Introduction
Den gränslösa Arthrobacter arter i markmiljöer erbjuder ett stort antal och mångfald av fager som kan isoleras från denna art av värdbakterier. Bakterie medlemmar av Acintobacteriaceae familjen är mest känd för sina katabola vägar förnedrande motsträviga föreningar som atrazin och diverse andra bekämpningsmedel och herbicider 1,2,3. Även om de flesta forskning har gjorts med hjälp av miljö stammar av Arthrobacter, är kliniska isolat av detta släkte som finns i blod, urin, ögon, och många andra mänskliga källor alla visar fylogenetiskt heterogenitet 4.
Medan det finns en ganska omfattande mängd forskning på Arthrobacter bakterier, bara ett fåtal studier rapportera om fager som kan infektera medlemmar av denna skiftande släkte. Intressant dock, arbete tidigare på Arthrobacter fagerna handen på flera viktiga distinkta ämnen såsom typning av jord <em> Arthrobacter arter 5, industriellt bruk med syfte att minska skadlig skum i aktiverade slamanläggningar 6, och arbetet belyser platsspecifik rekombination och gras gener 7.
Olika protokoll anrikningsteknik har använts för att generera ren fagisolat i Arthrobacter art. Tidiga förfaranden inkluderar inkubationer av jord med tillsats giftiga ämnen som nikotin salter för perioder på mer än ett år 8 ger upphov till fager kan endast infektera A. globiformis. Studier som gjorts med hjälp av jord percolated med labila organiska verkade producera detekterbara fager via plack analystekniker, utelämnar långa inkubationstid 8. Intressant dock, var en teknik som liknar direkt plätering använts tidigare gett upphov till flera fager samtidigt ha ett särskilt låg framgång av utredarna 5, citerar tidigare studier med låga svarsfrekvensen Sammantaget isoleringstekniker som används i det förflutna var noterbar för att ha lite effekt i praktiken trots Arthrobacter släktet representerar den vanligaste aeroba jord isolerar i naturen 4,9, Van Twest och Kropinski 10 nuvarande metoder anriknings för isolering fager från vatten och jord anpassat från tidigare tekniker som används för att berika miljön bakterieisolat men dessa anrikningsmetoder visat ineffektiva isolera Arthrobacter fager. Syftet med den metod som beskrivs här är att visa "proof of concept" att de tidiga metoderna anriknings kan anpassas till ett konsekvent och effektivt isolera Arthrobacter fager, vinna tidigare tekniska utmaningar som är förknippade med att isolera fager från denna bakterie släkte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning av Arthobacter Celler för Fag Isolering
- Kultur Arthrobacter sp. KY3901 kolonier ströks ut på en Luria Bertaini (LB) agarplatta inkuberades vid 30 ° C under 2-3 dagar. Välj en koloni och använda en steril ögla för att lägga till den i 250 ml LB buljong i en baffelförsett odlingsflaska och inkubera i en skakande inkubator vid 225 rpm vid 30 ° C.
- Låt ca 24 h av tillväxten för att få sena exponentiella / tidig stationära celler för fag infektion experiment. Övervaka tillståndet för bakterietillväxt, för att undvika celler från att komma in i mitten till slutet av stationära tillväxttillstånd.
OBS: Celltillväxt bör bestå av en optisk densitet OD 600 mellan 0,5-.0.7 för fag isolerings- och reningsförfaranden / steg som beskrivs nedan.
2. Insamling av Fag från jordprover
- Samla 200-400 g jord från önskad plats. OBS: Eftersom bakterier i Arthrobacter släktet är vanliga jordbakterier de och fagerna som infekterar dem kan hittas i och är genomträngande i de flesta typer av jord.
- Lägg minst 400 ml Fag Buffer (PB) [68 mM NaCl, 10 mM MgSO 4, 10 mM Tris-CL (pH 7,5)] till jorden och blanda i en tillräckligt stor kolv så att minst 200 ml PB är i supernatanten och kan utvinnas.
- Blanda genom att försiktigt röra eller virvlande tills jorden är upphängd och låta jorden sediment att bosätta, vanligtvis 30 min.
- Passera "jordextrakt" genom filterpapper genom gravitation filtrering för att avlägsna jord sediment skräp.
- Lägg LB pulver och blanda för att göra en 2% lösning (4 g LB pulver i 200 ml jordextrakt).
- Passera lösningen genom ett 0,22 pm filter genom vakuumfiltrering för erhållande av en steril filtrat. Om möjligt, fortsätt till steg 2,7 omedelbart. Om det behövs, lagra filtrerade prover vid 4 ° C i upp till en vecka innan du fortsätter dock antalet viabla fagpartiklarkommer att minskas.
- Alikvot multipel 50 ml portioner av den filtersteriliserade LB / jordextrakt blandning till individuella 250 ml sterilt skakning bafflade odlingsflaskor med användning av aseptiska tekniker. Lägg steril 2,0 M CaCl2-lösning till den slutliga önskade koncentrationerna (0-50 mM) eftersom olika Arthrobacter fager växa optimalt under olika CaCl2 villkor.
OBS: Vi finner att majoriteten av Arthrobacter fager identifieras av oss är inom intervallet 1 mM-2,5 mM CaCl2. Emellertid flera av de isolerade fagerna växte med oss exklusivt på 0 mM CaCl2 .eller vid mycket höga CaCl 2 koncentrationer. Fortsätt omedelbart till steg 3.1.
3. Fag Isolering
- Lägg 1-2,5 ml sena exponentiella / tidig stationär fas bakteriekultur till vardera av kolvarna. För en OD 600 0,5-0,7, använd 1 ml celler. För en OD 600 högre än en OD på 0,7 använder 2,5 mlceller.
OBS: Celler i exponentiell tillväxtfas ger oftast fler fager och högre titrar än celler i stationär tillväxtfas. - Skakkolvar vid 250 rpm vid 30 ° C under cirka 24 h i en skakinkubator.
- Efter en 24 timmars inkubationstid bort anriknings kolvar från skakinkubator och späd anriknings proverna tiofaldig i fagbuffert.
- Konfigurera odlingsrör med 0,5 ml sena exponentiella / tidig stationär fas bakteriekultur och lägga till olika mängder av anrikningskulturen (5 | il till 500 ^ il av en 10 -1 utspädning i PB) till odlingsrören.
OBS: Det är lämpligt att testa en mängd olika koncentrationer eftersom varje jordprov genererar olika fag titrar efter anrikning. - Lägg CaCl2 till odlingsrör att göra en slutlig koncentration lika med koncentrationen för den ursprungliga anrikning kolven. Använd en rad olika CaCl 2 koncentrationer att välja för många fager wed varierande CaCl 2 beroenden.
OBS: De flesta fager kommer att isoleras inom CaCl2 intervallet 1-2,5 mM men det finns fager isolerade mest optimalt någonstans 0-50 mM CaCl2 koncentrationer. På grund av detta är det bäst att kontrollera en rad CaCl 2 koncentrationer för att maximera antalet unika isolerade Arthrobacter fager. - Blanda 4,5 ml LB toppagar i odlingsröret och häll ut blandningen på en LB-agarplatta. Snurra försiktigt för att fördela över plattan jämnt och möjliggöra toppagar att stelna i ca 15 min.
OBS: toppagar kan framställas i större satser (250 ml) och extra toppagar kan förvaras vid rumstemperatur och återanvändas för efterföljande experiment under minst två veckor. Även om det finns olika formler som används för att göra topp agar, vi gör toppagar använder 7 g / L agar blandat med LB. Placera toppen agar i en 60 ° C vattenbad för att hålla kvar flytande tillstånd under ett experiment. - Invertera than plattan och inkubera vid önskad temperatur (temperatur till 30 ° C) O / N till 48 h. Variera dessa villkor för att optimera för fager närvarande. Mest isolerade fager kommer från plattor inkuberade vid 30 ° C vid 1-2,5 mM CaCl2 koncentrationen efter en 24 timmars inkubationstid.
4. Fag Rening
- Efter en 24 timmars inkubering check för plackbildning på plattor. Fortsätt inkubation under upp till 72 h om inga plack är uppenbara eller att fastställa om ytterligare plack visas. Om det behövs, lagra plattor med förmodade plack för upp till en vecka vid 4 ° C före du fortsätter.
OBS: Det är inte ovanligt att hitta en mängd olika plack morfologier på en plåt. Att hitta plack efter 3 dagars inkubation är möjlig men sällsynt. - Rena önskade fager från tydligt isolerade plack som använder strimma plackmetoden. Tryck på en plakett med en steril träpinne. Streak placken genom att köra en träpinne genom en låga, allowing pinnen svalna helt kort, och sedan gnugga pinnen på agarplatta i mjuk rörelse som visas i figur 1. Upprepa detta med en ren pinne för varje pass.
- Alternativt kan du använda den traditionella plack titer analys för att isolera enskilda fagplacker. På skylten titer analysen kräver användning av flera reagens såsom LB-agar och LB toppagar och material såsom petriskålar för fag plack isolering. Vi har varit mycket framgångsrika med hjälp av strimma plack metoden men det är tekniskt lättare att isolera enskilda plack använder plack titer analysen.
- När LB-agarplatta stryks minst tre gånger, markera området med den lägsta koncentrationen av förmodade fagpartiklar och försiktigt tillämpa 0,5 ml Arthrobacter och 4,5 ml smält LB-toppagar (innehållande samma koncentration av kalciumklorid som moderplattan ) och låt den spridas jämnt över plattan.
- Vänd och inkubera plattan O / N. Upprepa strimma plackteknik för minst tre iterationer för att säkerställa en ren fag arter isoleras. Förvara plattorna vid 4 ° C i upp till en vecka efter behov mellan streck utan betydande förlust av fag livskraft.
- När önskade plack har odlats och isolerat på den sista strimma plattan trycker man väl isolerade plack med en mikropipett spets och slamma i 100 pl PB. Seriellt späda ut 10 0 lösning ut till 10 -8 späd genom att passera 20 ìl av provet i 180 pl färsk PB.
- Lägg 10 pl av varje spädning till 0,5 ml odlas Arthrobacter i ett odlingsrör under 5 till 10 min vid RT och plattan genom att blanda de infekterade bakterierna med 4,5 ml smält LB-toppagar innehållande samma koncentration av CaCl 2 användes för att isolera fag från den ursprungliga jordprovet. Spara alla spädningar som gjorts vid 4 ° C tills nästa dag.
- Bestäm fag seriespäd behövs för att göra en webb mönster med hjälp av traditionella plack titer somsäga. Syftet med plack titer-analysen är att bestämma fag-titer som krävs för att erhålla en bana mönsterplatta. Identifiera en webbmönsterplatta som oftast saknar bakterier men innehåller rester av bakterier som ännu inte har lyserade av fager. Tillsätt 5 ml sena exponentiella / tidiga stationära Arthrobacter kulturen till en steril 50 ml odlingskolv.
- Lägg 100 pl av utspädning (som gav en bana mönster till Arthrobacter kultur) i odlingskolven och tillåta fagerna för att infektera bakteriecellerna under 5 till 10 min vid RT. Blanda med smält LB-toppagar innehållande samma koncentration av CaCl2 som användes för att initialt identifiera fag och plattan 5 ml av denna blandning på 10 färska LB-plattor. Låt stelna och inkubera inverterade plattorna vid 30 ° C.
- Nästa dag översvämma webbmönsterplattor med 5 ml PB och lagra O / N vid 4 ° C eller 4 timmar vid RT.
- Filtrera faglysat genom ett 0,22 fim sprutfilteroch förvara vid 4 ° C. Använd denna slutliga fag lager för ytterligare experiment såsom elektronmikroskopiska bilder på fagpartiklar, fag genomisk DNA-isolering för DNA-restriktionsenzymanalys och genomisk sekvensering med användning av standardförfaranden. För långtidslagring av fagförråd, tillsätt en lika mängd av faglysat till steril glycerol i små flaskor för stock arkivering vid -80 ° C.
OBS: För de som inte upplevt med dessa fag tekniker, är en stor resurs online åtkomliga www.phagesdb.org hemsida.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För att demonstrera reproducerbarhet förbättrade anrikningsteknik för Arthrobacter fager, var 30 olika jordprover som används vid olika tider och platser under våren och sommaren 2014. Av dessa 30 jordprover unika Arthrobacter fager erhölls från 22 av insamlade jordprover med hjälp av denna anrikning förfarande. Standard anrikning Proceduren gav unika fager från tre av samma jordprover. Anrikningsprover kan ha en mycket hög fag titer behöver initial utspädning för att isolera plack eller en relativt låg fag titer kräver en större volym berikad Arthrobacter för framgångsrik detektering av plack. Vi använder den plack strimma metod för att isolera rena fag-populationer efter initial anrikning och utstrykning på LB-agar (Figur 2). Alternativt kan en traditionell standardplack titer analys användas för att isolera en ren fag isolat men denna metod tar mer tid, reagenser och materials. Som tidigare nämnts, använder vi plack titer analys för att empiriskt bestämma fag titer nummer och antalet plackbildande enheter (PFU) för att bilda en sadelgjord mönster på en tallrik. Figur 3 visar en uppsättning seriespäd för fag Banan och demonstrerar för en av plattorna vad en bra webb mönstret ska se ut. Figur 4 visar elektronmikrofotografiska av 20 Arthrobacter fager isolerade använder anrikningsteknik. Av de 25 fager närvarande isolerade, 23 av dem är siphoviruses med ganska långa svansar. Två av de isolerade fager är myoviruses innehåller huvuddiameter liknande i längd till det av deras svansar.
Figur 1. Serieplatta teknik schema som används för isolering av enskilda fagplacker. Den gula stjärnan representerar området på plattan att LBtoppagar plus bakterier lösningen bör hälldes försiktigt på plattan efter fag plack strimmor har avslutats.
Figur 2. Exempel på strimman plattteknik som används för isolering av plack för en fag (Dylan) vid tre olika temperaturer. Notera att fag Dylan producerar liknande plack vid RT, 30 ° C och 37 ° C. De röda cirklar på två av plattorna omger tydligt isolerade plack.
Figur 3. Plack titer analys. Arthrobacter fag Banana var serie utspädd i PB och ströks ut på agarplattor som beskrivs i avsnitt 4.6 & 4.7 i protokollet Text. Visade är seriespäd T-4 till T-8 (från toppen). Observera att the T-5 spädning (från botten till toppen) gav en bana mönster med bara en liten mängd av bakteriemattan fortfarande kvar. Lägre serieutspädningar (T-1 till T-3) skapade tydliga plattor med alla bakterier lyserade av fagpartiklar påvisas genom avsaknaden av bakterietillväxt.
Figur 4. Elektronmikrofotografiska av 20 Arthrobacter fager isoleras med hjälp av anrikningsteknik. Bilderna togs med hjälp av en FEI Morgagni TEM. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots många tidigare försök att isolera fager som kan infektera Arthrobacter värdar, vi hade lite framgång med hjälp av standardprocedurer anriknings. Den gener metoden för bakteriell anrikning utvecklas och anpassas av van Twest och Kropinski 10 att berika fager från miljöprover fortfarande grunden för majoriteten av anriknings förfaranden. Bevis från tidigare studier tyder på att metoderna för direkta bordläggningen har producerat detekterbara plack på stammar av Arthrobacter om än med mycket låga svarsfrekvensen av isolering 5. Med den direkta beläggningsmetoden, är fager heras från jordprov i en fag-buffert och filtrerades för att avlägsna kontaminerande bakterier. Det filtrerade extraktet innehållande fagpartiklar tillsätts till den önskade bakterievärd att tillåta värdcellinfektion och ströks utan ytterligare omgångar av bakterietillväxt och fag-amplifiering.
Vår anrikningsteknik är robust och opoptimerat för relativt lätt isolering av Arthrobacter fager från Arthrobacter sp. KY3901. Med traditionella anrikningsförfaranden, fager, tillsammans med många olika typer av bakterier som finns i jordproverna, utvinns ur marken i fag buffert och läggs till frisk tillväxt media med önskade bakterieceller används som värd för faginfektion. Med anrikningsmetoden, är alla jordbakterier avlägsnas från jorden extraherade fag prover genom filtrering genom ett 0,22 pm filter. De sterila filtrerade lysat innehållande fagpartiklar, men inte jordbakterier, späds ut i 2x LB buljong med de önskade bakterier som används som fag förökning värd. Den största skillnaden mellan vårt anrikningsförfarande och andra är att det finns inga kontaminerande jordbakterier som konkurrerar om tillväxt med värdbakterier under anriknings inkubationstiden perioden. Den enda värd marken extraherade fagen kan infektera är att av de önskade värdbakterier och därför MaximiZES tillväxtpotential värdbakterier och förstärkning av de önskade värdspecifika fager.
I utvecklingen av det förfarande som beskrivs här försökte vi att redogöra för selektiv partiskhet inneboende i varje förfarande anrikning genom att testa en rad CaCl 2 koncentrationer 11. Vad blev uppenbart är att vissa fag isolat visar fysiologiska skillnader beroende på parametrar som kalciumjonkoncentration och temperatur. För framtida Arthrobacter fag isoleringar vi planerar att testa nyckelfaktorer som gillar pH, temperatur, salthalt, näringsämnen, tvåvärda metalljoner för att isolera fager som återger i sina värdar optimalt under olika miljöförhållanden.
Vi använder nyligen vuxit Arthrobacter celler i detta experiment. Vi använder inte celler som når mitten till sent stationära tillväxtfasen eftersom vi har haft svårt att isolera fag eller har anständiga titrar med kända fager på thär tillväxtperiod. Andra har visat en hämning av faginfektion i stationär fas Achromobacter celler 12 som kan förklara bristen på framgång isolera fager använder bakterieceller i mitten till slutet av stationär fas av tillväxt. Vi har haft framgång med hjälp av kulturer för dessa experiment med en celltäthet allt från en OD6 00 0,5 till 0,9. Grown kulturer lagrades vid 4 ° C och kan användas för fag isolering upp till sju dagar. Emellertid är ju längre Arthrobacter cellerna lagras vid 4 ° C desto lägre titer och bristningsstorlek av infektiösa fagpartiklar. Liknande resultat har erhållits med användning av Escherichia coli för infektionen av phageT4 13. Därför använder bakterieceller så snart som möjligt efter att de når den önskade tillväxten maximerar chanserna att få ett nytt fag från ett jordprov.
I stort sett användningen av denna anrikning teknik med LB medier bör visa sig vara knapptexklusiva för isolering av Arthrobacter fager. Medan LB har varit branschstandard för odling E. coli-stammar och andra medlemmar av Enterobacteriaceae, stöder tillväxten av en mängd olika bakterier i aeroba förhållanden 14. Den näringsrika sammansättning LB medier kan troligen användas i denna metod för att propagera fager i en otroligt skiftande grupp av aeroba bakterier förhindrar tekniska utmaningar från hindrar fag upptäckt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Finansieringen av utvecklingen av detta protokoll lämnades av Southeastern Pennsylvania Consortium högskole- och Cabrini College Science Department. Ytterligare medel och stöd kom från Arcadia University och Immaculata University. Vi tackar särskilt Dr Karen Snetselaar vid St. Joseph University för vänligt ta elektronmikroskopiska bilder av våra isolerade fager. Ytterligare stöd kom från de Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance Fag Hunters kunna främja Genomics och evolutionsvetenskap (SEA-fager) program.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB Broth powder | Fisher | BP9722-2 | It's best to order these in bulk. |
| Granulated Agar | Fisher | BP1423-2 | It's best to order these in bulk. |
| 0.22 um syringe filters | Fisher | 09-719A | |
| 0.22 um buchner filters | Fisher | 430320 | More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube. |
| Eppendorf Tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 5 ml pipets individual | Fisher | 13-678-11D | |
| 50 ml conical tubes | Fisher | 76002844 | |
| 15 ml conical tubes | Fisher | 76002845 | |
| 10 ml pipets individual | Fisher | 13-676-10J | |
| 25 ml pipets individual | Fisher | 13-676-10K | |
| Whatman qualitative filter paper | Fisher | 1001-824 |
References
- Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189 (3), 674-682 (2007).
- Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
- Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
- Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46 (9), 2980-2986 (2008).
- Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35 (1), 185-191 (1978).
- Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77 (21), 7864-7867 (2011).
- Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178 (7), 1996-2004 (1996).
- Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28 (6), 951-959 (1974).
- Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12 (5), 1031-1033 (1973).
- Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
- Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26 (4), 755-766 (1997).
- Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41 (2), 265-272 (1978).
- Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
- MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. , Available from: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli (2013).
