Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Environment

טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

המצאות בכל מקום של מיני Arthrobacter בסביבות אדמה מציעה מספר ומגוון עצומים של פאגים מסוגלים להיות מבודד ממין זה של חיידקי מארח. חברי חיידקים ממשפחת Acintobacteriaceae הם בולטים ביותר למסלולי קטבולי של משפיל תרכובות סוררות כמו אטרזין וחומרי הדברה שונות ו1,2,3 קוטלי עשבים. למרות שרוב המחקר שנעשה באמצעות זנים סביבתיים של Arthrobacter, מבודדים קליני של הסוג הזה נמצא בדם, שתן, עיניים, ומקורות רבים אחרים אדם כולו מוצגות ההטרוגניות פילוגנטי 4.

אמנם יש גוף נרחב למדי של מחקר על חיידקי Arthrobacter, רק מעט מחקרים לדווח על פאגים מסוגלים להדביק בני מין מגוון זו. מעניין אם כי, שנעשתה בעבר על Arthrobacter עבודת פאגים נגיעות בכמה נושאים שונים מפתח כגון ההקלדה של אדמה <em> מיני Arthrobacter 5 שימושים תעשייתיים, במטרה להפחית את הקצף מזיק במפעלים לטיפול בבוצה משופעלת 6, ועבודה המדגישה רקומבינציה ספציפית באתר וגני אינטגראז 7.

פרוטוקולי טכניקת העשרה שונים נוצלו כדי ליצור טהור הפאג מבודד במינים Arthrobacter. נהלים מוקדמים כוללים incubations של אדמה עם סוכנים רעילים הוסיפו כמו מלחי ניקוטין לתקופות של למעלה משנת 8 עלייה נותנת לפאגים מסוגלים א מדביק רק globiformis. מחקרים שנעשו באמצעות אדמה חלחלו עם אורגניים יציב הופיע לייצר פאגים לזיהוי באמצעות טכניקות assay פלאק, השמטת תקופות דגירה ארוכה 8. מעניין אם כי, טכניקה הדומה ציפוי ישיר שימשה בעבר והוליד כמה פאגים בעוד שיש עדיין שיעור הצלחה נמוך במיוחד על-ידי החוקרים 5, בצטטו מחקרים האחרונים עם אחוזי הצלחה נמוכות

בסך הכל, טכניקות הבידוד שימשו בעבר היו ראויות לציון על כך שיעילות קטנה בפועל למרות סוג Arthrobacter המייצג את האדמה האירובית השכיחה ביותר לבודד בטבע 4,9,, ואן Twest וKropinski 10 שיטות העשרה הנוכחיות לבידוד פאגים ממים ואדמה מותאם מטכניקות קודם לכן משמשות להעשרה מבודדת חיידקים סביבתיים, אלא טכניקות העשרה אלה הוכיחו יעילים בבידוד פאגים Arthrobacter. מטרת השיטה המתוארת כאן היא להראות "הוכחה של מושג" שניתן להתאים את שיטות ההעשרה המוקדמות בעקביות וביעילות כדי לבודד פאגים Arthrobacter, להתגבר על אתגרים טכניים קודמים הקשורים לבידוד פאגים מסוג חיידקים זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. הכנת תאי Arthobacter לבידוד הפאג

  • sp Arthrobacter התרבות. KY3901 מושבות מפוספסות על צלחת לוריא Bertaini (LB) אגר טופחה על 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים. פיק מושבה ולהשתמש בלולאת סטרילי כדי להוסיף אותו ל -250 מיליליטר של מרק LB בבקבוק תרבות מבולבל ודגירה בחממה רועדת ב 225 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס.
  • לאפשר כ 24 שעות של צמיחה להשיג תאים מאוחר מעריכי / תחילת נייחות שלב ניסויי זיהום הפאג. לפקח על המצב של התפתחות חיידקים באופן הדוק כדי למנוע מתאים מלהיכנס לאמצע למצב צמיחה נייח מאוחר.
    הערה: צמיחת תא צריכה להיות מורכבת של OD צפיפות אופטי 600 בין 0.5-.0.7 לנהלי בידוד הפאג וטיהור / השלבים מתוארים להלן.

2. אוסף של הפאג מדגימות קרקע

  1. לאסוף 200-400 גרם של אדמה ממקום רצוי. הערה: מאחר שחיידקים בArthrobaסוג cter הם חיידקי קרקע משותפים להם וניתן למצוא פאגים המדביקים אותם ובמחלחלים ברוב סוגי הקרקע.
  2. הוסף לפחות 400 מיליליטר של הפאג הצפת (PB) [68 מ"מ NaCl, 10 מ"מ MgSO 4, 10 מ"מ טריס-CL (pH 7.5)] לאדמה ולערבב בבקבוק מספיק גדול כדי שלפחות 200 מיליליטר של PB הוא בsupernatant והוא מסוגל לחלץ.
  3. מערבבים בעדינות על ידי ערבוב או מתערבלים עד הקרקע מושעה ולאפשר משקעי האדמה להתיישב, בדרך כלל 30 דקות.
  4. להעביר את "תמצית האדמה" דרך נייר סינון על ידי סינון כוח משיכה כדי להסיר שאריות משקעים אדמה.
  5. להוסיף אבקת LB ולערבב כדי להפוך את פתרון 2% (4 אבקת g LB ב200 מיליליטר תמצית אדמה).
  6. להעביר את הפתרון דרך פילטר 0.22 מיקרומטר על ידי סינון ואקום להשיג תסנין סטרילי. במידת האפשר, להמשיך לשלב 2.7 באופן מיידי. אם יהיה צורך, חנות מסוננת דגימות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפני שתמשיך, עם זאת, מספרם של חלקיקי phage קיימאיהיה קטן יותר.
  7. מספר Aliquot 50 מיליליטר מנות של תערובת תמצית LB / אדמה מעוקרת מסנן לתוך 250 מיליליטר בודד המעוקרות רועדים תרבות צלוחיות מבולבלות תוך שימוש בטכניקות aseptic. הוסף פתרון 2 M CaCl סטרילי 2.0 לריכוזים הרצויים הסופיים (0-50 מ"מ) מאז פאגים Arthrobacter שונים לגדול בצורה אופטימלית תחת CaCl 2 תנאים שונים.
    הערה: אנו מוצאים כי הרוב המכריע של פאגים Arthrobacter המזוהים על ידינו הוא בטווח של 1 מ"מ 2.5 מ"מ CaCl 2. עם זאת, כמה מפאגים המבודדים גדלו על ידינו באופן בלעדי ב0 מ"מ CaCl .or 2 בCaCl 2 ריכוזים גבוהים מאוד. פנה מייד לשלב 3.1.

בידוד 3. הפאג

  1. להוסיף 1-2.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב לכל אחד מהצלוחיות. לOD 600 0.5-0.7, להשתמש 1 מיליליטר של תאים. לOD 600 גבוה מOD של 0.7 להשתמש 2.5 מיליליטר שלתאים.
    הערה: תאים בגידול שלב מעריכי בדרך כלל תשואה יותר פאגים וtiters גבוה יותר מאשר תאים בגידול שלב נייח.
  2. Shake צלוחיות ב 250 סל"ד ב 30 מעלות צלזיוס למשך כ 24 שעות בתוך חממה רועדת.
  3. לאחר תקופת דגירה 24 שעות להסיר את צלוחיות העשרה מן החממה הרועדת ולדלל את דגימות ההעשרה פי עשרה במאגר הפאג.
  4. הגדרת צינורות תרבות עם 0.5 מיליליטר של תרבות מעריכי / תחילת סוף נייחת חיידקי שלב ולהוסיף כמויות שונות של תרבות ההעשרה (5 μl 500 μl של דילול 10 -1 בPB) לצינורות התרבות.
    הערה: מומלץ לבדוק מגוון רחב של ריכוזים מאז כל דגימת קרקע יוצרת titers הפאג שונה לאחר העשרה.
  5. להוסיף CaCl 2 לצינורות תרבות כדי להפוך את ריכוז סופי שווה להווה הריכוז בבקבוק ההעשרה המקורי. השתמש במגוון של CaCl 2 ריכוזים שונים כדי לבחור לפאגים רבים wה- i משתנה CaCl 2 תלות.
    הערה: רוב פאגים יהיו מבודדים בטווח של 1-2.5 CaCl 2 מ"מ אבל יש פאגים המבודדים ביותר בצורה אופטימלית בכל מקום 0-50 CaCl 2 ריכוזי מ"מ. בגלל זה הוא הטוב ביותר לבדוק מגוון של CaCl 2 ריכוזים כדי למקסם את מספר פאגים Arthrobacter המבודדים ייחודיים.
  6. מערבבים 4.5 מיליליטר של אגר העליון LB בצינור התרבות ויוצקים את התערובת על צלחת אגר LB. מערבולת בעדינות כדי לפזר באופן שווה על פני הצלחת ולאפשר לאגרת עליון כדי לחזק למשך כ 15 דקות.
    הערה: Top אגר יכול להיות מוכן בקבוצות גדולות יותר (250 מיליליטר) ואגרתי עליון נוסף יכול להיות מאוחסן על RT ושימוש חוזר בניסויים הבאים לשבועות לפחות. אמנם יש נוסחות שונות המשמשות לייצור אגר עליון, אנו עושים העליונים אגר באמצעות 7G / L של אגר מעורבב עם קילו אגר עליון מקום באמבט המים C ° 60 כדי לשמר את המצב הנוזלי במהלך ניסוי.
  7. הפוך tהוא צלחת דגירה בטמפרטורה רצויה (טמפרטורה עד 30 מעלות צלזיוס) O / N 48 שעות. להשתנות בתנאים אלה כדי לייעל לפאגים הנוכחיים. פאגים המבודדים ביותר מגיעים מצלחות טופחו על 30 מעלות צלזיוס ב1-2.5 מ"מ CaCl ריכוז 2 לאחר תקופת דגירה 24 שעות.

4. הפאג טיהור

  1. לאחר בדיקת דגירה 24 שעות להיווצרות הפלאק על צלחות. המשך דגירה של עד 72 שעות אם לא לוחות ניכרים או כדי לקבוע אם לוחות נוספים יופיעו. במידת צורך, צלחות חנות עם שלטים המשוערת לתקופה של עד שבוע ב 4 ° C לפני שתמשיך.
    הערה: אין זה נדיר למצוא מגוון רחב של מורפולוגיות שלט שונות בצלחת אחת. מציאת לוחות לאחר 3 ימים של דגירה אפשרית אך נדיר.
  2. לטהר פאגים הרצויים מלוחות מבודדים באופן ברור בשיטת שלט פס. לגעת שלט עם מקל עץ סטרילי. Streak השלט על ידי הפעלת מקל עץ דרך להבה, allowing המקל להתקרר בקצרה, ולאחר מכן לשפשף את המקל על הצלחת אגר בתנועה העדינה, כפי שמוצג באיור 1. חזור על פעולה זו בעזרת מקל נקי לכל מעבר.
  3. לחלופין, השתמש בassay כייל שלט המסורתי לבודד את הפלאק הפאג בודד. Assay כייל השלט דורש שימוש בחומרים כימיים יותר כגון אגר LB ואגר העליון LB וחומרים כגון צלחות פטרי לבידוד לוחית הפאג. יש לנו הצלחה רבה בשיטת שלט פס אבל זה יותר קל מבחינה טכנית לבודד את הפלאק בודד באמצעות assay כייל שלט.
  4. ברגע שהצלחת אגר LB היא מפוספסת לפחות שלוש פעמים, סמן את השטח עם הריכוז הנמוך ביותר של חלקיקי phage משוערים ועדינות להחיל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter ו -4.5 מיליליטר של אגר העליון LB המותך (המכיל את אותו ריכוז של סידן כלורי כצלחת ההורה ) ולאפשר לו להתפשט באופן שווה על פני הצלחת.
  5. הפוך דגירה O צלחת / N. חזור על שלט הפסטכניקה לפחות שלוש חזרות כדי להבטיח מיני הפאג טהורים מבודדת. צלחות חנות ב 4 מעלות צלזיוס למשך עד שבוע לפי צורך בין פסים ללא אובדן משמעותי של כדאיות הפאג.
  6. לוחות רצויים ברגע שכבר גדלו ומבודדים על צלחת הפס הסופית, לגעת שלט אחד מבודד היטב עם טיפ micropipette מחדש להשעות ב 100 PB μl. סדרתי לדלל פתרון 10 0 זו לדילול 10 -8 על ידי העברת 20 μl של המדגם לμl 180 של PB הטרי.
  7. הוסף 10 μl של דילול כל 0.5 מיליליטר של Arthrobacter גדל בצינור תרבות במשך 5 עד 10 דקות ב RT וצלחת על ידי ערבוב החיידקים הנגועים עם 4.5 מיליליטר של אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl 2 משמש כדי לבודד את הפאג ממדגם הקרקע המקורי. שמור את כל דילולים נעשו על 4 מעלות צלזיוס עד ליום המחרת.
  8. לקבוע את דילול סדרתי הפאג צריך לעשות תבנית אינטרנט באמצעות כייל השלט המסורתי כאומר. המטרה של assay כייל השלט היא לקבוע את כייל הפאג צריך להשיג צלחת דפוס אינטרנט. לזהות צלחת דפוס אינטרנט כבעיקר נטולת חיידקים אך מכילה שאריות של חיידקים שעדיין לא lysed ידי פאגים. הוסף 5 מיליליטר של תרבות Arthrobacter מאוחר מעריכי / תחילת נייחת לבקבוק תרבות 50 מיליליטר סטרילי.
    1. הוספה של הדילול (שנתן דפוס אינטרנט לתרבות Arthrobacter) בבקבוק התרבות 100 μl ולאפשר פאגים להדביק את תאי חיידקים במשך 5 עד 10 דקות ב RT. מערבבים עם אגר העליון מותך LB המכיל את אותו הריכוז של CaCl 2 כבתחילה כדי לזהות את הפאג וצלחת 5 מיליליטר של תערובת זו על גבי 10 לוחות LB טריים. לאפשר לביסוס ודגירת צלחות הפוכות ב 30 מעלות צלזיוס.
  9. למחרת, להציף את צלחות דפוס האינטרנט עם 5 מיליליטר של PB וO חנות / N ב 4 ° C או 4 שעות בRT.
  10. סנן את lysate הפאג דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטרולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס. השתמש מניות הפאג זה סופי לניסויים נוספים כגון תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של חלקיקי הפאג, בידוד הדנ"א הגנומי הפאג לניתוח אנזים הגבלת DNA ורצף הגנומי באמצעות נהלים סטנדרטיים. לאחסון ארוך טווח של מניית הפאג, להוסיף כמות שווה של lysate הפאג לגליצרול סטרילי בבקבוקונים קטנים לאחסון בארכיון המניה ב -80 ° C.
    הערה: למי שלא חווה עם טכניקות הפאג אלה, משאב נהדר הוא אתר www.phagesdb.org הנגיש באינטרנט.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

כדי להדגים שחזור של טכניקת ההעשרה משופרת לפאגים Arthrobacter, 30 דגימות קרקע שונות שמשו בזמנים ובמקומות שונים באביב ובקיץ של שנת 2014 של דגימות קרקע 30 אלה פאגים Arthrobacter ייחודיים התקבלו משל 22 דגימות קרקע שנאספו באמצעות העשרה זו הליך. הליך ההעשרה הסטנדרטי הניב פאגים ייחודיים משל 3 אותו דגימות הקרקע. דגימות ההעשרה יכולה להיות כייל הפאג גבוה מאוד הזקוק לדילול ראשוני לבודד את לוחות או כייל הפאג נמוך יחסית הדורש נפח גדול יותר של Arthrobacter מועשר לזיהוי מוצלח של פלאק. אנו משתמשים בשיטת פס שלט לבודד אוכלוסיות הפאג טהורות לאחר העשרה ראשונית וציפוי על אגר LB (איור 2). לחלופין, assay כייל שלט הסטנדרטי מסורתי עשוי לשמש כדי לבודד בודד הפאג טהור למרות ששיטה זו לוקחת יותר זמן, חומרים כימיים, וחומרs. כפי שהוזכר קודם לכן, אנו עושים שימוש בassay כייל שלט כדי לקבוע באופן אמפירי מספרי כייל הפאג ומספר היחידות פלאק ויוצרים (PFUs) כדי ליצור דפוס חגורה על צלחת. איור 3 מתאר קבוצה של דילולים סדרתי עבור הפאג בננה ומדגימה ל אחת מהצלחות מה דפוס אינטרנט טוב צריך להיראות. איור 4 מתארים תמונות micrographic אלקטרונים של 20 פאגים Arthrobacter מבודדים באמצעות טכניקת ההעשרה. של פאגים 25 מבודדים כיום, 23 מהם siphoviruses עם זנבות ארוכים למדי. שניים מפאגים המבודדים הם myoviruses המכיל בקטרים ​​הראש דומים באורך לזה של זנבותיהם.

איור 1
סכמטי טכניקת צלחת איור 1. Streak משמש לבידוד של לוחות הפאג בודדים. הטלאי הצהוב מייצג את האזור בצלחת שLBאגר עליון בתוספת חיידקי פתרון צריך להיות שפכו בזהירות לצלחת לאחר פסי שלט הפאג הושלמו.

איור 2
איור 2. דוגמאות לטכניקת צלחת פס המשמשת לבידוד של לוחות להפאג אחד (דילן) בשלוש טמפרטורות שונות. שים לב שהפאג דילן מייצר לוחות דומים ב RT, 30 ° C ו -37 ° C. העיגולים האדומים על שתיים מהצלחות מקיפים לוחות בבירור מבודדים.

איור 3
הפאג איור 3. assay כייל לוחית. Arthrobacter הבננה הייתה סידורי מדולל בPB ומצופה על צלחות אגר כמפורט בסעיפים 4.6 & 4.7 של טקסט הפרוטוקול. מוצגים הם דילולים סדרתי T-4 ל- T-8 (מלמעלה). שים לב שהדילול הדואר T-5 (מלמטה למעלה) נתן דפוס אינטרנט עם רק כמות קטנה של דשא החיידקים עדיין נותר. דילולים סידוריים נמוכים יותר (T-1 ל- T-3) יצרו צלחות ברורות עם כל החיידקים lysed על ידי חלקיקי phage הפגינו חוסר כל התפתחות חיידקים.

איור 4
איור 4. תמונות micrographic אלקטרונים של 20 פאגים Arthrobacter מבודדים באמצעות טכניקת ההעשרה. התמונות צולמו באמצעות פיי Morgagni TEM. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

למרות ניסיונות רבים קודמים לבודד פאגים מסוגלים להדביק מארחי Arthrobacter, היו לנו הצלחה קטנה באמצעות הליכי העשרה סטנדרטיים. השיטה הכללית של העשרת חיידקים פיתחה והתאימה על ידי ואן Twest וKropinski 10 להעשיר פאגים מדגימות סביבתיות הוא הבסיס למרבית הליכי העשרה. ראיות ממחקרים קודמים מצביעות על כך ששיטות של ציפוי ישיר הפיקו לוחות זיהוי על זנים של Arthrobacter אם כי בשיעורי הצלחה נמוכים מאוד של בידוד 5. בשיטת הציפוי הישירה, פאגים מופקים מדגימות קרקע בחיץ הפאג ומסונן להסרת חיידקים מזהמים. התמצית המסוננת המכילה חלקיקי phage מתווספות למארח החיידקים הרצוי לאפשר זיהום תא מארח ומצופית בלי סיבובים נוספים של צמיחת חיידקים והגברת הפאג.

טכניקת ההעשרה שלנו היא חזקה וoptimized לבידוד קל יחסית של פאגים Arthrobacter מsp Arthrobacter. KY3901. עם נהלים מסורתיים העשרה, פאגים, יחד עם סוגים רבים ושונים של חיידקים הנמצאים בדגימות הקרקע, מופקים מאדמה במאגר הפאג והוסיף לתקשורת צמיחה טריות עם תאי חיידקים רצויים משמשים כמארח לזיהום phage. בשיטת ההעשרה, כל חיידקי האדמה יוסרו מן האדמה שחולצה דגימות הפאג על ידי סינון דרך מסנן 0.22 מיקרומטר. חלקיקי סטרילי המסוננים lysate המכיל הפאג, אך לא חיידקי קרקע, הם בדילול במרק 2x LB עם החיידקים הרצויים משמשים כמארח התפשטות הפאג. ההבדל העיקרי בין הליך ההעשרה שלנו ואחרים הוא שאין חיידקי אדמה מזהמים מתחרים על צמיחה עם חיידקי המארח בתקופת זמן הדגירה העשרה. המארח רק האדמה שחולצה הפאג יכול להדביק הוא זה של חיידקי מארח הרצויים ולכן maximizes פוטנציאל הצמיחה של חיידקי המארח וההגברה של פאגים מארח ספציפי הרצויים.

בפיתוח של ההליך המתואר כאן ניסינו לתת דין וחשבון להטיה סלקטיבית הגלומה בכל הליך העשרה על ידי בדיקת טווח של CaCl 2 ריכוזים 11. מה התברר הוא שחלק מבודד הפאג להראות הבדלים פיסיולוגיים תלויים בפרמטרים כמו הריכוז יוני סידן וטמפרטורה. לבידודי הפאג Arthrobacter עתיד אנו מתכננים בבדיקת גורמים מרכזיים כגון כמו pH, טמפרטורה, מליחות, חומרים מזינים, יוני מתכת דו הערכי לבודד פאגים מסוגלים להפיק במארחיהם בצורה אופטימלית בתנאים סביבתיים שונים.

אנו משתמשים טריים גדלו Arthrobacter תאים בניסוי זה. אנחנו לא משתמשים בתאים המגיעים לאמצע השלב נייח מאוחר של צמיחה מאז שהיינו לנו קושי בידוד הפאג או שיש titers הגון עם פאגים ידועים בההוא תקופת צמיחה. אחרים הראו עיכוב של זיהום הפאג בתאי Achromobacter שלב נייח 12 שעשויים להסביר את חוסר ההצלחה של בידוד פאגים שימוש בתאי חיידקים במרכז לשלב נייח מאוחר של צמיחה. היו לנו תרבויות הצלחה באמצעות ניסויים אלה עם צפיפות תאים בכל מקום בין 00 OD6 של 0.5 עד 0.9. תרבויות גדלו מאוחסנות על 4 מעלות צלזיוס והוא יכול לשמש לבידוד עד שבעה ימי הפאג. עם זאת, תאי Arthrobacter כבר מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס הנמוכה כייל ופרצו גודל של חלקיקי phage זיהומיות. תוצאות דומות נמצאו בשימוש בcoli Escherichia להדבקת 13 phageT4. לכן שימוש בתאי חיידקים בהקדם האפשרי לאחר שהם מגיעים לצמיחה הרצויה למקסימום את סיכויי קבלת הפאג רומן ממדגם אדמה.

באופן כללי, השימוש בטכניקה זו עם העשרת תקשורת LB צריך להוכיח להיות כמעטבלעדי לבידודה של פאגים Arthrobacter. בעוד LB היה תקן התעשייה עבור culturing א ' זני coli וחברים אחרים בEnterobacteriaceae, הוא תומכים בצמיחה של מגוון רחב של חיידקים בתנאים אירוביים 14. סביר להניח ההרכב העשיר המזינה של תקשורת LB ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להפיץ פאגים בקבוצה מגוונת מאוד של חיידקים אירוביים מניעת אתגרים טכניים מפוגע גילוי הפאג.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

מחברים מצהירים שום אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

מימון לפיתוח פרוטוקול זה מסופק על ידי דרום מזרח פנסילבניה Consortium להשכלה גבוהה וCabrini מכללת המחלקה למדע. מימון ותמיכה נוספים הגיעו מאוניברסיטת ארקדיה והאוניברסיטה של ​​תמה. תודה מיוחדת לד"ר קארן Snetselaar באוניברסיטת סנט ג'וזף לחביבות לוקח את תמונות אלקטרון המיקרוסקופיות של פאגים המבודדים שלנו. תמיכה נוספת מסופק על ידי ציידי המכון הרפואי הווארד יוז Alliance החינוך המדעי הפאג קידום Genomics ותכנית (SEA-פאגים) אבולוציונית מדע.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shapir, N., Mongodin, E. F., Sadowsky, M. J., Daugherty, S. C., Nelson, K. E., Wackett, L. P. Evolution of Catabolic Pathways: Genomic Insights into Microbial s-Triazine Metabolism. J Bacteriol. 189, (3), 674-682 (2007).
  2. Qingyan, L., Ying, L., Xikun, Z., Baoli, C. Isolation and Characterization of Atrazine Degrading Arthrobacter sp. AD26 and Use of this Strain in Bioremediation of Contaminated Soil. J Environ Sci. 20, 1226-1230 (2008).
  3. Wang, J., Zhu, L., Liu, A., Ma, T., Wang, Q., Xie, H., Wang, J., Jiang, T., Zhao, T. Isolation and characterization of an Arthrobacter sp. Strain HB-5 that Transforms Atrazine. Environ Geochem Hlth. 33, 259-266 (2011).
  4. Mages, I. S., Frodl, R., Bernard, K. A., Funke, G. Identities of Arthrobacter spp. And Arthrobacter-Like Bacteria Encountered in Human Clinical Specimens. J Clin Microbiol. 46, (9), 2980-2986 (2008).
  5. Brown, D. R., Holt, J. G., Pattee, P. A. Isolation and Characterization of Arthrobacter Bacteriophages and Their Application to Phage Typing of Soil Arthrobacters. Appl Environ Microbiol. 35, (1), 185-191 (1978).
  6. Petrovski, S., Seviour, R. J., Tillett, D. Prevention of Gordonia and Nocardia Stabilized Foam Formation by Using Bacteriophage GTE7. Appl Environ Microbiol. 77, (21), 7864-7867 (2011).
  7. Le Marrec, C., Moreau, S., Loury, S., Blanco, C., Trautwetter, a Genetic Characterization of Site-specific Integration Functions of phi AAU2 infecting “Arthrobacter aureus” C70. J Bacteriology. 178, (7), 1996-2004 (1996).
  8. Casida, L. E., Liu, K. C. Arthrobacter globiformis and Its Bacteriophage in Soil. J Appl Microbiol. 28, (6), 951-959 (1974).
  9. Einck, K. H., Pattee, P. A., Holt, J. G., Hagedorn, C., Miller, J. A., Berryhill, D. L. Isolation and Characterization of a Bacteriophage of Arthrobacter globiformis. J Virol. 12, (5), 1031-1033 (1973).
  10. Twest, R., Kropinski, A. M. Bacteriophage Enrichment from Soil and Water. Methods Mol Bio. 501, 15-21 (2009).
  11. Fullner, K. J., Hatfull, G. F. Mycobacteriophage L5 Infection of Mycobacterium bovis BCG: Implications for Phage Genetics in the Slow-growing Mycobacteria. Mol Microbiol. 26, (4), 755-766 (1997).
  12. Robb, S. M., Woods, D. R., Robb, F. T. Phage Growth Characteristics on Stationary Phase Achromobacter cells. J Gen Virol. 41, (2), 265-272 (1978).
  13. Bolger-Munro, M., Cheung, K., Fang, A., Wang, L. T4 Bacteriophage Average Burst Size Varies with Escherichia coli B23 Cell Culture Age. Journal of Experimental Microbiology and Immunology. 17, 115-119 (2013).
  14. MacWilliams, M. P., Liao, M. K. Luria Broth (LB) and Luria Agar, Media and Their Uses Protocol. ASM MicrobeLibrary. Available from: http://www.microbelibrary.org/library/laboratory-test/3020-luria-broth-lb-and-luria-agar-la-media-and-their-uses-escherichia-coli (2013).
טכניקת העשרה אופטימלית עבור הבידוד של<em&gt; Arthrobacter</em&gt; Bacteriophage מינים מדגימת הקרקע מבודדת
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter