Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

تقنية التخصيب الأمثل للعزل doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

في كل مكان من الأنواع الفصلاء في بيئات التربة يقدم عدد كبير وتنوع فاجات قابلة للعزل من هذه الأنواع من البكتيريا المضيف. أعضاء البكتيري للأسرة Acintobacteriaceae هم أبرز لمسارات تقويضي بهم من تدهور مركبات المتمردة مثل الأترازين ومختلف المبيدات الحشرية ومبيدات الأعشاب الأخرى 1،2،3. على الرغم وقد تم ذلك معظم الأبحاث باستخدام سلالات البيئية للالفصلاء، العزلات السريرية لهذا جنس وجدت في الدم والبول، والعيون، والعديد من المصادر البشرية الأخرى عن عرض التجانس النشوء والتطور 4.

في حين أن هناك مجموعة واسعة بدلا من البحث عن البكتيريا الفصلاء، فقط تقرير عدد قليل من الدراسات على فاجات القادرة على إصابة أفراد هذا الجنس المتنوع. على الرغم من المثير للاهتمام، العمل المنجز سابقا على الفصلاء فاجات اللمسات على عدة مواضيع رئيسية متميزة مثل الكتابة التربة <م> الأنواع الفصلاء والاستخدامات الصناعية بهدف الحد من رغوة الضارة في محطات معالجة الحمأة المنشطة والعمل تسليط الضوء على إعادة التركيب محدد الموقع والجينات إنزيم مدمج 7.

وقد استخدمت مختلف البروتوكولات تقنية تخصيب اليورانيوم لتوليد نقية فج يعزل في الأنواع الفصلاء. وتشمل الإجراءات المبكرة حضانات من التربة مع المواد السامة المضافة مثل الأملاح النيكوتين لفترات تزيد على سنة واحدة 8 مما أدى إلى فاجات القادرة على إصابة فقط A. globiformis. يسيل دراسات أجريت باستخدام التربة مع ظهرت العضوية عطوب لإنتاج فاجات اكتشافها عن طريق تقنيات فحص اللوحة، وحذف فترات حضانة طويلة 8. على الرغم من المثير للاهتمام، تم استخدام تقنية تشبه الطلاء المباشر في الماضي مما أدى إلى عدة فاجات في حين لا تزال تواجه نسبة نجاح منخفضة وخاصة من قبل المحققين نقلا عن الدراسات السابقة مع معدلات النجاح منخفضة

وعموما، كانت تقنيات عزل استخدمت في الماضي بارزة لديها فعالية كبيرة في الممارسة على الرغم من جنس الفصلاء تمثل التربة الهوائية الأكثر شيوعا عزل في الطبيعة 4،9،، فان Twest وKropinski 10 طرق لتخصيب الحالية لعزل فاجات من المياه والتربة مقتبس من التقنيات السابقة المستخدمة في تخصيب العزلات البكتيرية البيئية ولكن تقنيات تخصيب هذه أثبتت عدم كفاءة في عزل فاجات الفصلاء. والغرض من هذا الأسلوب هو موضح هنا هو إظهار "دليل على مفهوم" أن أساليب التخصيب في وقت مبكر يمكن تكييفها لباستمرار وبشكل فعال عزل فاجات الفصلاء، والتغلب على التحديات التقنية السابقة المرتبطة عزل فاجات من هذا جنس البكتيريا.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد الخلايا Arthobacter لفج عزل

  • ثقافة الفصلاء س. يشوبه KY3901 المستعمرات على لوريا Bertaini (LB) لوحة أجار المحتضنة في 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام. اختيار مستعمرة واستخدام حلقة عقيمة لإضافته إلى 250 مل من مرق LB في قارورة الثقافة حيرة واحتضان في حاضنة تهتز في 225 دورة في الدقيقة في 30 ° C.
  • السماح حوالي 24 ساعة من النمو للحصول على خلايا مرحلة متأخرة الأسي / في وقت مبكر ثابتة للتجارب العدوى فج. رصد حالة نمو البكتيريا بشكل وثيق لمنع الخلايا من دخول الوسط إلى أواخر الدولة نمو ثابتة.
    يجب أن تتكون نمو الخلايا من OD الكثافة البصرية 600 بين 0.5 .0.7 لإجراءات العزل فج وتنقية / الخطوات الموضحة أدناه: ملاحظة.

2. جمع فج من عينات التربة

  1. جمع 200-400 غرام من التربة من الموقع المطلوب. ملاحظة: بما أن البكتيريا الموجودة في Arthrobaجنس cter هي بكتريا التربة المشتركة التي وفاجات التي تصيب منهم يمكن العثور عليها في وهم منتشر في معظم أنواع التربة.
  2. إضافة 400 مل على الأقل من فج العازلة (PB) [68 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي MgSO و 10 ملي تريس-CL (7.5 درجة الحموضة)] إلى التربة وخلط في قارورة كبيرة بما فيه الكفاية بحيث لا يقل عن 200 مل من PB هو في طاف وقادرة على استخراجها.
  3. مزيج من قبل اثارة أو تحريكها بلطف حتى يتم وقف التنفيذ التربة والسماح للترسبات التربة ليستقر، وعادة 30 دقيقة.
  4. تمرير "استخراج التربة" من خلال ورق الترشيح عن طريق الترشيح خطورة لإزالة التربة الحطام الرواسب.
  5. إضافة مسحوق LB وخلط لتقديم حل 2٪ (4 ز LB مسحوق في 200 مل استخراج التربة).
  6. تمرير الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون عن طريق الترشيح فراغ للحصول على الترشيح العقيمة. إذا كان ذلك ممكنا، انتقل إلى الخطوة 2.7 على الفور. إذا لزم الأمر، وتخزين تصفية العينات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع قبل المتابعة، ومع ذلك، فإن عدد الجزيئات فج قابلة للحياةسيتم تخفيض.
  7. قسامة متعددة 50 مل أجزاء من فلتر تعقيم LB / التربة استخراج الخليط الفردية 250 مل تعقيمها تهتز قوارير ثقافة حيرة باستخدام تقنيات العقيم. إضافة معقم 2.0 M CaCl 2 حل للتركيزات النهائية المرجوة (0-50 ملم) منذ فاجات الفصلاء مختلفة تنمو على النحو الأمثل في إطار مختلف الظروف CaCl 2.
    ملاحظة: نحن نجد أن الغالبية العظمى من فاجات الفصلاء التي حددها لنا هي ضمن مجموعة من 1 ملم، 2.5 ملم CaCl 2. ومع ذلك، نمت العديد من فاجات معزولة من قبلنا حصريا في 0 ملي CaCl 2. أو في عالية جدا CaCl 2 التركيزات. الشروع فورا إلى الخطوة 3.1.

3. فج عزل

  1. إضافة 1-2،5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر ثابتة ثقافة البكتيريا المرحلة إلى كل من قوارير. لOD 600 0،5-0،7، استخدم 1 مل من الخلايا. لOD 600 أعلى من مجرد OD من 0.7 استخدام 2.5 مل منالخلايا.
    ملاحظة: خلايا في النمو الأسي المرحلة عادة ما تسفر عن المزيد من فاجات والتتر أعلى من الخلايا في النمو مرحلة ثابتة.
  2. يهز قوارير في 250 دورة في الدقيقة في 30 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 24 ساعة في حاضنة تهتز.
  3. بعد فترة حضانة 24 ساعة إزالة قوارير التخصيب من الحاضنة تهتز وتمييع عينات تخصيب عشرة أضعاف في المخزن فج.
  4. إنشاء أنابيب الثقافة مع 0.5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر ثابتة ثقافة البكتيريا المرحلة وإضافة كميات متنوعة من الثقافة تخصيب (5 ميكرولتر إلى 500 ميكرولتر من 10 -1 التخفيف في PB) إلى أنابيب الثقافة.
    ملاحظة: ومن المستحسن لاختبار مجموعة واسعة من تركيزات لأن كل عينة التربة يولد التتر فج مختلفة بعد التخصيب.
  5. إضافة CaCl 2 إلى أنابيب الثقافة لجعل تركيز النهائي يساوي الحاضر التركيز في قارورة تخصيب الأصلية. استخدام مجموعة من تركيزات مختلفة CaCl 2 لتحديد لكثير من فاجات ثإيث متفاوتة CaCl 2 التبعيات.
    ملاحظة: سيتم عزل معظم فاجات ضمن نطاق CaCl 2 من 1-2.5 ملي ولكن هناك فاجات معزولة أكثر على النحو الأمثل في أي مكان 0-50 ملي CaCl 2 التركيزات. وبسبب هذا فمن الأفضل أن تحقق مجموعة من CaCl 2 تركيزات إلى زيادة عدد فريدة فاجات الفصلاء معزولة.
  6. خلط 4.5 مل من LB أعلى أجار في أنبوب الثقافة ويصب الخليط على لوحة أجار LB. دوامة بلطف لتوزيع عبر لوحة بالتساوي والسماح لأعلى أجار لترسيخ لحوالي 15 دقيقة.
    ملاحظة: أعلى أجار يمكن تحضير دفعات أكبر (250 مل) والاضافي أعلى أجار يمكن تخزينها في RT وإعادة استخدامها لتجارب لاحقة لمدة أسبوعين على الأقل. على الرغم من أن هناك صيغ مختلفة تستخدم في صنع كبار أجار، ونحن جعل أعلى أجار باستخدام 7G / L من أجار مختلطة مع LB. مكان أعلى أجار في 60 ° C حمام الماء للاحتفاظ الحالة السائلة أثناء التجربة.
  7. عكس رانه لوحة واحتضان عند درجة الحرارة المطلوبة (درجة الحرارة إلى 30 ° C) O / N إلى 48 ساعة. وتختلف هذه الظروف لتحسين لفاجات الحالية. فاجات الأكثر عزلة تأتي من لوحات المحتضنة في 30 درجة مئوية في 1-2.5 ملي CaCl 2 التركيز بعد فترة حضانة 24 ساعة.

4. فج تنقية

  1. بعد 24 ساعة الاختيار الحضانة لتشكيل لوحة على لوحات. تستمر الحضانة لمدة تصل إلى 72 ساعة إذا لم ويحات واضحة أو لتحديد ما إذا كان سوف تظهر لويحات إضافية. إذا لزم الأمر، لوحات متجر مع لويحات المفترضة لمدة تصل إلى أسبوع في 4 درجات مئوية قبل المتابعة.
    ملاحظة: ليس من المألوف أن تجد مجموعة متنوعة من الأشكال التضاريسية لوحة مختلفة على لوحة واحدة. العثور على لويحات بعد 3 أيام من الحضانة هو ممكن ولكن نادرة.
  2. تنقية فاجات المرجوة من لويحات معزولة بشكل واضح استخدام طريقة متتالية البلاك. لمس لوحة بعصا خشبية العقيمة. خط اللوحة عن طريق تشغيل عصا خشبية من خلال لهب، allowinز العصا لتبريد لفترة وجيزة، ثم فرك العصا على لوحة أجار في اقتراح لطيف كما هو مبين في الشكل رقم 1. كرر ذلك باستخدام عصا نظيفة لكل بالمرور.
  3. بدلا من ذلك، استخدم التقليدي الفحص عيار البلاك لعزل ويحات فج الفردية. الفحص عيار وحة لا تتطلب استخدام المزيد من الكواشف مثل LB أجار وLB أعلى أجار والمواد مثل لوحات بتري لعزل فج البلاك. لقد كنا ناجحة للغاية باستخدام طريقة خط وحة لكنه أسهل من الناحية الفنية لعزل ويحات الفردية باستخدام الفحص عيار البلاك.
  4. بمجرد مجزع لوحة أجار LB ثلاث مرات على الأقل، بمناسبة منطقة بأقل تركيز الجزيئات فج المفترضة وتطبيق بلطف 0.5 مل من الفصلاء و 4.5 مل من المنصهر LB أعلى أجار (التي تحتوي على نفس التركيز من كلوريد الكالسيوم مثل لوحة الأم ) وتسمح له بالانتشار بالتساوي على طبق من ذهب.
  5. عكس واحتضان لوحة O / N. كرر وحة متتاليةمعزول تقنية لا يقل عن ثلاث مرات التكرار لضمان وجود الأنواع فج نقية. متجر لوحات في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوع حسب الحاجة بين الشرائط دون خسائر كبيرة في جدوى فج.
  6. وقد نمت لويحات مرة واحدة المطلوب وعزل على لوحة خط النهائية، لمسة واحدة لوحة معزولة جيدا مع طرف ممص مكروى واعادة تعليق في 100 ميكرولتر PB. تمييع متسلسل هذا 10 0 الحل إلى التخفيف 10 -8 عن طريق تمرير 20 ميكرولتر من العينة إلى 180 ميكرولتر من PB الطازجة.
  7. إضافة 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى 0.5 مل من يزرع الفصلاء في أنبوب الثقافة لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT ولوحة عن طريق خلط البكتيريا المصابة مع 4.5 مل من المنصهر LB أعلى أجار التي تحتوي على نفس التركيز من CaCl 2 تستخدم لعزل فج من عينة التربة الأصلية. حفظ جميع التخفيفات التي قدمت في 4 ° C حتى اليوم التالي.
  8. تحديد التخفيف المتسلسل فج اللازمة لجعل نمط الويب باستخدام عيار وحة التقليدي كماأقول. الغرض من فحص عيار البلاك هو تحديد عيار فج اللازمة للحصول على لوحة نمط الويب. تحديد نمط لوحة الويب كما تخلو في معظمها من البكتيريا ولكن تحتوي على بقايا من البكتيريا التي لم يتم حتى الآن هي lysed من قبل فاجات. إضافة 5 مل من أواخر الأسية / في وقت مبكر الثقافة الفصلاء ثابتة إلى معقمة 50 مل قارورة الثقافة.
    1. إضافة 100 ميكرولتر من التخفيف (التي أعطت نموذجا على شبكة الإنترنت لثقافة الفصلاء) في قارورة الثقافة والسماح للفاجات لتصيب خلايا البكتيريا لمدة 5 إلى 10 دقيقة في RT. خلط مع المنصهر LB أعلى أجار التي تحتوي على نفس التركيز من CaCl 2 كما تستخدم لتحديد البداية وفج لوحة 5 مل من هذا الخليط على 10 لوحات LB جديدة. السماح لترسيخ واحتضان لوحات مقلوبة في 30 ° C.
  9. في اليوم التالي، إغراق لوحات نمط الويب مع 5 مل من PB وتخزين O / N عند 4 درجات مئوية أو 4 ساعة على RT.
  10. تصفية المحللة فج من خلال مرشح حقنة 0.22 ميكرونوتخزينها في 4 درجات مئوية. استخدام هذا المخزون فج النهائي للتجارب إضافية مثل الصور المجهر الإلكتروني من جسيمات فج، فج عزل الحمض النووي الجينومية لتحليل انزيم التقييد DNA وتسلسل الجيني باستخدام إجراءات القياسية. للتخزين على المدى الطويل من الأسهم فج، إضافة كمية متساوية من المحللة فج لالجلسرين معقم في قوارير صغيرة لحفظ الأوراق المالية في -80 ° C.
    ملاحظة: بالنسبة لأولئك لم تشهد مع هذه التقنيات فج، مورد العظيم هو موقع على الانترنت www.phagesdb.org الوصول إليها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لإثبات استنساخ لتحسين تقنية تخصيب للفاجات الفصلاء، استخدمت 30 عينات من التربة مختلفة في أوقات مختلفة وأماكن خلال فصلي الربيع والصيف من عام 2014. ومن بين هذه العينات 30 التربة تم الحصول فاجات الفصلاء فريدة من 22 من عينات التربة التي تم جمعها باستخدام هذا التخصيب الإجراء. أسفرت الإجراء تخصيب القياسية فاجات فريدة من 3 من عينات التربة نفسها. يمكن للعينات تخصيب يكون لها عيار فج عالية جدا التي تحتاج إلى التخفيف الأولي لعزل ويحات أو عيار فج منخفض نسبيا تتطلب حجم أكبر من الفصلاء المخصب لكشف الناجح لويحات. نحن نستخدم طريقة متتالية البلاك لعزل السكان فج النقي بعد تخصيب الأولي وطلاء على LB أجار (الشكل 2). بدلا من ذلك، وهو معيار عيار وحة الفحص التقليدي يمكن أن تستخدم لعزل عزل فج النقي رغم أن هذا الأسلوب يأخذ المزيد من الوقت والكواشف، والماديةالصورة. كما ذكر في وقت سابق، ونحن نفعل استخدام فحص عيار وحة لتحديد تجريبيا أرقام عيار فج وعدد من البلاك تشكيل وحدات (PFUs) لتشكيل نمط حزام على طبق من ذهب. الشكل 3 يصور مجموعة من التخفيفات التسلسلية للفج الموز ويدل ل واحدة من لوحات ما ينبغي أن ننظر نمط ويب جيد مثل الشكل 4 يصور الصور micrographic الإلكترون من 20 فاجات الفصلاء المعزولة باستخدام تقنية تخصيب اليورانيوم. من 25 فاجات معزولة حاليا، 23 منهم من siphoviruses مع ذيول طويلة نوعا ما. اثنين من فاجات معزولة هي myoviruses تحتوي على أقطار مماثلة في الطول إلى أن من ذيولها.

الشكل (1)
الشكل 1. الإنتصارات لوحة التخطيطي تقنية تستخدم لعزل لويحات فج الفردية. وتمثل نجمة صفراء المنطقة على لوحة أن LBأجار العلوي بالإضافة إلى حل البكتيريا يجب سكب بعناية على طبق بعد أن تم الانتهاء من تسليط الضوء على فج البلاك.

الشكل 2
الشكل 2. أمثلة من تقنية لوحة خط المستخدمة لعزل لويحات لفج واحد (ديلان) في ثلاث درجات حرارة مختلفة. لاحظ أن فج ديلان تنتج لوحات مماثلة في RT، 30 ° C و 37 ° C. دوائر حمراء على اثنين من لوحات تحيط ويحات معزولة بشكل واضح.

الشكل (3)
وكان الرقم 3. اللوحة عيار الفحص. الفصلاء فج الموز التسلسلي مخففة في PB ومطلي على لوحات أجار كما هو موضح في أقسام 4.6 و 4.7 من نص البروتوكول. أظهرت هي التخفيفات المسلسل T-4 إلى T-8 (من أعلى). لاحظ أن الالبريد T-5 التخفيف (من أسفل إلى أعلى) وقدم نمطا الويب فقط مع كمية صغيرة من العشب البكتيرية لا تزال قائمة. خلقت الدنيا التخفيفات التسلسلية (T-1 إلى T-3) لوحات واضحة مع كل من البكتيريا هي lysed بواسطة جزيئات فج يدل على عدم وجود أي نمو البكتيريا.

الشكل (4)
الشكل 4. الكترون الصور micrographic من 20 فاجات الفصلاء معزولة باستخدام تقنية تخصيب اليورانيوم. وأخذت الصور باستخدام FEI مورغانيي TEM. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وعلى الرغم من العديد من المحاولات السابقة لعزل فاجات القادرة على إصابة المضيفين الفصلاء، كان لدينا نجاح يذكر باستخدام إجراءات تخصيب القياسية. طريقة المعمم تخصيب البكتيرية المتقدمة وتكييفها من قبل فان Twest وKropinski 10 إلى إثراء فاجات من العينات البيئية يبقى الأساس بالنسبة لغالبية إجراءات التخصيب. أدلة من دراسات سابقة تشير إلى أن أساليب الطلاء المباشر أنتجت لوحات للكشف عن سلالات الفصلاء ولكن مع معدلات النجاح منخفضة جدا من العزلة 5. مع أسلوب الطلاء المباشر، يتم استخراج فاجات من عينات التربة في منطقة عازلة فج وتصفيتها لإزالة البكتيريا الملوثة. تضاف استخراج تصفيتها تحتوي على جزيئات فج إلى المضيف البكتيريا المطلوب للسماح للعدوى الخلية المضيفة ومطلي دون جولات إضافية من نمو البكتيريا وفج التضخيم.

تقنية تخصيب دينا هي قوية وOPtimized لعزل سهلة نسبيا من فاجات الفصلاء من الفصلاء س. KY3901. لإجراءات التخصيب التقليدية، فاجات، جنبا إلى جنب مع العديد من أنواع مختلفة من البكتيريا الموجودة في عينات التربة، ويتم استخراج من التربة في المخزن فج وتضاف إلى وسائط النمو الطازجة مع الخلايا البكتيرية المطلوب استخدامها بوصفها البلد المضيف للعدوى فج. مع أسلوب تخصيب، تتم إزالة كافة بكتريا التربة من التربة المستخرجة عينات فج عن طريق الترشيح من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. وتضعف العقيمة التي تمت تصفيتها المحللة التي تحتوي على جزيئات فج، ولكن ليس بكتيريا التربة، في 2X LB مرق مع البكتيريا المطلوب استخدامها بوصفها البلد المضيف نشر فج. والفرق الرئيسي بين إجراء تخصيب دينا وغيرها هو أن هناك NO تلويث التربة البكتيريا التي تتنافس على نمو البكتيريا مع المضيف خلال الفترة فترة حضانة تخصيب اليورانيوم. المضيف الوحيد استخراج التربة فج يمكن أن تصيب هو ان من البكتيريا المضيف المطلوب وبالتالي maximiZES إمكانات نمو البكتيريا المضيفة والتضخيم من فاجات المضيف معين المطلوب.

في تطور الإجراء الموضح هنا حاولنا لحساب التحيز الانتقائي الكامنة في أي إجراء تخصيب عن طريق اختبار مجموعة من تركيزات CaCl 2 11. ما أصبح واضحا هو أن بعض العزلات فج تظهر الاختلافات الفسيولوجية التي تعتمد على معايير مثل تركيز أيون الكالسيوم ودرجة الحرارة. لالمستقبلية العزلة الفصلاء فج نخطط لاختبار العوامل الرئيسية مثل مثل الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة والملوحة والمواد الغذائية، ثنائي التكافؤ ايونات المعادن لعزل فاجات قادرة على التكاثر في مضيفيهم على النحو الأمثل في ظل الظروف البيئية المختلفة.

نحن نستخدم نمت حديثا الفصلاء الخلايا في هذه التجربة. نحن لا نستخدم الخلايا التي تصل إلى منتصف وأواخر مرحلة ثابتة من النمو حيث أننا قد وجد صعوبة في عزل فج أو وجود التتر لائقة مع فاجات المعروف في الهو فترة النمو. وقد أظهرت الآخرين على تثبيط العدوى فج في مرحلة ثابتة خلايا المنتصلة 12 وهو ما قد يفسر عدم نجاح عزل فاجات باستخدام الخلايا البكتيرية في منتصف وأواخر مرحلة ثابتة من النمو. وقد حققنا نجاحا باستخدام الثقافات لهذه التجارب مع كثافة الخلايا في أي مكان من OD6 00 من 0،5-0،9. يتم تخزين الثقافات نمت في 4 درجات مئوية، ويمكن استخدامها لفج العزلة تصل إلى سبعة أيام. ومع ذلك، يتم تخزين خلايا أطول الفصلاء في 4 درجات مئوية وانخفاض عيار واشتعلت حجم الجزيئات فج المعدية. تم العثور على نتائج مماثلة باستخدام كولاي لإصابة phageT4 13. لذلك باستخدام الخلايا البكتيرية في أقرب وقت ممكن بعد وصولها إلى النمو المنشود يزيد فرص الحصول على فج رواية من عينة التربة.

يجب بصفة عامة، واستخدام هذه التقنية لتخصيب مع وسائل الاعلام LB يثبت أنه بالكادحصري لعزل فاجات الفصلاء. وبينما كان LB معيار الصناعة لزراعة E. سلالات كولاي وغيرها من أعضاء المعوية، وهو يدعم نمو مجموعة واسعة من البكتيريا في الظروف الهوائية 14. يمكن على الأرجح تكوين المغذيات الغنية من LB وسائل الإعلام أن تستخدم في هذه الطريقة لنشر فاجات في مجموعة متنوعة بشكل لا يصدق من البكتيريا الهوائية ومنع من التحديات التقنية التي تحول دون اكتشاف فج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة.

Acknowledgments

تم توفير التمويل لتطوير هذا البروتوكول من قبل اتحاد جنوب شرق ولاية بنسلفانيا للتعليم العالي ووزارة العلوم كابريني كلية. وجاء التمويل ودعم إضافي من جامعة أركاديا وجامعة الطاهرة. نشكر خصوصا الدكتورة كارين Snetselaar في جامعة القديس يوسف لتتكرم أخذ الصور الإلكترون المجهري من فاجات معزولة لدينا. وقدم دعم إضافي من قبل الصيادين معهد هوارد هيوز الطبي التحالف تعليم العلوم فج النهوض علم الجينوم والتطوري العلوم برنامج (SEA-فاجات).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189, (3), 674-682 (2007).
  2. Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
  3. Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
  4. Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46, (9), 2980-2986 (2008).
  5. Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35, (1), 185-191 (1978).
  6. Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77, (21), 7864-7867 (2011).
  7. Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178, (7), 1996-2004 (1996).
  8. Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28, (6), 951-959 (1974).
  9. Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12, (5), 1031-1033 (1973).
  10. Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
  11. Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26, (4), 755-766 (1997).
  12. Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41, (2), 265-272 (1978).
  13. Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
  14. MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. Available from: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli (2013).
تقنية التخصيب الأمثل للعزل<em&gt; الفصلاء</em&gt; أنواع الجراثيم من عزلات عينة التربة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter