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Environment

के अलगाव के लिए एक अनुकूलित संवर्धन तकनीक doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

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मिट्टी के वातावरण में Arthrobacter प्रजातियों की सर्वव्यापकता मेजबान जीवाणु की इस प्रजाति से अलग किया जा रहा करने में सक्षम फगेस की एक विशाल संख्या और विविधता प्रदान करता है। Acintobacteriaceae परिवार के बैक्टीरियल सदस्यों atrazine और विभिन्न अन्य कीटनाशकों और herbicides 1,2,3 की तरह अड़ियल यौगिकों अपमानजनक के अपने catabolic रास्ते के लिए सबसे उल्लेखनीय हैं। सबसे अनुसंधान Arthrobacter के पर्यावरण उपभेदों का उपयोग किया गया है, हालांकि, इस जीनस के नैदानिक ​​आइसोलेट्स रक्त, मूत्र, आँखें, और सभी वंशावली विविधता चार प्रदर्शित करने के लिए कई अन्य मानव स्रोतों में पाया जाता है।

Arthrobacter बैक्टीरिया पर शोध के लिए एक नहीं बल्कि व्यापक शरीर नहीं है, केवल कुछ अध्ययनों से इस विविध जीनस के सदस्यों को संक्रमित करने में सक्षम फगेस पर रिपोर्ट। दिलचस्प बात यह है, हालांकि Arthrobacter पर पहले से किए गए कार्य <ऐसी मिट्टी की टाइपिंग के रूप में कई महत्वपूर्ण अलग विषयों पर छू फगेसउन्हें> Arthrobacter प्रजातियों सक्रिय कीचड़ उपचार संयंत्रों 6 में हानिकारक फोम कम करने, और कार्य स्थल विशिष्ट पुनर्संयोजन और इंटिग्रेस जीन 7 उजागर करने का उद्देश्य के साथ 5, औद्योगिक उपयोग करता है।

विभिन्न संवर्धन तकनीक प्रोटोकॉल शुद्ध फेज Arthrobacter प्रजातियों में आइसोलेट्स उत्पन्न करने के लिए नियोजित किया गया है। प्रारंभिक प्रक्रियाओं केवल संक्रमित करने में सक्षम फगेस के लिए 8 वर्ष से अधिक जन्म देने की अवधि के लिए निकोटीन लवण की तरह जोड़ा विषाक्त एजेंटों के साथ मिट्टी की incubations शामिल globiformis। अस्थिर ऑर्गेनिक्स पट्टिका परख तकनीक के माध्यम से detectable फगेस निर्माण करने के लिए दिखाई दिया साथ मिट्टी का उपयोग किया स्टडीज लंबा ऊष्मायन अवधि 8 को छोड़ते हुए, percolated। दिलचस्प बात यह है, हालांकि प्रत्यक्ष चढ़ाना जैसी तकनीक कम सफलता दर के साथ पिछले अध्ययनों का हवाला देते हुए, अभी भी जांचकर्ताओं 5 से एक विशेष रूप से कम सफलता दर जबकि कई फगेस को जन्म देने के अतीत में इस्तेमाल किया गया था

कुल मिलाकर, अतीत में इस्तेमाल अलगाव की तकनीक सबसे आम एरोबिक मिट्टी का प्रतिनिधित्व Arthrobacter जीनस के बावजूद व्यवहार में थोड़ा प्रभावकारिता होने के लिए उल्लेखनीय थे प्रकृति 4,9 में अलग-थलग, पानी और मिट्टी से फगेस के लिए अलग वैन Twest और Kropinski 10 उपस्थित संवर्धन विधियों पर्यावरण बैक्टीरियल आइसोलेट्स लेकिन इन संवर्धन तकनीक को समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल पहले तकनीक से अनुकूलित Arthrobacter फगेस अलग-थलग करने में अक्षम साबित हुई। यहाँ वर्णित विधि का उद्देश्य जल्दी संवर्धन तरीकों को लगातार और प्रभावी ढंग से इस जीवाणु जीनस से फगेस अलग-थलग करने के साथ जुड़े पिछले तकनीकी चुनौतियों पर काबू पाने, Arthrobacter फगेस अलग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है कि "अवधारणा के सबूत 'दिखाने के लिए है।

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Protocol

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फेज अलगाव के लिए Arthobacter प्रकोष्ठों के 1. तैयारी

  • संस्कृति Arthrobacter सपा। KY3901 कालोनियों 2-3 दिनों के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated एक Luria Bertaini (पौंड) अगर प्लेट पर रेखादार। एक कॉलोनी उठाओ और 30 डिग्री सेल्सियस पर 225 rpm पर एक मिलाते इनक्यूबेटर में एक चकित संस्कृति फ्लास्क में लेग शोरबा के 250 मिलीलीटर के लिए इसे जोड़ने के लिए और सेते एक बाँझ पाश का उपयोग करें।
  • विकास की लगभग 24 घंटा फेज संक्रमण प्रयोगों के लिए देर से जल्दी / घातीय स्थिर चरण कोशिकाओं को प्राप्त करने की अनुमति दें। देर से स्थिर विकास राज्य के लिए मध्य में प्रवेश करने से कोशिकाओं को रोकने के लिए बारीकी से बैक्टीरिया विकास की स्थिति की निगरानी।
    नोट: सेल के विकास में नीचे वर्णित फेज अलगाव और शुद्धि प्रक्रियाओं / चरणों के लिए 0.5-.0.7 के बीच एक ऑप्टिकल घनत्व 600 आयुध डिपो से मिलकर चाहिए।

मिट्टी के नमूने से फेज 2. संग्रह

  1. इच्छित स्थान से मिट्टी के 200-400 जी को इकट्ठा करो। नोट: Arthroba में बैक्टीरिया के बादcter जीनस उन्हें संक्रमित कि फगेस में पाया जाता है और मिट्टी के सबसे प्रकार में व्यापक रहे हैं हो सकता है कि वे और आम मिट्टी बैक्टीरिया होते हैं।
  2. पीबी है की इतना है कि कम से कम 200 मिलीलीटर मिट्टी को फेज बफर (पंजाब) [68 मिमी NaCl, 10 मिमी MgSO 4, 10 मिमी Tris-सीएल (पीएच 7.5)] के कम से कम 400 मिलीलीटर जोड़ें और एक बड़ा पर्याप्त फ्लास्क में मिश्रण सतह पर तैरनेवाला में और निकाला जा करने में सक्षम है।
  3. मिट्टी को निलंबित कर दिया गया है जब तक धीरे सरगर्मी या घूमता द्वारा मिक्स और मिट्टी तलछट, आम तौर पर 30 मिनट के व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं।
  4. मिट्टी तलछट मलबे को हटाने के गुरुत्वाकर्षण निस्पंदन द्वारा फिल्टर पेपर के माध्यम से 'मिट्टी निकालने "पास।
  5. लेग पाउडर जोड़ें और एक 2% समाधान (200 मिलीलीटर मिट्टी निकालने में 4 जी लेग पाउडर) बनाने के लिए मिश्रण।
  6. एक बाँझ छानना प्राप्त करने के लिए वैक्यूम निस्पंदन द्वारा 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से समाधान गुजरती हैं। यदि संभव हो तो, तुरंत 2.7 कदम पर जारी है। व्यवहार्य फेज कणों की, स्टोर आगे बढ़ने से पहले एक सप्ताह तक के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने फ़िल्टर्ड अगर जरूरत हो, हालांकि, संख्याकम कर दिया जाएगा।
  7. विभाज्य कई सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर चकित संस्कृति बोतल मिलाते हुए निष्फल व्यक्ति 250 मिलीलीटर में फिल्टर निष्फल पौंड / मिट्टी निकालने के मिश्रण के 50 मिलीलीटर अंश। अलग Arthrobacter फगेस अलग 2 CaCl शर्तों के तहत बेहतर बढ़ने के बाद अंतिम वांछित सांद्रता (0-50 मिमी) बाँझ 2.0 एम 2 CaCl समाधान जोड़ें।
    नोट: हम हमारे द्वारा की पहचान की Arthrobacter फगेस के बहुमत 1 मिमी 2.5 मिमी 2 CaCl की सीमा के भीतर कर रहे हैं कि लगता है। हालांकि, पृथक फगेस के कई बहुत उच्च 2 CaCl सांद्रता में 0 मिमी 2 CaCl .or पर विशेष रूप से हमें की वृद्धि हुई। 3.1 कदम करने के लिए तुरंत आगे बढ़ें।

3. फेज अलगाव

  1. बोतल से प्रत्येक के लिए देर से जल्दी / घातीय स्थिर चरण बैक्टीरिया संस्कृति की 1-2.5 मिलीलीटर जोड़ें। 0.5-0.7 एक आयुध डिपो 600 के लिए, कोशिकाओं के 1 मिलीलीटर का उपयोग करें। 0.7 के एक आयुध डिपो से अधिक एक आयुध डिपो 600 के लिए 2.5 मिलीलीटर का उपयोगकोशिकाओं।
    नोट: घातीय चरण विकास में कोशिकाओं आम तौर पर अधिक फगेस और स्थिर चरण विकास में कोशिकाओं की तुलना में अधिक titers निकलेगा।
  2. एक मिलाते इनक्यूबेटर में लगभग 24 घंटे के लिए 30 डिग्री सेल्सियस पर 250 rpm पर बोतल हिला।
  3. एक 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद मिलाते इनक्यूबेटर से संवर्धन बोतल को हटाने और संवर्धन के नमूने फेज बफर में दस गुना पतला।
  4. देर से जल्दी / घातीय स्थिर चरण बैक्टीरिया संस्कृति के 0.5 मिलीलीटर के साथ संस्कृति ट्यूब की स्थापना की और विभिन्न संवर्धन संस्कृति की मात्रा संस्कृति ट्यूबों के लिए (पंजाब में एक 10 -1 कमजोर पड़ने के 500 μl के लिए 5 μl) जोड़ें।
    नोट: यह प्रत्येक मिट्टी नमूना संवर्धन के बाद अलग-अलग फेज titers उत्पन्न करता है के बाद से सांद्रता की एक विस्तृत श्रृंखला का परीक्षण करने की सलाह दी जाती है।
  5. मूल संवर्धन फ्लास्क में एकाग्रता पेश करने के लिए एक अंतिम एकाग्रता को बराबर करने की संस्कृति ट्यूबों के लिए 2 CaCl जोड़ें। डब्ल्यू कई फगेस के लिए चयन करने के लिए अलग-अलग 2 CaCl सांद्रता की एक श्रेणी का उपयोगith 2 CaCl निर्भरता बदलती।
    नोट: अधिकांश फगेस 1-2.5 मिमी के 2 CaCl सीमा के भीतर अलग-थलग कर दिया जाएगा, लेकिन 0-50 मिमी 2 CaCl सांद्रता से कहीं भी सबसे बेहतर पृथक फगेस कर रहे हैं। इस वजह से यह अद्वितीय पृथक Arthrobacter फगेस की संख्या को अधिकतम करने के लिए 2 CaCl सांद्रता की एक श्रृंखला की जांच करने के लिए सबसे अच्छा है।
  6. संस्कृति ट्यूब में लेग शीर्ष अगर की 4.5 मिलीलीटर मिक्स और एक लेग अगर थाली पर मिश्रण डालना। समान रूप से थाली भर में वितरित करने और लगभग 15 मिनट के लिए जमना को शीर्ष अगर के लिए अनुमति देने के लिए धीरे भंवर।
    नोट: अगर बड़े बैचों (250 मिलीलीटर) और अतिरिक्त शीर्ष अगर में तैयार किया जा सकता शीर्ष आरटी पर संग्रहीत और कम से कम दो सप्ताह के लिए बाद के प्रयोगों के लिए पुन: उपयोग किया जा सकता है। शीर्ष अगर बनाने के लिए इस्तेमाल अलग फार्मूले हैं हालांकि, हम पौंड के साथ मिश्रित अगर की 7g / एल का उपयोग करते हुए अगर शीर्ष बनाना एक 60 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह शीर्ष अगर एक प्रयोग के दौरान तरल अवस्था बनाए रखने के लिए।
  7. उलटें टीवह थाली और वांछित तापमान 48 घंटा के लिए (तापमान 30 डिग्री सेल्सियस) हे / एन पर सेते हैं। वर्तमान फगेस के लिए अनुकूलन करने के लिए इन शर्तों को बदलती हैं। सबसे अलग फगेस एक 24 घंटा ऊष्मायन अवधि के बाद 1-2.5 मिमी 2 CaCl एकाग्रता में 30 डिग्री सेल्सियस पर incubated प्लेटों से आते हैं।

4. फेज शुद्धीकरण

  1. प्लेटों पर पट्टिका गठन के लिए एक 24 घंटा ऊष्मायन जांच के बाद। कोई सजीले स्पष्ट कर रहे हैं अगर अप करने के लिए 72 घंटे के लिए ऊष्मायन जारी रखें या अतिरिक्त सजीले टुकड़े दिखाई देगा तो यह निर्धारित करने के लिए। एक सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर पूर्व कार्यवाही करने के लिए ख्यात सजीले टुकड़े के साथ, स्टोर प्लेटें अगर जरूरत है।
    नोट: यह एक प्लेट पर अलग पट्टिका morphologies की एक किस्म को खोजने के लिए असामान्य नहीं है। ऊष्मायन के तीन दिनों के बाद सजीले टुकड़े ढूँढना संभव है, लेकिन दुर्लभ है।
  2. लकीर पट्टिका विधि का उपयोग स्पष्ट रूप से अलग-थलग सजीले टुकड़े से वांछित फगेस शुद्ध। एक बाँझ लकड़ी की छड़ी के साथ एक पट्टिका को स्पर्श करें। स्ट्रीक, एक लौ के माध्यम से एक लकड़ी की छड़ी चल allowin द्वारा पट्टिकाजी छड़ी संक्षिप्त शांत, और चित्रा 1 में दिखाया गया है तो कोमल प्रस्ताव में अगर प्लेट पर छड़ी मलाई। प्रत्येक पारित करने के लिए एक साफ स्टिक के इस्तेमाल से यह दोहराना।
  3. वैकल्पिक रूप से, अलग-अलग फेज सजीले टुकड़े को अलग-थलग करने के लिए परंपरागत पट्टिका अनुमापांक परख का उपयोग करें। पट्टिका अनुमापांक परख ऐसे फेज पट्टिका अलगाव के लिए पेट्री प्लेटों के रूप में इस तरह के लेग अगर और लेग शीर्ष अगर और सामग्री के रूप में अधिक अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता है। हम लकीर पट्टिका विधि का उपयोग अत्यधिक सफल रहे हैं, लेकिन यह पट्टिका अनुमापांक परख का उपयोग व्यक्तिगत सजीले टुकड़े को अलग-थलग करने के लिए तकनीकी रूप से आसान है।
  4. लेग अगर थाली में कम से कम तीन बार परेशान कर रहा है एक बार, ख्यात फेज कणों की सबसे कम एकाग्रता के साथ क्षेत्र के निशान और धीरे से माता-पिता की थाली के रूप में कैल्शियम क्लोराइड का एक ही एकाग्रता युक्त (Arthrobacter के 0.5 मिलीग्राम और पिघला हुआ पौंड शीर्ष अगर की 4.5 मिलीलीटर लागू ) और यह थाली भर में समान रूप से फैला देते हैं।
  5. पलटना और / एन थाली हे सेते हैं। लकीर पट्टिका दोहराएँएक शुद्ध फेज प्रजातियों सुनिश्चित करने के लिए कम से कम तीन iterations के लिए तकनीक अलग है। फेज व्यवहार्यता का महत्वपूर्ण नुकसान के बिना धारियाँ के बीच की जरूरत एक सप्ताह तक के रूप में के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर प्लेटें।
  6. एक बार वांछित सजीले अंतिम लकीर थाली पर वृद्धि हुई है और अलग-थलग कर दिया गया है, एक micropipette टिप के साथ एक अच्छी तरह से पृथक पट्टिका को छूने और 100 μl पंजाब में फिर से निलंबित। क्रमानुसार ताजा पंजाब के 180 μl में नमूने के 20 μl गुजर द्वारा 10 -8 कमजोर पड़ने के लिए इस 10 0 समाधान बाहर पतला।
  7. फेज अलग करने के लिए इस्तेमाल किया 2 CaCl का एक ही एकाग्रता युक्त पिघला हुआ पौंड शीर्ष अगर की 4.5 मिलीग्राम से संक्रमित बैक्टीरिया के मिश्रण से 10 आरटी पर न्यूनतम और थाली करने के लिए 5 के लिए एक संस्कृति ट्यूब में उगाई Arthrobacter के 0.5 मिलीलीटर के लिए प्रत्येक कमजोर पड़ने के 10 μl जोड़ें मूल मिट्टी के नमूने से। अगले दिन जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर किए गए सभी dilutions के बचाओ।
  8. पारंपरिक पट्टिका अनुमापांक के रूप में उपयोग करते हुए एक वेब पैटर्न बनाने के लिए आवश्यक फेज धारावाहिक कमजोर पड़ने का निर्धारण करते हैंबोलो। पट्टिका अनुमापांक परख करने के उद्देश्य से एक वेब पैटर्न प्लेट प्राप्त करने की आवश्यकता फेज अनुमापांक निर्धारित करने के लिए है। के रूप में ज्यादातर बैक्टीरिया से रहित है, लेकिन अभी तक फगेस द्वारा lysed नहीं किया गया है कि बैक्टीरिया के अवशेष से युक्त एक वेब पैटर्न प्लेट को पहचानें। एक बाँझ 50 मिलीलीटर संस्कृति कुप्पी के लिए देर से जल्दी / घातीय स्थिर Arthrobacter संस्कृति के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    1. संस्कृति फ्लास्क में कमजोर पड़ने (कि Arthrobacter संस्कृति के लिए एक वेब पैटर्न दिया) के 100 μl जोड़ें और फगेस आरटी पर 5 से 10 मिनट के लिए बैक्टीरिया की कोशिकाओं को संक्रमित करने की अनुमति देते हैं। शुरू में फेज की पहचान करने और 10 ताजा लेग प्लेटों पर इस मिश्रण के 5 मिलीलीटर थाली करने के लिए प्रयोग किया जाता है के रूप में 2 CaCl का एक ही एकाग्रता युक्त पिघला हुआ पौंड शीर्ष अगर साथ मिलाएं। जमना और 30 डिग्री सेल्सियस पर औंधा प्लेटों सेते दें।
  9. अगले दिन, 4 डिग्री सेल्सियस पर पंजाब और दुकान हे / एन के 5 मिलीलीटर या आरटी पर चार घंटा के साथ वेब पैटर्न प्लेटें बाढ़।
  10. 0.22 सुक्ष्ममापी सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फेज lysate फ़िल्टरऔर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। ऐसे फेज कणों की इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों, मानक प्रक्रियाओं का उपयोग डीएनए प्रतिबंध एंजाइम विश्लेषण और जीनोमिक अनुक्रमण के लिए फेज जीनोमिक डीएनए अलगाव के रूप में अतिरिक्त प्रयोगों के लिए इस अंतिम फेज स्टॉक का उपयोग करें। फेज शेयर की लंबी अवधि के भंडारण के लिए, -80 डिग्री सेल्सियस पर शेयर संग्रह करने के लिए छोटी शीशियों में बाँझ ग्लिसरॉल को फेज lysate के एक बराबर राशि जोड़ें।
    नोट: ये फेज तकनीक के साथ अनुभव नहीं है उन लोगों के लिए, एक महान संसाधन ऑनलाइन सुलभ www.phagesdb.org वेबसाइट है।

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Representative Results

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Arthrobacter फगेस के लिए सुधार संवर्धन तकनीक के reproducibility प्रदर्शित करने के लिए, 30 अलग मिट्टी के नमूने अद्वितीय Arthrobacter फगेस इस संवर्धन का उपयोग कर एकत्र मिट्टी के नमूने के 22 से प्राप्त किया गया इन 30 मृदा नमूनों के 2014 के वसंत और गर्मियों के दौरान अलग-अलग समय और स्थानों पर किया गया प्रक्रिया। मानक संवर्धन प्रक्रिया एक ही मिट्टी के नमूने के 3 से अद्वितीय फगेस झुकेंगे। संवर्धन नमूने सजीले टुकड़े या सजीले टुकड़े के सफल पता लगाने के लिए समृद्ध Arthrobacter की एक बड़ी मात्रा की आवश्यकता होती है एक अपेक्षाकृत कम फेज अनुमापांक अलग करने के लिए प्रारंभिक कमजोर पड़ने की जरूरत के एक बहुत ही उच्च फेज अनुमापांक हो सकता है। हम प्रारंभिक संवर्धन और लेग अगर पर चढ़ाना (चित्रा 2) के बाद शुद्ध फेज आबादी को अलग करने के लिए पट्टिका लकीर विधि का उपयोग करें। वैकल्पिक रूप से, एक पारंपरिक मानक पट्टिका अनुमापांक परख इस विधि के लिए और अधिक समय, अभिकर्मकों, और सामग्री लेता है, हालांकि एक शुद्ध फेज को अलग अलग करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैएस। पहले उल्लेख किया है, हम। Empirically का एक थाली पर एक बद्धी पैटर्न फार्म को फेज अनुमापांक संख्या और पट्टिका गठन इकाइयों (PFUs) की संख्या निर्धारित करने के लिए पट्टिका अनुमापांक परख का उपयोग कर 3 चित्रा फेज केले के लिए धारावाहिक dilutions का एक सेट को दर्शाया गया है और के लिए यह दर्शाता है एक अच्छा वेब पैटर्न की तरह दिखना चाहिए प्लेटों में से एक। संवर्धन तकनीक का उपयोग कर अलग 4 से 20 Arthrobacter फगेस के इलेक्ट्रॉन micrographic छवियों को दर्शाया गया है चित्रा। वर्तमान में अलग-थलग 25 फगेस की, उनमें से 23 बल्कि लंबी पूंछ के साथ siphoviruses हैं। पृथक फगेस के दो लंबाई में अपनी पूंछ के समान सिर व्यास युक्त myoviruses हैं।

चित्र 1
अलग-अलग फेज सजीले टुकड़े के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया चित्रा 1. स्ट्रीक थाली तकनीक योजनाबद्ध। पीला सितारा प्लेट पर क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है कि लेगफेज पट्टिका streaking पूरा हो गया है के बाद शीर्ष अगर प्लस बैक्टीरिया समाधान ध्यान से थाली पर डाला जाना चाहिए।

चित्र 2
चित्रा तीन अलग अलग तापमान पर एक फेज (डायलन) के लिए सजीले टुकड़े के अलगाव के लिए इस्तेमाल किया लकीर थाली तकनीक 2. उदाहरण हैं। कि डायलन आरटी पर समान सजीले टुकड़े का उत्पादन फेज 30 डिग्री सेल्सियस और 37 डिग्री सेल्सियस पर ध्यान दें। प्लेटों में से दो पर लाल हलकों स्पष्ट रूप से अलग-थलग सजीले टुकड़े चारों ओर।

चित्र तीन
चित्रा 3. फलक अनुमापांक परख। Arthrobacter फेज केले वर्गों 4.6 और प्रोटोकॉल पाठ का 4.7। दिखाया में वर्णित के रूप में पंजाब में पतला और अगर प्लेटों पर चढ़ाया धारावाहिक था (ऊपर से) टी-4 टी-8 के लिए धारावाहिक dilutions कर रहे हैं। गु नोटई टी -5 कमजोर पड़ने (नीचे से ऊपर) अभी भी शेष बैक्टीरियल लॉन की एक छोटी राशि के साथ एक वेब पैटर्न दे दी है। (टी 1 टी-3 के लिए) लोअर धारावाहिक dilutions किसी भी बैक्टीरिया विकास की कमी के द्वारा प्रदर्शन किया फेज कणों द्वारा lysed बैक्टीरिया के सभी के साथ स्पष्ट प्लेटें बनाया।

चित्रा 4
चित्रा 20 Arthrobacter फगेस 4. इलेक्ट्रॉन micrographic छवियों संवर्धन तकनीक का उपयोग कर अलग। छवियों को एक फी Morgagni मंदिर का उपयोग कर लिया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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पिछले कई प्रयासों के Arthrobacter मेजबानों संक्रमित करने में सक्षम फगेस को अलग करने के बावजूद, हम मानक संवर्धन प्रक्रियाओं का उपयोग थोड़ी सफलता मिली। विकसित और पर्यावरण के नमूनों से फगेस को समृद्ध करने के लिए वैन Twest और Kropinski 10 द्वारा रूपांतरित बैक्टीरियल संवर्धन की सामान्यीकृत विधि संवर्धन प्रक्रियाओं के बहुमत के लिए आधार बनी हुई है। पिछले अध्ययनों से साक्ष्य प्रत्यक्ष चढ़ाना के तरीकों अलगाव 5 में से बहुत कम सफलता दर के साथ यद्यपि Arthrobacter के तनाव पर पहचाने जाने सजीले टुकड़े का उत्पादन किया है कि पता चलता है। प्रत्यक्ष चढ़ाना विधि के साथ, फगेस एक फेज बफर में मिट्टी के नमूने से निकाले और contaminating बैक्टीरिया को दूर करने के लिए छान रहे हैं। फेज कणों से युक्त फ़िल्टर्ड निकालने मेजबान सेल संक्रमण अनुमति देने के लिए वांछित बैक्टीरिया होस्ट करने के लिए जोड़ा गया है और बैक्टीरिया विकास और फेज प्रवर्धन के अतिरिक्त राउंड के बिना चढ़ाया जाता है।

हमारे संवर्धन तकनीक मजबूत और सेशन हैArthrobacter सपा। KY3901 से Arthrobacter फगेस के अपेक्षाकृत आसान अलगाव के लिए timized। मिट्टी के नमूने में मौजूद बैक्टीरिया के कई अलग अलग प्रकार के साथ पारंपरिक संवर्धन प्रक्रियाओं, फगेस, के साथ, फेज बफर में मिट्टी से निकाले जाते हैं और फेज संक्रमण के लिए मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया वांछित बैक्टीरियल कोशिकाओं के साथ नए सिरे से विकास मीडिया के लिए कहा। मिट्टी 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से निस्पंदन द्वारा फेज नमूने निकाले से संवर्धन विधि के साथ, सब मिट्टी बैक्टीरिया को हटा रहे हैं। बाँझ फ़िल्टर्ड lysate युक्त फेज कणों, लेकिन नहीं मिट्टी बैक्टीरिया, फेज प्रचार मेजबान के रूप में इस्तेमाल किया वांछित बैक्टीरिया के साथ 2x लेग शोरबा में पतला कर रहे हैं। हमारे संवर्धन प्रक्रिया और अन्य लोगों के बीच मुख्य अंतर यह है कि संवर्धन ऊष्मायन समय अवधि के दौरान मेजबान बैक्टीरिया के साथ विकास के लिए प्रतिस्पर्धा सं contaminating मिट्टी बैक्टीरिया है कि वहाँ है। केवल मेजबान मिट्टी को संक्रमित कर सकता फेज वांछित मेजबान बैक्टीरिया और इसलिए यह है कि निकाले maximiवांछित मेजबान विशिष्ट फगेस के मेजबान बैक्टीरिया और प्रवर्धन की विकास क्षमता zes।

यहाँ वर्णित प्रक्रिया के विकास में हम 2 CaCl सांद्रता 11 की एक श्रृंखला के परीक्षण के द्वारा किसी भी संवर्धन प्रक्रिया में निहित चुनिंदा पूर्वाग्रह के लिए खाते में करने का प्रयास किया। क्या स्पष्ट हो गया कि कुछ फेज वियोजन कैल्शियम आयन एकाग्रता और तापमान जैसे मानकों पर निर्भर शारीरिक मतभेद है कि शो है। भविष्य Arthrobacter फेज isolations के लिए हम इस तरह के पीएच, तापमान, लवणता, पोषक तत्वों, बेहतर विभिन्न पर्यावरणीय परिस्थितियों के तहत उनके मेजबानों में reproducing में सक्षम फगेस को अलग करने के द्विसंयोजक धातु आयनों की तरह के रूप में प्रमुख कारकों का परीक्षण पर योजना है।

हम हौसले इस प्रयोग में कोशिकाओं Arthrobacter उगाया का उपयोग करें। हम कठिनाई वें पर जाना जाता फगेस के साथ सभ्य titers के फेज अलग-थलग करने या होने के लिए किया है के बाद से विकास की देर स्थिर चरण के लिए मध्य तक पहुँचने कि कोशिकाओं का उपयोग नहीं करतेविकास की अवधि है। दूसरों के विकास की देर स्थिर चरण के लिए बीच में बैक्टीरियल कोशिकाओं का उपयोग फगेस अलग-थलग करने की सफलता की कमी समझा जा सकता है, जो स्थिर चरण Achromobacter कोशिकाओं 12 में फेज संक्रमण की एक अवरोध दिखाई है। हम 0.5-0.9 की एक OD6 00 से कहीं भी एक सेल घनत्व के साथ इन प्रयोगों के लिए सफलता का उपयोग कर संस्कृतियों पड़ा है। ग्रोन संस्कृतियों 4 डिग्री सेल्सियस पर जमा हो जाती है और ऊपर से सात दिनों के लिए फेज अलगाव के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, अब Arthrobacter कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस कम अनुमापांक पर संग्रहीत और संक्रामक फेज कणों का आकार फट रहे हैं। इसी तरह के परिणाम phageT4 13 के संक्रमण के लिए Escherichia कोलाई उपयोग करने के साथ पाए गए। वे वांछित वृद्धि एक मिट्टी के नमूने से एक उपन्यास फेज प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम हो पाता तक पहुँचने के बाद, इसलिए जितनी जल्दी हो सके बैक्टीरियल कोशिकाओं का उपयोग कर।

मोटे तौर पर, लेग मीडिया के साथ इस संवर्धन तकनीक के उपयोग से बोल रहा हूँ शायद ही साबित करना चाहिएArthrobacter फगेस के अलगाव के लिए विशेष। लेग संवर्धन के लिए उद्योग मानक किया गया है जबकि कोलाई उपभेदों और Enterobacteriaceae के अन्य सदस्यों, यह एरोबिक शर्तों 14 में बैक्टीरिया की एक विस्तृत विविधता के विकास का समर्थन करता है। लेग मीडिया के पोषक तत्व अमीर रचना की संभावना फेज खोज निरोधक से तकनीकी चुनौतियों को रोकने एरोबिक बैक्टीरिया की एक अविश्वसनीय रूप से विविध समूह में फगेस का प्रचार करने के लिए इस विधि में इस्तेमाल किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा।

Acknowledgments

इस प्रोटोकॉल के विकास के लिए अनुदान उच्च शिक्षा के लिए दक्षिण पेंसिल्वेनिया कंसोर्टियम और Cabrini कॉलेज ऑफ साइंस विभाग द्वारा प्रदान किया गया। अतिरिक्त धन और समर्थन आर्केडिया विश्वविद्यालय और Immaculata विश्वविद्यालय से आया था। हम विशेष रूप से कृपया हमारी पृथक फगेस की इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म छवियों को लेने के लिए सेंट जोसेफ विश्वविद्यालय में डॉ करेन Snetselaar धन्यवाद। अतिरिक्त सहायता जीनोमिक्स और विकासवादी साइंस (सागर-फगेस) कार्यक्रम में आगे बढ़ने के हॉवर्ड ह्यूजेस मेडिकल इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एजुकेशन एलायंस फेज शिकारी द्वारा प्रदान की गई थी।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

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References

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के अलगाव के लिए एक अनुकूलित संवर्धन तकनीक<em&gt; Arthrobacter</em&gt; जीवाणुभोजी प्रजाति मिट्टी का नमूना आइसोलेट्स से
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Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

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