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Environment

の単離のための最適化された濃縮技術 doi: 10.3791/52781 Published: April 9, 2015

Introduction

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土壌環境でのロバクター普遍性は、宿主細菌のこの種から単離されることができるファージの膨大な数と多様性を提供しています。 Acintobacteriaceaeファミリーの細菌メンバーは、アトラジン、様々な他の殺虫剤や除草剤の1,2,3のような扱いにくい化合物を分解することが彼らの異化経路のための最も注目すべきである。ほとんどの研究は、 アルスロバクターの環境の株を用いて行われたが、この属の臨床分離株は、血液、尿、目、すべての系統発生異質4を表示する他の多くのヒト供給源において見出される。

アースロバクター菌の研究のかなり大規模なボディがありますが、唯一の少数の研究は、この多様な属のメンバーに感染することができるのファージについて報告する。興味深いことにしかし、 アルスロで以前に行われた作業は、土壌のタイピングなど、いくつかの重要な個別のトピックにタッチをファージを<em>のアルスロバクター種5、活性汚泥処理プラント6、及び作業強調部位特異的組換えおよびインテグラーゼ遺伝子7において有害な泡の低減を目的と工業用途。

様々な濃縮技術プロトコルは、純粋なファージは、 アルスロバクター種において単離生成するために使用されてきた。初期の手順は、1年以上8の期間のためのニコチン塩のような追加された有毒物質しかA.に感染することできるのファージを生じさせるとともに、土壌のインキュベーションを含むスロバクター 。不安定な有機物が長い潜伏期間を8を省略 、プラークアッセイ技術により検出可能なファージを生成するために登場して土を使用して行われた研究は、パーコレート。興味深いことに、ダイレクトプレーティングに似た手法は、低い成功率の過去の研究を引用して、まだ研究者5によって著しく低い成功率を有しながら、いくつかのファージを生じる過去に使用した

全体的に、過去に使用される分離技術は、最も一般的な好気性土壌を表すロバクター属にもかかわらず、実際にはほとんど効 ​​果を持つために注目すべきであったが、自然4,9に隔離する水や土壌からファージを単離するためのヴァンTwestとKropinski 10現在の濃縮方法環境細菌分離株が、これらの濃縮技術を豊かにするために使用される以前の技術から適応は、 アルスロファージを単離する非効率的な証明した。ここで説明する方法の目的は、初期の濃縮方法は、この細菌属からファージを単離することに関連した以前の技術的な課題を克服し、一貫して効果的にアースロファージを分離するように適合させることができることを「コンセプトの証明」を示すことです。

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Protocol

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ファージを単離するためのArthobacter細胞の作製

  • 文化アースロバクター·エスピー KY3901コロニーは2〜3日間30℃でインキュベートルリアBertaini(LB)寒天プレート上にストリーク。コロニーを採取し、バッフル培養フラスコ中のLBブロス250ミリリットルに追加し、30℃で225rpmで振盪インキュベーター中でインキュベートし、滅菌ループを使用。
  • ファージ感染実験のために後半早い/指数関数定常期の細胞を得るための成長の約24時間を許可します。後半定常成長状態に真ん中に入るから細胞を防ぐために密接に細菌増殖の状態を監視します。
    注:細胞増殖は、後述するファージの単離および精製手順/ステップのために0.5-.0.7間の光学濃度OD 600で構成する必要があります。

土壌サンプルからのファージの2コレクション

  1. 目的の場所から土壌の200〜400グラムを収集します。注:Arthroba中の細菌以来CTER属は、それらを感染させるファージに見出され、土壌のほとんどの種類に普及していることができる一般的な土壌細菌である。
  2. 土壌へのファージバッファ(PB)[68 mMの塩化ナトリウム、10mMのMgSO 4を、10mMのTris-CL液(pH7.5)]の少なくとも400 mlを加えPBの少なくとも200ミリリットルになるように十分な大きさのフラスコ内で混合上清中および抽出することが可能である。
  3. 土壌が中断されるまで、静かに撹拌または旋回により混合し、土壌の堆積物は、典型的には30分を決済することができます。
  4. 土壌堆積物の破片を除去する重力濾過により濾紙を通して「土壌抽出」を渡す。
  5. LB粉末を追加して、2%溶液(200ミリリットル土壌抽出物中の4グラムLB粉末)を作るために混合する。
  6. 無菌の濾液を得、真空濾過により0.22μmのフィルターを通して溶液を通過させる。可能な場合は、すぐに2.7のステップに進みます。必要性は、4℃で、店舗フィルタリングされたサンプルは、しかし、生存可能なファージ粒子の数を進める前に、一週間までのためである場合削減されます。
  7. 一定分量の複数の無菌技術を使用してバッフル培養フラスコを振っ滅菌個々の250ミリリットルにフィルター滅菌LB /土壌抽出液の50ミリリットル部分。異なるアースロファージが異なるのCaCl 2の条件で最適に成長するので、最終的な所望の濃度(0-50 mM)を滅菌2.0 M CaCl 2溶液を追加します。
    注:私達は私達によって識別アースロファージ大半が1 MM-2.5のCaCl 2の範囲内であることを見つける。しかし、単離されたファージのいくつかは非常に高いのCaCl 2濃度で0のCaCl 2 .ORで独占的に我々が成長した。 3.1すぐにステップ進んでください。

3.ファージの単離

  1. フラスコのそれぞれに1後半早い/指数関数定常期の細菌培養物を2.5ミリリットルに追加します。 0.5から0.7 OD 600のために、細胞の1ミリリットルを使用しています。 0.7のODよりも高いOD 600の場合の2.5ミリリットルを使用細胞。
    注:指数関数的増殖期の細胞は、通常より多くのファージは、固定相成長の細胞よりも高い力価が得られる。
  2. 振盪インキュベーター中で約24時間、30℃、250rpmで振盪フラスコ。
  3. 24時間のインキュベーション期間の後、振盪インキュベーターから濃縮フラスコを取り除き、濃縮サンプルをファージ緩衝液中で10倍に希釈する。
  4. 後半早い/指数関数定常期の細菌培養物0.5ミリリットルで培養管を設定し、培養管に集積培養の様々な量(PBで10 -1希釈液500μlに5μl)を追加します。
    注:これは、それぞれの土壌サンプルを濃縮した後に別のファージ力価を生成するので広範囲の濃度をテストすることをお勧めします。
  5. オリジナルの濃縮フラスコに存在する濃度に最終濃度が等しくなるように培養管に塩化カルシウム追加します。 W多くのファージを選択するために異なるのCaCl 2濃度の範囲を使用してくださいi番目のCaCl 2の依存関係を変化させる。
    注:ほとんどのファージは1〜2.5 mMとのCaCl 2の範囲内で分離されますが、0〜50のCaCl 2濃度からどこでも最も最適に分離されたファージがある。このためには、ユニークな孤立したアースロファージ数を最大化するのCaCl 2濃度の範囲を確認するのが最善です。
  6. 培養管にLBトップアガーの4.5ミリリットルを混合し、LB寒天プレート上に混合物を注ぐ。均等にプレート全体に分散し、約15分間固化するトップアガーを可能にするために穏やかに渦巻。
    注:トップ寒天は、より大きなバッチ(250ml)中で調製する​​ことができ、余分なトップ寒天を室温で保存し、少なくとも2週間、その後の実験のために再利用することができる。トップ寒天を作るために使用される様々な式がありますが、私たちは、LBと混合した寒天の7グラム/ Lを使用して寒天トップを作る実験の過程で液体状態を保持するための60°Cの水浴中でトップアガーを置く。
  7. 反転トン彼プレートと48時間に(温度30℃)でO / N所望の温度でインキュベートする。これらの条件が存在するファージのために最適化することが異なります。ほとんどの単離されたファージを、24時間のインキュベーション期間の後に1〜2.5のCaCl 2濃度で30℃でインキュベートしたプレートから来る。

4.ファージ精製

  1. プレート上のプラーク形成のための24時間のインキュベーションのチェックの後。全くプラークが明らかでない場合には最大72時間のインキュベーションを続行するか、追加のプラークが表示されますかどうかを判断する。週間まで4℃で前に進むのための推定プラークと、店のプレートを必要に応じて。
    注:それは一つのプレート上の異なるプラークの形態の多様を見つけることは珍しいことではありません。インキュベーションの3日後にプラークを見つけることは可能ですが、まれである。
  2. ストリークプラーク法を用いて明らかに単離されたプラークから、所望のファージを精製する。無菌木製の棒でプラークをタッチします。炎を通して木の棒を実行することにより、ストリークプラークを、allowin簡潔に冷却した後、 図1に示すように、穏やかな運動で寒天プレート上の棒をこすりするGスティック。各パスのためのクリーンスティックを使用してこれを繰り返します。
  3. また、個々のファージプラークを分離するために、伝統的なプラーク力価アッセイを使用しています。プラーク力価アッセイは、LB寒天LB上層寒天と、ファージプラークを単離するためのペトリ皿のような材料として、複数の試薬の使用を必要とする。我々は、ストリークプラーク法を用いて非常に成功しているが、それは、プラーク力価アッセイを用いて、個々のプラークを単離することが技術的に容易である。
  4. LB寒天プレートを少なくとも3回に画線すると、推定上のファージ粒子の最低濃度領域をマークし、GENTLY母板として塩化カルシウムの同じ濃度を含む( アルスロ 0.5mlの溶融LBトップアガー4.5mlの適用)、それは、プレート全体に均等に分散することができます。
  5. プレートO / Nを反転し、インキュベートする。ストリークプラークを繰り返します純粋なファージ種を確保するために、少なくとも3回の反復のための技術が単離される。ファージの生存率の有意な損失なしにすじの間で、必要に応じて週まで4℃で保存プレート。
  6. 一度希望するプラークが、最終的なストリークプレート上で増殖させ、単離されている、マイクロピペットの先端で1よく孤立したプラークをタッチし、100μlのPBで再サスペンド。シリアルに新鮮なPBの180μLにサンプルを20μlを渡すことで、10 -8希釈にこの10 0ソリューションを希釈する。
  7. CaCl 2を同じ濃度で含有する溶融LBトップアガー4.5 mlの感染細菌を混合して5〜10室温で分およびプレート培養チューブ中で増殖させたアルスロ 0.5mlの各希釈物10μlを追加するファージを単離するために使用元の土壌サンプルから。次の日まで4℃で行われたすべての希釈液を保存します。
  8. 伝統的なプラーク力価としてを使用してWebパターンを作るために必要なファージの連続希釈を決定します言う。プラーク力価アッセイの目的は、ウェブパターン板を得るために必要なファージ力価を決定することである。として主に細菌を欠いたが、まだのファージによって溶解されていない細菌の残骸を含むWebパターンプレートを識別します。無菌の50ミリリットル培養フラスコに後半早い/指数関数的に静止アルスロ文化 5ミリリットルを追加します。
    1. 培養フラスコ内( アースロ文化にウェブパターンを与えた)希釈液100μlを加え、ファージを室温で5から10分間細菌細胞に感染することができます。最初に10新鮮なLBプレート上にプレートし、ファージをこの混合物を5mlを識別するために使用されるのCaCl 2の同じ濃度を含む溶融LB上層寒天と混合する。固化し、30℃で反転したプレートをインキュベートすることを許可する。
  9. 次の日は、4℃または室温で4時間後にPBや店舗O / N 5mlのウェブパターンプレートをあふれさせる。
  10. 0.22μmのシリンジフィルターを通してファージ溶解物をフィルターそして4℃で保存する。ファージ粒子の電子顕微鏡像、標準的な手順を用いてDNAの制限酵素分析およびゲノム配列決定のためのファージゲノムDNAの分離のような追加の実験のために、この最後のファージストックを使用する。ファージストックの長期保存のため、-80℃でストック·アーカイブ用の小さなバイアルに無菌グリセロールにファージ溶解等量のを追加します。
    注:これらのファージ技術で経験していない人のために、偉大なリソースがオンラインでアクセスwww.phagesdb.orgサイトです。

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Representative Results

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アースロファージのための改善された濃縮技術の再現性を実証するために、30種類の土壌サンプルは、固有のアースロファージは、この濃縮を使用して採取した土壌サンプルの22から得られたこれらの30の土壌サンプルの2014年の春と夏の間、異なる時間と場所で使用した手順。標準濃縮手順は、同じ土壌試料の3からユニークなファージを得た。濃縮サンプルは、プラークまたはプラークの検出に成功のために濃縮されたアルスロの大きな体積を必要とする比較的低いファージ力価を分離するために最初の希釈を必要とする非常に高いファージ力価を持つことができます。私たちは、最初の濃縮およびLB寒天上にプレーします( 図2)の後に、純粋なファージ集団を単離するためにプラークストリークメソッドを使用します。あるいは、従来の標準的なプラーク力価アッセイは、この方法は多くの時間、試薬および材料を要するものの、純粋なファージ単離物を単離することができるS。前述のように、我々は実験的にプレート上ウェビングパターンを形成するファージ力価数およびプラーク形成単位(PFUで)の数を決定するために、プラーク力価アッセイを使用しない。 図3は、ファージバナナのための連続希釈のセットを示していると実証する良いウェブパターンがどのように見えるべきかのプレートの1。 図4は、20 アースロファージ電子顕微鏡画像を示している濃縮技術を用いて単離した。現在、孤立した25ファージの、それらの23はかなり長い尾を持つsiphovirusesです。単離されたファージの二つの長さは、尾と同様のヘッドの直径を含むmyovirusesある。

図1
個々のファージプラークを単離するために使用される図1ストリークプレート法の概略図。黄色の星をLBプレート上の領域を表すファージプラークストリーキングが終了した後上層寒天を加えた菌液を注意深くプレート上に注がれるべきである。

図2
図3つの異なる温度での1種のファージ(ディラン)のためのプラークの単離に使用ストリークプレート法の2例は、ディランはRT、30℃および37℃で類似のプラークを生成し、そのファージに注意。プレートの2の赤い円は、明らかに孤立したプラークを囲む。

図3
図3.プラーク価アッセイ。 アースロファージバナナはPBで希釈し、セクション議定テキストの4.6&4.7で説明したように寒天プレート上にプレートシリアルた。示されて(上から)T-8に連続希釈T-4である。その目に注意してください(下から上へ)E T-5希釈はまだ残っている細菌の芝生のちょうど少量のウェブパターンを与えた。 (T-1、T-3)の下側の連続希釈は、任意の細菌増殖の欠如によって実証ファージ粒子によって溶解した細菌の全てを透明プレートを作成した。

図4
図20 アースロファージ 4電子顕微鏡画像は、濃縮技術を用いて単離した。画像は、FEIモルガーニTEMを用いて撮影した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

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Discussion

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アルスロホストに感染することができるファージを単離するための多くの以前の試みにもかかわらず、私たちは、標準的な濃縮手順を使用してほとんど成功していた。環境サンプルからファージを豊かにするバンTwestとKropinski 10によって開発され、適合した細菌の濃縮の一般化された方法は、濃縮手順の大多数のための基礎のまま。以前の研究からの証拠は、ダイレクトプレーの方法は、分離5の非常に低い成功率ではあるがアースロバクターの菌株に検出可能なプラークを生産していることを示唆している。ダイレクトプレーティング法により、ファージをファージバッファに土壌試料から抽出し、雑菌を除去するために濾過される。ファージ粒子を含有する濾過抽出物は、宿主細胞の感染を可能にするために、所望の細菌宿主に添加し、細菌の増殖およびファージ増幅のさらなるラウンドなしでメッキされる。

当社の濃縮技術は堅牢でオペアンプですアースロバクター·エスピー KY3901からアースロファージ比較的容易な単離のためにtimized。従来の濃縮手順に、ファージは、土壌中に存在する細菌の多くの異なるタイプと一緒に、ファージバッファに土壌から抽出され、ファージ感染のための宿主として使用し、所望の細菌細胞を新鮮な増殖培地に添加した。濃縮方法で、すべての土壌細菌は、0.22μMフィルターを通して濾過することにより、ファージのサンプルを抽出した土壌から除去される。滅菌濾過し、溶解物を含有するファージ粒子ではなく、土壌細菌は、ファージ伝播宿主として用い、所望の細菌を2×LBブロスで希釈する。我々の濃縮手順などの主な違いは、濃縮、インキュベーション期間中に宿主細菌と成長のために競合するNOの汚染土壌細菌が存在しないことである。土壌がファージが感染することができ、抽出だけホストは、所望の宿主細菌、したがってmaximiのものである目的のホスト固有のファージの宿主細菌および増幅の成長の可能性をZES。

ここで説明する手順の開発では、 塩化カルシウム濃度が11の範囲をテストすることによって、任意の濃縮手順に固有の選択的なバイアスを考慮しようとしました。何が明らかになったことは、いくつかのファージ単離物は、カルシウムイオン濃度および温度などのパラメータに依存する生理学的な違いを示すことである。将来のアースロファージ単離のために我々は、pH、温度、塩分、栄養物、最適に様々な環境条件の下で、その宿主内で再生することが可能なファージを単離するための二価金属イオンなどの主要な要因をテストすることを計画。

我々は、この実験では新鮮に成長したアルスロセルを使用。私たちは困難目での既知のファージをまともな力価をファージを単離しまたはHAVINGを持っていたので、成長の遅固定相への途中に到達する細胞を使用していない成長期である。他の成長の後期静止期まで途中で細菌細胞を使用してファージを単離する成功の欠如を説明することができる固定相アクロセル 12におけるファージ感染の阻害を示した。私たちは、0.5から0.9のOD6 00からどこでも細胞密度を持つこれらの実験の成功使用しての文化を持っていた。増殖した培養物は4℃で保存され、最大7日間のファージ単離に使用することができる。しかし、より長いバクター細胞を4℃で感染性ファージ粒子の低い力価およびバーストサイズで保存されている。同様の結果がphageT4 13の感染のために大腸菌を用いて発見された。したがって、できるだけ早くそれらが所望の成長は土壌サンプルから新規なファージを得る機会を最大に達した後、細菌細胞を用いる。

大まかに言えば、LB培地でこの濃縮技術の使用はほとんどがないように証明する必要がありますアースロファージ分離への排他的。 LBはE.を培養するための業界標準であったがcoli株及び腸内細菌科の他のメンバーには、それは、好気的条件下14における多様な細菌の増殖を支持する。 LB培地の栄養豊富な組成物は、おそらくファージの検出を妨げることから技術的課題を防止する好気性細菌の非常に多様なグループでファージを増殖させるこの方法で使用することができる。

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Disclosures

著者は競合する経済的利益を宣言していない。

Acknowledgments

このプロトコルの開発のための資金は、高等教育のための南東ペンシルベニア州コンソーシアムとカブリーニカレッジ科学部によって提供されました。追加の資金と支援はアルカディア大学とImmaculata大学から来ました。我々は、特に親切に私たちの孤立したファージの電子顕微鏡画像を撮影するために、セントジョセフ大学で博士カレンSnetselaarに感謝。追加のサポートは、ゲノミクスと進化科学(SEA-のファージ)プログラムを推進ハワード·ヒューズ医学研究所の科学教育連盟ファージハンターによって提供された。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
LB Broth powder Fisher BP9722-2 It's best to order these in bulk.
Granulated Agar Fisher BP1423-2 It's best to order these in bulk.
0.22 um syringe filters Fisher 09-719A
0.22 um buchner filters Fisher 430320 More than 50 ml of liquid can be obtained by carefully swapping the receiving tube.
Eppendorf Tubes Fisher 05-408-129
5 ml pipets individual Fisher 13-678-11D
50 ml conical tubes Fisher 76002844
15 ml conical tubes Fisher 76002845
10 ml pipets individual Fisher 13-676-10J
25 ml pipets individual Fisher 13-676-10K
Whatman qualitative filter paper Fisher 1001-824

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References

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の単離のための最適化された濃縮技術<em&gt;アルスロ</em&gt;バクテリオファージ種土壌サンプルの分離株から
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Cite this Article

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).More

Cross, T., Schoff, C., Chudoff, D., Graves, L., Broomell, H., Terry, K., Farina, J., Correa, A., Shade, D., Dunbar, D. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (98), e52781, doi:10.3791/52781 (2015).

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