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Environment

Une technique d'enrichissement Optimisé pour l'isolement de doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

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L'omniprésence des espèces Arthrobacter dans des environnements de sol offre un grand nombre et la diversité des phages susceptibles d'être isolé de cette espèce de bactéries hôtes. Bactériennes membres de la famille Acintobacteriaceae sont les plus notables pour leurs voies cataboliques de dégrader des composés récalcitrants comme l'atrazine et d'autres pesticides et herbicides 1,2,3. Bien que la plupart des recherches ont été faites en utilisant des souches environnementales de Arthrobacter, isolats cliniques de ce genre se trouve dans le sang, l'urine, les yeux, et de nombreuses autres sources humaines tout une hétérogénéité phylogénétique 4.

Bien qu'il existe un corps plutôt vaste de la recherche sur les bactéries Arthrobacter, seules quelques études signalent sur ​​les phages capables d'infecter les membres de ce genre diversifié. Fait intéressant cependant, le travail fait précédemment sur ​​Arthrobacter phages touches sur plusieurs sujets distincts clés tels que le typage du sol <em> espèces Arthrobacter 5, les utilisations industrielles dans le but de réduire la mousse délétère dans les usines de traitement des boues activées 6, et le travail en soulignant recombinaison spécifique de site et les gènes de l'intégrase 7.

Divers protocoles de technique d'enrichissement ont été employées pour générer des isolats de phage pur dans les espèces Arthrobacter. Les premières procédures comprennent incubations de sol avec des agents toxiques ajoutés comme les sels de nicotine pour des périodes de plus d'un an donnant lieu à 8 phages capables de ne infecter A. globiformis. Des études effectuées en utilisant le sol percole avec des matières organiques labiles semblent produire des phages détectables par des techniques d'analyse plaque, en omettant longues périodes d'incubation 8. Fait intéressant cependant, une technique qui ressemble à ensemencement direct a été utilisé dans le passé donnant lieu à plusieurs phages tout en ayant un taux de réussite particulièrement faible par les enquêteurs 5, citant des études passées avec faibles taux de réussite

Dans l'ensemble, les techniques d'isolation utilisés dans le passé ont été remarquables pour avoir peu d'efficacité dans la pratique malgré les genre Arthrobacter représentant le sol aérobie la plus courante isoler dans la nature 4,9, Van Twest et Kropinski 10 méthodes d'enrichissement présents pour isoler les phages de l'eau et du sol adapté de techniques antérieures utilisées pour enrichir isolats bactériens environnementaux, mais ces techniques d'enrichissement se est avéré inefficace à isoler phages Arthrobacter. Le but de la méthode décrite ici est de montrer "preuve de concept" que les méthodes d'enrichissement début peuvent être adaptés pour isoler cohérente et efficace phages Arthrobacter, surmonter les défis techniques associés à isoler précédentes phages de ce genre bactérien.

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Protocol

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1. Préparation des cellules pour Arthobacter Phage Isolement

  • Culture Arthrobacter sp. KY3901 colonies striées sur une Luria Bertaini (LB) plaque de gélose incubées à 30 ° C pendant 2-3 jours. Choisissez une colonie et utiliser une boucle stérile pour l'ajouter à 250 ml de bouillon LB dans un flacon de culture perplexe et incuber dans un incubateur sous agitation à 225 tours par minute à 30 ° C.
  • Laisser environ 24 h de la croissance pour obtenir fin des cellules en phase stationnaire exponentielles / début pour des expériences d'infection de phage. Surveiller l'état de la croissance bactérienne étroitement pour empêcher les cellules de pénétrer dans le milieu à la fin l'état stationnaire de croissance.
    NOTE: La croissance cellulaire devrait être composé d'une densité optique OD 600 de 0,5-.0.7 pour les procédures d'isolement et de purification de phages / étapes décrites ci-dessous.

2. Collecte des phages d'échantillons de sol

  1. Rassemblez 200-400 g de sol de l'emplacement souhaité. Remarque: Comme les bactéries dans le Arthrobagenre Cter sont des bactéries du sol et les communes qu'ils phages qui les infectent peuvent être trouvés dans et sont omniprésents dans la plupart des types de sol.
  2. Ajouter au moins 400 ml de tampon de phage (PB) [mM de NaCl 68 mM MgSO4 10, 10 mM de Tris-Cl (pH 7,5)] pour le sol et les mélanger dans un grand ballon suffisamment pour qu'au moins 200 ml de PB est dans le surnageant et est apte à être extrait.
  3. Mélanger par agitation ou remuant doucement jusqu'à ce que le sol est suspendu et laisser les sédiments du sol pour se installer, généralement 30 min.
  4. Passez le "extrait de sol" à travers un papier filtre par filtration par gravité pour éliminer les débris sédiments du sol.
  5. Ajouter la poudre LB et mélanger pour obtenir une solution à 2% (4 g de poudre LB dans 200 ml d'extrait sol).
  6. Filtrer la solution à travers un filtre de 0,22 um par filtration sous vide pour obtenir un filtrat stérile. Si possible, passez à l'étape 2.7 immédiatement. Si besoin est, magasin filtré échantillons à 4 ° C pendant jusqu'à une semaine avant de continuer, cependant, le nombre de particules de phages viablessera réduite.
  7. Aliquote multiples portions de 50 ml du mélange d'extrait LB / sol stérilisée par filtration dans individuels de 250 ml stérilisés secouant flacons de culture dérouté aide de techniques aseptiques. Ajouter stérile 2,0 M CaCl 2 solution aux concentrations finales souhaitées (0-50 mm) depuis différents phages Arthrobacter croissent de manière optimale dans différentes conditions de CaCl 2.
    REMARQUE: On constate que la majorité des phages Arthrobacter sont identifiés par nous dans la plage de 1 mM à 2,5 mM, CaCl 2. Cependant, plusieurs des phages isolés ont augmenté par nous exclusivement à 0 mM CaCl2 .ou à de très hautes concentrations de CaCl 2. Procéder immédiatement à l'étape 3.1.

3. Isolation Phage

  1. Ajouter 1 à 2,5 ml de retard fixe culture de bactéries en phase exponentielle / début de chacun des flacons. Pour une DO 600 de 0,5 à 0,7, utiliser 1 ml de cellules. Pour une DO 600 supérieure à une DO de 0,7 utiliser 2,5 ml decellules.
    REMARQUE: Les cellules en phase de croissance exponentielle donnent généralement plus de phages et des titres plus élevés que les cellules de la croissance de la phase stationnaire.
  2. Secouez flacons à 250 tours par minute à 30 ° C pendant environ 24 heures dans un incubateur à agitation.
  3. Après une période d'incubation de 24 h retirer flacons enrichissement de l'incubateur secouant et diluer les échantillons d'enrichissement de dix fois dans le tampon de phage.
  4. Mettre en place des tubes de culture avec 0,5 ml de retard fixe culture de bactéries en phase exponentielle / début et ajouter diverses quantités de la culture d'enrichissement (5 ul à 500 ul d'une dilution à 10 -1 PB) aux tubes de culture.
    NOTE: Il est conseillé de tester une large gamme de concentrations puisque chaque échantillon de sol génère différents titres de phages après enrichissement.
  5. Ajouter CaCl 2 pour des tubes de culture pour rendre une concentration finale égale à la concentration présente dans le ballon de l'enrichissement initial. Utilisez une gamme de différents CaCl 2 concentrations de sélectionner pour nombreux phages wCaCl 2 ième variable dépendances.
    REMARQUE: La plupart des phages seront isolés dans la plage de 1 à 2,5 CaCl 2 mm, mais il ya des phages isolés plus optimale partout 0-50 mM CaCl 2 concentrations. Pour cette raison, il est préférable de vérifier une gamme de CaCl 2 concentrations de maximiser le nombre de phages uniques Arthrobacter isolés.
  6. Mélanger 4,5 ml d'agar LB dans le tube de culture et versez le mélange sur une plaque de gélose LB. Agiter doucement pour répartir uniformément sur la plaque et permettre top agar se solidifier pendant environ 15 min.
    REMARQUE: Top agar peut être préparé en lots plus importants (250 ml) et top agar supplémentaire peut être conservé à température ambiante et réutilisé pour des expériences ultérieures pendant au moins deux semaines. Bien qu'il existe différentes formules utilisées pour faire agar dessus, nous faisons top agar en utilisant 7g / L d'agar mélangé avec LB. agar Placez dans un bain-marie à 60 ° pour conserver l'état liquide au cours d'une expérience.
  7. Inverser til plaque et incuber à la température souhaitée (température à 30 ° C) O / N à 48 h. Vary ces conditions pour optimiser les phages présents. Phages plus isolées proviennent de plaques ont été incubées à 30 ° C à 1 à 2,5 mM CaCl concentration 2 après une période d'incubation de 24 h.

4. Phage Purification

  1. Après un contrôle d'incubation de 24 heures pour la formation de plaque sur des plaques. Continuer incubation jusqu'à 72 heures si aucune plaques sont évidentes ou pour déterminer si des plaques supplémentaires apparaîtront. Si nécessaire, des plaques de magasins avec plaques putatifs pour jusqu'à une semaine à 4 ° C avant de procéder.
    NOTE: Il ne est pas rare de trouver une variété de différentes morphologies de la plaque sur une plaque. Trouver plaques après 3 jours d'incubation est possible, mais rare.
  2. Purifier phages souhaités de plaques clairement isolé en utilisant la méthode de la plaque de série. Touchez une plaque avec un bâton en bois stérile. Streak la plaque en exécutant un bâton en bois à travers une flamme, allowing le bâton pour refroidir brièvement, puis frotter le bâton sur la plaque de gélose dans le mouvement doux comme le montre la figure 1. Répétez cette aide d'un bâton propre pour chaque passage.
  3. Vous pouvez également utiliser le dosage traditionnelle plaque de titre pour isoler plaques de phages individuels. La plaque de dosage titre exige l'utilisation de plusieurs réactifs tels que l'agar LB et LB agar supérieur et des matériaux tels que des boîtes de Pétri pour l'isolement de la plaque de phage. Nous avons eu beaucoup de succès en utilisant la méthode de la plaque de série, mais il est techniquement plus facile à isoler plaques individuelles en utilisant le test de la plaque titre.
  4. Une fois que la plaque de gélose LB est striée au moins trois fois, marquer la zone avec la plus faible concentration de particules de phage putatifs et appliquer doucement 0,5 ml d'Arthrobacter et 4,5 ml de top agar fondu LB (contenant la même concentration de chlorure de calcium comme la plaque mère ) et lui permettre de se répandre uniformément sur la plaque.
  5. Inversez et incuber la plaque O / N. Répétez la plaque de sérietechnique pendant au moins trois itérations pour assurer une espèce de phage pur est isolé. plaques de conserver à 4 ° C pour jusqu'à une semaine selon les besoins entre les stries sans perte significative de la viabilité du phage.
  6. Une fois plaques souhaités ont été cultivées et isolé sur la plaque de série finale, touchez une plaque bien isolée avec une pointe de micropipette et remettre en suspension dans 100 pi de PB. Série diluer cette solution à 10 0 à la dilution 10 -8 en passant 20 pi de l'échantillon dans 180 pl de PB frais.
  7. Ajouter 10 ul de chaque dilution de 0,5 ml de cultivé Arthrobacter dans un tube de culture pendant 5 à 10 min à la température ambiante et la plaque en mélangeant les bactéries infectées avec 4,5 ml de top agar LB fondu contenant la même concentration de CaCl 2 utilisé pour isoler les phages de l'échantillon de sol d'origine. Enregistrer toutes les dilutions faites à 4 ° C jusqu'au lendemain.
  8. Déterminer la dilution en série de phage nécessaire pour faire un modèle Web en utilisant le titre de plaque traditionnelledire. Le but de l'essai de plaque de titrage est de déterminer le titre de phage nécessaire pour obtenir une plaque-modèle Web. Identifier une plaque de motif de forme Web comme la plupart du temps mais dépourvu de bactéries contenant des restes de bactéries qui ne ont pas encore été lysées par les phages. Ajouter 5 ml de la culture exponentielle / début fin Arthrobacter fixe à une culture de 50 ml flacon stérile.
    1. Ajouter 100 ul de la dilution (qui a donné un motif de bande de la culture de Arthrobacter) dans le flacon de culture et de permettre aux phages pour infecter les cellules bactériennes pendant 5 à 10 min à température ambiante. Mélanger avec le dessus de la gélose LB fondu contenant la même concentration de CaCl 2 comme initialement utilisé pour identifier le phage et la plaque 5 ml de ce mélange sur 10 plaques LB frais. Laisser solidifier et incuber les plaques inversées à 30 ° C.
  9. Le lendemain, inonder les plaques modèles Web avec 5 ml de PB et stocker O / N à 4 ° C ou 4 heures à température ambiante.
  10. Filtrer le lysat de phage à travers un filtre à seringue de 0,22 umet stocker à 4 ° C. Utilisez ce phage finale stock pour des expériences supplémentaires tels que des images de microscopie électronique de particules de phage, phage isolement de l'ADN génomique pour l'analyse de restriction enzyme ADN et le séquençage génomique en utilisant des procédures standard. Pour le stockage à long terme du stock de phages, ajouter un montant égal du lysat de phage glycérol stérile dans de petites fioles pour le stock archivage à -80 ° C.
    NOTE: Pour ceux qui ne expérience avec ces techniques de phage, une grande ressource est le site de www.phagesdb.org accessible en ligne.

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Representative Results

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Pour démontrer la reproductibilité de la technique d'enrichissement amélioré pour phages Arthrobacter, 30 échantillons de sol différents ont été utilisés à différents moments et les lieux au cours du printemps et de l'été 2014. Parmi ces échantillons 30 de sol phages Arthrobacter uniques ont été obtenus à partir de 22 échantillons de sol prélevés en utilisant cet enrichissement procédure. La procédure d'enrichissement donné norme phages uniques à partir de trois de ces mêmes échantillons de sol. Les échantillons d'enrichissement peuvent avoir un titre en phages très haute dilution initiale soit d'isoler des plaques ou un titre de phage relativement faible nécessitant un plus grand volume d'Arthrobacter enrichi pour la détection réussie de plaques. Nous utilisons la méthode de la plaque série d'isoler des populations de phages purs après enrichissement initial et étalement sur ​​gélose LB (Figure 2). En variante, un dosage de plaque de titrage standard traditionnel peut être utilisé pour isoler un isolât de phage pur si cette méthode prend plus de temps, les réactifs et matériauxs. Comme mentionné précédemment, nous utilisons le test plaque titre de déterminer empiriquement numéros de titre de phages et le nombre d'unités formant des plages (UFP) pour former un motif de sangle sur une plaque. La figure 3 illustre un ensemble de dilutions en série pour phage Banana et démontre pour l'une des plaques ce qu'est un bon modèle de Web devrait ressembler. La figure 4 montre des images micrographiques électrons de 20 phages Arthrobacter isolé en utilisant la technique d'enrichissement. Sur les 25 phages actuellement isolées, 23 d'entre eux sont plutôt siphoviruses avec de longues queues. Deux des phages isolés sont myoviruses contenant des diamètres de la tête de longueur équivalente à celle de la queue.

Figure 1
Figure 1. Streak technique de plaque schématique utilisé pour l'isolement des plages de phages individuels. L'étoile jaune représente la surface de la plaque que le LBagar supérieur associé à une solution de bactéries doivent être soigneusement versé sur la plaque après les stries de la plaque de phage a été effectuée.

Figure 2
Figure 2. Des exemples de la technique de la plaque de série utilisé pour l'isolement de plaques pour un phage (Dylan) à trois températures différentes. Notez que Dylan phage produit des plaques semblables à la température ambiante, 30 ° C et 37 ° C. Les cercles rouges sur deux des plaques entourent plaques clairement isolés.

Figure 3
Figure 3. Plaque dosage du titre. Arthrobacter phage Banana était dilué dans de série PB et plaquée sur des plaques d'agar comme décrit dans les sections 4.6 et 4.7 du Protocole de texte. Indiqués sont des dilutions en série T-4 à T-8 (à partir du haut). Notez que ee T-5 dilution (de bas en haut) a donné un modèle de Web avec juste une petite quantité de la pelouse bactérienne restant. Des dilutions en série inférieures (T-1 à T-3) des plaques claires créés avec toutes les bactéries lysées par des particules de phage en évidence par l'absence de croissance bactérienne.

Figure 4
Figure 4. Electron images micrographiques de 20 phages Arthrobacter isolés en utilisant la technique d'enrichissement. Les images ont été prises avec un FEI Morgagni TEM. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Discussion

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Malgré de nombreuses tentatives antérieures afin d'isoler les phages capables d'infecter des hôtes Arthrobacter, nous avons eu peu de succès en utilisant des procédures d'enrichissement standard. La méthode généralisée de l'enrichissement bactérienne développé et adapté par van Twest et Kropinski 10 pour enrichir phages partir d'échantillons environnementaux demeure la base de la majorité des procédures d'enrichissement. Les résultats d'études précédentes suggèrent que les méthodes d'ensemencement direct ont produit des plaques détectables sur les souches de Arthrobacter mais avec des taux de réussite très faible d'isolement 5. Avec la méthode d'ensemencement direct, les phages sont extraits à partir des échantillons de sol dans un tampon de phage et on filtre pour éliminer les bactéries contaminantes. L'extrait filtré contenant des particules de phages sont ajoutés à l'hôte de bactéries souhaitée pour permettre à l'infection de la cellule hôte et plaqué sans cycles supplémentaires de la croissance de bactéries et le phage amplification.

Notre technique d'enrichissement est robuste et optimized pour l'isolement relativement facile de phages Arthrobacter d'Arthrobacter sp. KY3901. Avec des procédures d'enrichissement traditionnelles, des phages, ainsi que de nombreux types de bactéries présentes dans les échantillons de sol sont extraits du sol dans du tampon de phage et ajouté au milieu de culture frais avec des cellules bactériennes désirées utilisées comme hôte pour l'infection par le phage. Avec le procédé d'enrichissement, les bactéries du sol sont retirés du sol extrait des échantillons de phage par filtration à travers un filtre de 0,22 uM. Le lysat contenant des particules stériles filtrés de phages, mais pas les bactéries du sol, sont dilués dans du bouillon 2x LB avec les bactéries souhaitées utilisés comme l'hôte de propagation de phage. La principale différence entre notre procédé d'enrichissement et d'autres est qu'il n'y a pas de contamination des bactéries du sol en compétition pour la croissance avec les bactéries hôtes au cours de la période d'incubation d'enrichissement. Le seul hôte du sol extrait phage qui est capable d'infecter des bactéries hôtes désirées et donc Maximiiden tifie le potentiel de la bactérie hôte et l'amplification des phages spécifiques aux hôtes souhaitées croissance.

Dans le développement de la procédure décrite ici, nous avons tenté de rendre compte de polarisation sélective inhérente à tout procédé d'enrichissement en testant une gamme de concentrations de CaCl 2 11. Ce qui est devenu apparent que certains isolats de phages présentent des différences physiologiques qui dépendent de paramètres tels que la concentration en ions calcium et de la température. Pour les futurs isolements Arthrobacter de phages nous prévoyons de tester facteurs clés tels que comme le pH, la température, la salinité, les nutriments, les ions métalliques bivalents pour isoler phages capables de reproduire chez leurs hôtes de manière optimale dans diverses conditions environnementales.

Nous utilisons fraîchement grandi Arthrobacter cellules dans cette expérience. Nous ne utilisons pas les cellules qui milieu pour atteindre la phase stationnaire de croissance depuis la fin nous avons eu de la difficulté à isoler un phage ou ayant titres décents avec phages connus à eest la période de croissance. D'autres ont montré une inhibition de l'infection par le phage dans les cellules Achromobacter de phase stationnaire 12 qui peut expliquer le manque de succès d'isoler des phages en utilisant des cellules bactériennes au milieu à la phase stationnaire tardive de la croissance. Nous avons eu du succès en utilisant des cultures de ces expériences avec une densité cellulaire ne importe où à partir d'un OD6 00 de 0,5 à 0,9. Cultures cultivées sont conservés à 4 ° C et peuvent être utilisées pour l'isolement du phage jusqu'à sept jours. Cependant, plus les cellules d'Arthrobacter sont conservés à 4 ° C, le plus faible et le titre éclatent taille de particules infectieuses de phage. Des résultats similaires ont été trouvés avec l'aide d'Escherichia coli pour l'infection de 13 phageT4. Par conséquent l'utilisation de cellules bactériennes dès que possible après avoir atteint la croissance souhaitée maximise les chances d'obtenir un roman phage à partir d'un échantillon de sol.

D'une manière générale, l'utilisation de cette technique d'enrichissement avec les médias LB devrait se avérer peineexclusif à l'isolement de phages Arthrobacter. Alors que LB a été la norme de l'industrie pour la culture de E. coli et des souches d'autres membres de la famille des Enterobacteriaceae, il supporte la croissance d'une grande variété de bactéries dans des conditions aérobies 14. La composition riche en éléments nutritifs du milieu LB peut probablement être utilisé dans cette méthode pour propager phages dans un groupe incroyablement diversifié de bactéries aérobies empêchant défis techniques d'entraver la découverte de phage.

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Disclosures

Auteurs déclarent aucun intérêt financier concurrentes.

Acknowledgments

Le financement pour le développement de ce protocole a été fourni par le Southeastern Pennsylvania Consortium pour l'enseignement supérieur et le ministère de la Science Cabrini College. Financement et de soutien supplémentaires sont venus de l'Université Arcadia et l'Université Immaculata. Nous remercions tout particulièrement le Dr Karen Snetselaar à l'Université Saint-Joseph pour prendre de bien vouloir les images microscope électronique de nos phages isolés. Un soutien supplémentaire a été fourni par les chasseurs Howard Hughes Medical Institute Science Education Alliance phages Advancing génomique et le programme (SEA-PHAGES) évolutive Science.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

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References

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Une technique d&#39;enrichissement Optimisé pour l&#39;isolement de<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bactériophage Espèces de l&#39;échantillon du sol Isole
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Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

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