitörleri ile NET standart tedavisi proteazlar bu tahlillerde (Şekil 5C) karışmaz belirten MPO-DNA ve HNE-DNA analizleri ile elde edilen sonuçlarını değişmedi. Böylece, sonuçlar kuvvetle birbirine (Şekil 5D) ile korelasyon Tahliller MPO-DNA veya HNE-DNA ELISA ile aynı NET standart numunede elde edilmiştir. etkinlik kaybı olmadan dondurulmuştur PMN süpernatanlar, aynı zamanda, bu deneylerde kullanılabileceğini göstermek için, NET standart tedavi edilmediği veya diğerleri -20 ° C ya da yapılan bir ya da iki donma / erime döngüsüne maruz bırakıldı, -80 ° C'de bazı alikotları (1 saat aralığı). Donma / çözülme tedavilerin hiçbiri MPO-DNA veya HNE-DNA sonuçlarını (Şekil 5E) etkilemiştir. Özet olarak,NET standart bağımsız deneyler arasındaki NET sonuçların kantitatif karşılaştırılmasına imkan vererek bu NET-niceleme deneyleri güvenilir bir referans noktası sağlar.
Şekil 1:., Insan nötrofillerinden nötrofil granülositler izolasyonu tarif edilen protokol uyarınca gönüllülerin periferal kanından izole edilmiştir. Kan antikoagülan içeren dekstran sedimantasyonu ve gradyan santrifüj ile nötrofilleri izole etmek için kullanılmıştır. Pıhtılaşma önleyici içermeyen sadece kan serum hazırlamak için kullanıldı. nötrofil preparatlar canlılığı, tripan mavi dışlama deneyi ile değerlendirilmiştir. Nötrofil saflık Sitospin tarafından değerlendirilecek veya flow sitometri edilir (CD16, çift pozitif hücreler CD66abcd). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Hücre dışı DNA, serbest bırakma-Assay esasları (a) Floresans yalnızca, Plazma ve çekirdek zarları ihlal edilmiş ve membran geçirmeyen DNA bağlama boyası da DNA'da bağlanabilen nötrofiller ile elde edilir. (B) tahlili bir mikro florimetre kullanılarak mikro 96 gözlü siyah gerçekleştirilir. (C) florimetre her bir gerçek zamanlı flüoresan eğrileri kaydeder. Gösterilen bir temsilcisi sonuçları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: DNA Yayın Verilerin Analizi (.
Şekil 4: MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA Tahlilleri:. İlke ve Temsilcisi Sonuçlar (A) Şema açıklamaking kadar MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA deneyleri çalışır. (B) 100 nM PMA veya P. maruz kalan insan nötrofiller hazırlanan immünofloresan görüntüleri Temsilcisi sonuçları aeruginosa PAO1 suşu 4 saat (10 İB). Ekstrasellüler DNA (DAPI, mavi) MPO (yeşil) ve sitrülinlenmiş histon H4 (kırmızı) ile NET'ler co-lokalize. Bir temsili bir sonuç, n = 3 (c) Net salma MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA testleri aracılığı ile yukarıdaki ile aynı uyaranlara maruz kalan insan nötrofillerinde ölçülmüştür. Ortalama ± SEM, n = 3 , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5:. "Net standart" (A) seri dilüsyonları karakterizasyonu (1: 2) NET standart hazırlandıve MPO-DNA ELISA tabi tutulmuştur. Ölçülen OD değerleri NET standart içerik% karşı grafiğe dökülmektedir. Kırmızı bir "X" bilinmeyen numune ölçülmüş bir OD değeri gösterir. Gri ok bilinmeyen numunenin "NET konsantrasyonu" (mavi "X") takılmış standart eğrinin orta aralığı kullanılarak belirlenecek nasıl gösterir. Seri olarak seyreltilmiş NET standart örneklerde (B) DNA konsantrasyonları belirlenmiştir ve MPO-DNA ya da HNE-DNA ELISA deneyleri, ölçülmüş OD değerlerine karşı grafiğe geçirildi. Gri Alanı deneylerinde dinamik aralığı gösterir. (C) Proteaz inhibitörü tedavisi (proteaz inhibitörü kokteyli,% 1) MPO-DNA veya HNE-DNA deneyleri (NET standart) sonucunu etkilemez. , Ortalama ± SEM n = MPO-DNA ve seri dinamik aralıkları (5B bakınız) içinde "NET standart" örnekleri seyreltilmiş HNE-DNA sonuçları (OD 450 nm) 2. (D) Korelasyon. (E) dondurma ve çözme döngüleri (-20 ° C veya -80 ° C; o) ne ya da iki n = 2)., MPO-DNA ve HNE-DNA deneyleri (NET-standardın sonuçlarını etkileyebilir ± SEM gelmez bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
NET'ler NET'ler edebiyat sürekli, biyoloji, mekanizma ve yönetmelik rollerine ilişkin birkaç önemli soru belirsizliğini koruyor onların keşfinden bu yana geçen on yıllar içinde genişleyen olmasına rağmen patojenleri öldürmek. 1 nötrofil hangi büyüleyici yeni bir mekanizma temsil etmektedir. Uygun metodoloji NET'leri, bu çok benzersiz antimikrobiyal mekanizma ölçmek için geliştirilmiş olmalıdır. Bu makalede, bir yüksek verimli bir şekilde netler ölçmek için kullanılan yöntemler açıklanmaktadır. İlk deney bir membran geçirimsiz DNA bağlanma boyanın flüoresan kinetiklerini izler. Bu tahlil yamaç ve nötrofiller DNA salınımı hızına büyük miktarda bilgi sağlar. Bu bilgiler NET oluşumuna yol açan erken sinyal olaylarını okuyan soruşturmalarda çok önemlidir. Tüm bu bilgiler inkübasyonun sonunda DNA, salınımının ölçülmesi uç deneylerinde kaybolur. Hücre dışı DNA boya bazlı analiz NET'ler için spesifik değildir. OSadece DNA serbest ölçer. NET'leri doğrulamak için, yaygın NET oluşturan nötrofiller üzerinde immünofloresan gerçekleştirmek ve granül belirteçleri (MPO, HNE) ya da histon biriyle DNA'nın eş-lokalizasyon göstermek için kabul edilir. immünofloresan verilerinin kantitasyonu olsa çok sıkıcı ve subjektiftir.
Burada, MPO-DNA kompleksleri tespit önceden gelişmiş ELISA tahlilinin bir geliştirmesi verilmektedir. Özel net ölçüde içermesi benzer bir ELISA deneyi ölçüm HNE-DNA kompleksleri de tarif edilmektedir. 3,5 Her iki testte de detaylı olarak karakterize edilmiştir. 5 MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA deneyleri, aynı zamanda, belirli NET-nicel ve vardır . 5 Bu özellikler herhangi bir diğer cari yöntemle yerine getirilmemesi. Analizler gerçekleştirmek ve tekrarlanabilir veri sağlamak kolaydır. Doğrudan nötrofiller üzerinde NET'ler hızlı ve standardize kullanım sağlar sınırlı DNaz sindirim adım dahildir 5. 5 Bu tahliller com uygundurAynı anda birkaç örnek pare. Yeni, kontrol ölçümlerinde bu donma / çözülme döngüleri gösterilir ve proteazlar MPO-DNA ve HNE-DNA testlerinin sonucunu etkilemez. Bilinen protein, bu analizlere müdahalede 1,11 (histon ve IL-37 de dahil olmak üzere) ağları DNA'ya bağlamak için olsun, ancak, bilinmemektedir.
sunulan protokollerin kritik adımlar şunlardır. Dinlenme, hareketsiz bir durumda olan ve kendiliğinden NET'ler büyük miktarda serbest olmayan nötrofilleri hasat önemlidir. sunulmuştur nötrofil izolasyon protokolü kırmızı kan hücreleri çıkarmak için, bir hipotonik lizis aşamasının eksikliği olmayan aktifleştirilmiş nötrofillerin elde edilmesi için çok önemlidir. Hücreler saflaştırılmıştır edildikten sonra nötrofil aktivasyonunu inhibe etmek için, donör kendi serum ihtiva eden bir ortam içinde tekrar süspansiyon nötrofilleri de önemlidir. durgun hücreleri elde etmek için aynı zamanda nötrofil hazırlanması sırasında pyrogen- ve kirlilik içermeyen reaktifler kullanmak için çok önemlidir. SpontaHücre dışı DNA bırakma deneyi sırasında nötrofillerin neous NET sürümü de olabilirdi. Deney ortamında% 1 otolog serum ekleme önlemek için önemlidir. otolog serum daha yüksek veya daha düşük dozların uygun sonuçlar elde etmek için test edilebilir. Bu DNaz ile sindirilmiş aşırı sinyalin tam kaybına neden olur, çünkü DNA, olmamalıdır serbest MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA deneyleri sırasında kritik öneme sahiptir. Bu nedenle, optimal doz her yeni DNase parti için belirlenmelidir. DNA sindirim parametreleri biraz yüksek ELISA mümkün sinyalleri elde etmek için değiştirilebilir. Aynı zamanda DNaz DNA açık erişime sahip olmasını sağlamak için DNaz ve iyice karıştırın NET'leri önemlidir. sindirilmiş NET'leri hasat, tüm NET'leri toplamak için yoğun kuyu yıkayın.
MPO-DNA ve HNE-DNA tahlilleri DNA saptama limiti yaklaşık 10-20 ng / ml DNA (Şekil 5B) 'dir. sever Serum ve plazma serbest DNA seviyelerial yüz bin ng / ml, anormal NET oluşumu ile bağlantılı olan hastalıklar (kanser, sistemik lupus eritematozus, miyokardiyal enfeksiyon) rapor edilmiştir. 12-14 MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA deneyleri, aynı zamanda bir potansiyele sahip olduğunu göstermektedir insan klinik örneklerinde netler ölçmek mümkün. MPO-DNA ve HNE-DNA ELISA testlerinin Bu, gelecekteki uygulama nicel hastalık patogenezine NET'leri bağlantı sağlayacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anti-Human Neutrophil Elastase Rabbit Ab | Calbiochem | 481001 | 1:2,000x coated |
| Anti-Myeloperoxidase Ab (Rabbit) | Millipore | 07-496 | 1:2,000x coated |
| DNase-1 | Roche | 10-104-159-001 | 1 µg/ml used for digestion |
| 20 mM EGTA/ PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| 2.5 mM EGTA/PBS | Sigma-Aldrich | E3889-25G | |
| Cell death detection ELISA Anti-DNA POD | Roche | 11544675001 | 1:500x |
| Eon Microplate Spectrophotometer | Biotek | ||
| Gen5 All-in-One microplate software | Biotek | analytical tool (ELISA) | |
| Sytox orange | Life Technology | S11368 | 0.2% final concentration/volume |
| 1 M Hepes | Cellgro | 25-060-Cl | Use 10 mM final concentration. |
| 1 M glucose | Sigma | Use 5 mM final concentration. | |
| HBSS | Corning | 21-023-CM | |
| Varioskan Flash Ver.2.4.3 | Thermoscientific | ||
| PMA | Sigma | P 8139 | 100 nM final used |
| ELISA Plate | Greiner bio-one | 655061 | |
| Conical tubes 15 ml | Thermoscientific | 339650 | |
| Conical tubes 50 ml | Thermoscientific | 339652 | |
| Percoll (pH 8.5-9.5) | Sigma | P 1644 | Sodium Chloride, Sigma, S7653-250G |
| Dextran | Spectrum | D1004 | |
| RPMI 1640 media | Corning Cellgro | 17-105-CV | |
| 96 well assay plate black plate clear bottom | Costar | 3603 |
References
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303, 1532-1535 (2004).
- Fuchs, T. A., et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps. J Cell Biol. 176, 231-241 (2007).
- Kessenbrock, K., et al. Netting neutrophils in autoimmune small-vessel vasculitis. Nat Med. 15, 623-625 (2009).
- Leffler, J., et al. Degradation of neutrophil extracellular traps co-varies with disease activity in patients with systemic lupus erythematosus. Arthritis Res Ther. 15, R34 (2013).
- Yoo, D. G., Floyd, M., Winn, M., Moskowitz, S. M., Rada, B. NET formation induced by Pseudomonas aeruginosa cystic fibrosis isolates measured as release of myeloperoxidase-DNA and neutrophil elastase-DNA complexes. Immunol Lett. 160, 186-194 (2014).
- Wang, Y., et al. Histone hypercitrullination mediates chromatin decondensation and neutrophil extracellular trap formation. J Cell Biol. 184, 205-213 (2009).
- Pang, L., Hayes, C. P., Buac, K., Yoo, D. G., Rada, B. Pseudogout-associated inflammatory calcium pyrophosphate dihydrate microcrystals induce formation of neutrophil extracellular traps. J Immunol. 190, 6488-6500 (2013).
- Yoo, D. G., et al. Release of cystic fibrosis airway inflammatory markers from Pseudomonas aeruginosa-stimulated human neutrophils involves NADPH oxidase-dependent extracellular DNA trap formation. J. Immunol. 192, 4728-4738 (2014).
- Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed,, Goosmann, U., Zychlinsky, C., A, Neutrophil extracellular traps, how to generate and visualize them. J. Vis. Exp. , (2010).
- Rada, B., et al. Pyocyanin-enhanced neutrophil extracellular trap formation requires the NADPH oxidase. PLoS One. 8, e54205 (2013).
- Neumann, A., et al. The antimicrobial peptide LL-37 facilitates the formation of neutrophil extracellular traps. Biochem J. 464, 3-11 (2014).
- Leon, S. A., Shapiro, B., Sklaroff, D. M., Yaros, M. J. Free DNA in the serum of cancer patients and the effect of therapy. Cancer Res. 37, 646-650 (1977).
- Raptis, L., Menard, H. A. Quantitation and characterization of plasma DNA in normals and patients with systemic lupus erythematosus. J Clin Invest. 66, 1391-1399 (1980).
- Chang, C. P., et al. Elevated cell-free serum DNA detected in patients with myocardial infarction. Clin Chim Acta. 327, 95-101 (2003).
